痹祺膠囊治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效研究及網(wǎng)絡(luò)機(jī)制預(yù)測

李 新 ，卜睿臻，王玉麗 ，李虎玲 ，韓彥琪 ，王 磊，張星艷 ，趙文靜 ，許 浚 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價(jià)與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

5.津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300193

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病[1]，以關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)壓痛和持續(xù)性滑膜炎為特征。研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞的激活、炎癥因子的大量釋放、氧化應(yīng)激等與RA 的發(fā)病息息相關(guān)，并且在這些活性物質(zhì)的作用下進(jìn)一步加快患者病情的進(jìn)展[2]。RA 沒有永久的治療方法，目前RA 的治療用藥主要依賴于非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，但內(nèi)科治療方法起效緩慢、久服對肝、腎及血液系統(tǒng)損害較大[3]。終末期RA 下只能采用外科的部分或全部關(guān)節(jié)置換等關(guān)節(jié)整形手術(shù)[4]，然而手術(shù)前的評估較為嚴(yán)苛，術(shù)后可能存在潛在的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，如感染、磨損、骨溶解等[5]。RA 在中醫(yī)中稱為“痹證”，中醫(yī)藥治療RA 在改善臨床癥狀、藥物不良反應(yīng)小等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。痹祺膠囊是由馬錢子、黨參、白術(shù)、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的作用，臨床上用于氣血不足、風(fēng)濕瘀阻、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、關(guān)節(jié)腫大、僵硬變形或肌肉萎縮、氣短乏力；風(fēng)濕、RA，腰肌勞損，軟組織損傷屬上述證候者[6-7]。痹祺膠囊在臨床上表現(xiàn)出較好的抗關(guān)節(jié)炎作用，研究發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊可通過抑制骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB 受體激活子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子-κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activators of transcription，STATs）信號通路降低大鼠滑膜增生，減輕關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞[8-9]。本研究采用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[10]研究痹祺膠囊在整體動物模型下對RA 大鼠的藥效作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠120 只，體質(zhì)量110～130 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)在天津天誠新藥評價(jià)有限公司實(shí)驗(yàn)動物屏障系統(tǒng)［合格證SYXK（津）2021-0008］，溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風(fēng)次數(shù)為10～15 次/h 全新風(fēng)，光照為12 h 明、12 h 暗。自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)動物的使用經(jīng)天津藥物研究院新藥評價(jià)有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號No.2021031803）。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（0.3 g/粒，批號311574）由天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供；醋酸潑尼松片（5 mg/片，批號21020162）購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司；雷公藤總苷片（10 mg/片，批號180502）購自上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；雞II 型膠原蛋白購自美國 Chondrex 公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒（批號P261453）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號P254162）購自美國R&D Systems 公司；大鼠IL-17 ELISA 試劑盒（批號2104251）購自上海西唐生物科技有限公司；大鼠IL-10 ELISA 試劑盒（批號22J225）購自ExCell Bio 公司；類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）檢測試劑盒（批號20210407）購自南京建成生物工程研究所；大鼠γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號B303835）購自Biolegend 公司。

1.3 儀器

YLS-7B 型足腫儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；SpectraMax M5 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；ASP200S 型自動真空組織脫水機(jī)；EG1150H 型自動生物組織包埋機(jī)、RM2255 型切片機(jī)（德國Leica公司）；Ci-L 型顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

2.1.1 配制II 型膠原混懸乳劑 取0.1 mol/L 冰醋酸溶液10 mL 與雞II 型膠原20 mg，于棕色試劑瓶內(nèi)，冰浴下充分混合均勻，直至白色絮狀雞II 型膠原完全溶于冰醋酸內(nèi)，并于實(shí)驗(yàn)前加入弗氏完全佐劑并充分乳化，使雞II 型膠原質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.1.2 CIA 大鼠模型制備 120 只SD 大鼠適應(yīng)期喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)取10 只作為對照組，其余所有大鼠均進(jìn)行II 型膠原蛋白造模。于左側(cè)足跎肉墊處皮內(nèi)注射雞II 型膠原蛋白（0.1 mL/只），注射后注射點(diǎn)按壓防液體外流。對照組大鼠以同樣方式注射等體積生理鹽水注射液。在第1 次注射免疫的第7 天，在背部注射相同乳劑0.1 mL 進(jìn)行加強(qiáng)免疫，密切觀察大鼠狀態(tài)至造模15 d 篩選雙側(cè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥腫脹的動物進(jìn)行分組。

2.1.3 給藥 選取造模成功大鼠重新標(biāo)記后用隨機(jī)數(shù)字法分為模型組、潑尼松（10 mg/kg）組、雷公藤總苷（10 mg/kg）組和痹祺膠囊各劑量（0.05、0.10、0.20、0.40 g/kg）組。各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1 次/d，連續(xù)15 d，期間給予SPF 級動物常規(guī)飼料及飲水。

2.2 指標(biāo)觀察及檢測

2.2.1 體質(zhì)量測定 給藥第1、3、5、8、10、12、15 天，用天平對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量，計(jì)算每組大鼠的平均體質(zhì)量。

2.2.2 足趾腫脹度測定 給藥第1、3、5、8、10、12、15 天，用足腫脹測定儀測量大鼠右后爪腫脹度。

2.2.3 關(guān)節(jié)炎評分 左后爪注射II 型膠原15 d 后，右后爪會形成繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎，監(jiān)測給藥第1、3、5、8、10、12、15 天的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分[11]。0 分代表正常足爪；1 分代表足趾紅腫；2 分代表足趾和足掌紅腫；3 分代表腫脹至踝關(guān)節(jié)以下；4 分代表整個(gè)足爪完全腫脹，不能彎曲。將每只大鼠的4 只足爪得分相加作為關(guān)節(jié)炎得分，每只大鼠最高得分為16 分。

2.2.4 血清RF 及炎癥因子檢測 末次給藥前禁食不禁水12 h 以上，于末次給藥結(jié)束1 h 后，大鼠以戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，從腹主動脈采血于采血管中，4 ℃、3000 r/min 離心10 min，分離得到血清樣品，按照試劑盒說明書分別檢測RF、IL-17、IL-10、TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平。

2.2.5 脾臟、胸腺指數(shù)測定 于末次給藥結(jié)束1 h腹主動脈采血后，分別收集各組脾臟與胸腺，稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)。

2.2.6 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測 取大鼠右爪踝關(guān)節(jié)部分，采用10%多聚甲醛溶液固定后，將組織經(jīng)甲酸甲醛脫鈣液處理后，采用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，依次經(jīng)蘇木素和伊紅染色，封片后鏡下觀察并比較各組踝關(guān)節(jié)滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)腔浸出、關(guān)節(jié)軟骨破壞、纖維化等情況。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 目標(biāo)化合物的選取 結(jié)合本課題組前期化學(xué)物質(zhì)組及血中移行成分選取痹祺膠囊中39 個(gè)化合物為研究對象，詳細(xì)信息見表1。

表1 痹祺膠囊目標(biāo)化合物Table 1 Candidate active compounds in Biqi Capsule

2.3.2 靶標(biāo)蛋白選取 通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、CTD 數(shù)據(jù)庫（https://ctdbase.org）和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）檢索得到目標(biāo)化合物相關(guān)靶標(biāo)蛋白，通過 OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNet 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/home/）和GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）檢索得到RA 相關(guān)靶點(diǎn)，并借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）校正其靶標(biāo)蛋白為官方名。

2.3.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn) 將化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交互，將整合的交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING10 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）中，物種限定為“Homo sapiens”，閾值限定為0.900，獲得蛋白間相互作用關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，通過Cytoscape 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，以度值大于2 倍中位數(shù)篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

2.3.4 通路分析及生物信息學(xué)分析 運(yùn)用Omicsbean 軟件對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究靶點(diǎn)蛋白在細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及生物過程（biological process，BP）方面的作用機(jī)制。然后，通過STRING10 數(shù)據(jù)庫得到與靶點(diǎn)相關(guān)的通路過程，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）分析并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對得到的通路進(jìn)行深入分析。

2.3.5 “藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)上述痹祺膠囊39 個(gè)化學(xué)成分的靶點(diǎn)及通路預(yù)測結(jié)果，在Excel 表格中建立藥材-化合物、化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路、靶點(diǎn)-疾病的相互對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用其插件Network Analyzer 計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的特征。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)表示化合物、靶點(diǎn)以及作用通路、藥理作用、功效。邊表示藥材-化合物、化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路以及靶點(diǎn)-疾病相互作用。經(jīng)處理后，得到39 個(gè)成分的相關(guān)靶點(diǎn)、通路預(yù)測圖，以該圖來表示痹祺膠囊“藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”間的相互關(guān)系。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 痹祺膠囊對CIA 大鼠體質(zhì)量、足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分的影響

如圖1 所示，15 d 的II 型膠原造模后，大鼠體質(zhì)量減輕，足趾相繼出現(xiàn)紅腫，關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)畸形，導(dǎo)致行走艱難，嚴(yán)重的甚至?xí)适Щ顒幽芰?，說明成功建立了CIA 大鼠模型。連續(xù)給藥過程中監(jiān)測大鼠的體質(zhì)量、足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎評分，結(jié)果顯示隨著給藥時(shí)間的延長，痹祺膠囊（0.20、0.40 g/kg）組可改善關(guān)節(jié)炎大鼠的體質(zhì)量。在給藥5 d 時(shí)，痹祺膠囊（0.40 g/kg）組顯著降低大鼠的足趾腫脹度（P＜0.05），給藥8～15 d 后痹祺膠囊各給藥組均顯著降低足趾腫脹度（P＜0.01）。在給藥5 d 時(shí)，痹祺膠囊（0.40 g/kg）組明顯降低關(guān)節(jié)炎評分（P＜0.05），隨著給藥時(shí)間的延長，至給藥12 d 時(shí)痹祺膠囊（0.10、0.20、0.40 g/kg）組均可顯著降低CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎評分（P＜0.05、0.01）。綜上說明，痹祺膠囊可改善關(guān)節(jié)炎大鼠狀態(tài)，具有明顯的抗炎作用，表現(xiàn)在改善足趾腫脹度、降低關(guān)節(jié)炎評分方面。

圖1 痹祺膠囊對CIA 大鼠體質(zhì)量、足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分的影響 (±s , n = 10)Fig.1 Effect of Biqi Capsule on body weight, foot swelling and arthritis score in CIA rats (±s , n = 10)

3.2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響

細(xì)胞因子在RA 炎癥與關(guān)節(jié)損傷中扮演著重要的角色。如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中RF、IL-17、IFN-γ、TNF-α 和IL-1β 水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，痹祺膠囊各劑量組大鼠血清中RF、IFN-γ、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01、0.001），痹祺膠囊（0.10、0.20、0.40 g/kg）組血清中IL-17 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），且呈劑量相關(guān)性。IL-10 具有較強(qiáng)的抗炎作用，提高IL-10 含量有利于抑制體內(nèi)炎性因子的釋放和清除。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-10 水平呈下降趨勢；與模型組比較，痹祺膠囊可上調(diào)大鼠血清中IL-10 水平。

表2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響 (±s , n = 6)Table 2 Effect of Biqi Capsule on levels of RF and inflammatory factors in serum of CIA rats (±s , n = 6)

表2 痹祺膠囊對CIA 大鼠血清RF 及炎性因子水平的影響 (±s , n = 6)Table 2 Effect of Biqi Capsule on levels of RF and inflammatory factors in serum of CIA rats (±s , n = 6)

與對照組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001&P < 0.05 &&P < 0.01 &&&P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group

組別 劑量/(g·kg?1) RF/(IU·mL?1) IL-17/(pg·mL?1) IFN-γ/(pg·mL?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-1β/(pg·mL?1)IL-10/(pg·mL?1)對照 — 140.87±3.64 61.13±8.41 8.50±0.67 5.81±0.31 18.70±2.47 27.03±10.04模型 — 180.23±4.83&&& 94.67±8.95& 47.95±15.21&& 11.56±2.08&&& 39.60±6.21&&& 15.01±3.92潑尼松 0.01 146.07±3.15*** 64.81±5.15* 13.40±2.14** 6.06±0.36*** 21.25±2.41** 26.74±3.86雷公藤總苷 0.01 164.93±2.48* 52.96±7.47** 9.67±0.43** 6.62±0.47** 16.27±2.35*** 18.42±5.13痹祺膠囊 0.05 162.30±2.80** 69.90±12.03 13.80±2.55** 6.59±0.66** 21.02±3.32** 15.13±2.53 0.10 153.87±4.92** 58.80±11.55*** 17.38±7.16* 6.26±0.37** 17.38±1.82*** 21.64±8.13 0.20 148.43±5.42** 46.99±5.24* 12.16±1.20** 5.37±0.18*** 22.25±3.25** 22.41±10.01 0.40 136.33±5.84*** 52.05±8.23*** 8.99±0.95** 5.99±0.39*** 20.87±1.20** 23.39±8.88

3.3 痹祺膠囊對CIA 大鼠脾臟及胸腺指數(shù)的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組大鼠胸腺及脾臟指數(shù)均明顯增大（P＜0.01、0.001），提示在關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)下胸腺和脾臟出現(xiàn)腫大；經(jīng)15 d 連續(xù)給藥后，痹祺膠囊各給藥組均表現(xiàn)出降低脾臟指數(shù)的作用，在降低胸腺指數(shù)上顯示出劑量相關(guān)性，其中0.20、0.40 g/kg 劑量組具有顯著性差異（P＜0.05、0.01），表明痹祺膠囊對于CIA 導(dǎo)致的脾臟和胸腺損傷有著一定的改善作用。

圖2 痹祺膠囊對CIA 大鼠臟器指數(shù)的影響 (±s , n = 8)Fig.2 Effect of Biqi Capsule on organ index in CIA rats (±s , n = 8)

3.4 痹祺膠囊對CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響

如圖3 所示，對照組大鼠踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)基本正常，關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無滲出，滑膜細(xì)胞及結(jié)締組織未見增生；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨被破壞，軟骨細(xì)胞或大量增生或壞死，局部可見壞死組織碎片，可見大量滑膜結(jié)締組織增生，侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及骨，并伴大量炎性細(xì)胞浸潤；痹祺膠囊給藥組對CIA大鼠的治療作用呈劑量相關(guān)性，表現(xiàn)在減輕關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)腔內(nèi)壞死組織減少、軟骨細(xì)胞增生或壞死減少、滑膜結(jié)締組織增生減少、炎性細(xì)胞浸潤情況顯著降低。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理觀察結(jié)果 (HE, ×100)Fig.3 Pathological observation of ankle joint of rats in each group (HE, × 100)

3.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫、CTD 數(shù)據(jù)庫和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫等預(yù)測和檢索得到39 個(gè)化合物的627 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。從OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、DisGeNet 數(shù)據(jù)庫和GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到RA疾病靶點(diǎn)3368 個(gè)，將化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到交集371 個(gè)共同靶點(diǎn)（圖4-A、B）。

圖4 痹祺膠囊治療RA 的靶點(diǎn)分析Fig.4 Targets analysis of Biqi Capsule in treatment of RA

將371 個(gè)共同靶點(diǎn)投放至STRING 10 數(shù)據(jù)庫中獲得PPI，然后利用Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4-C）顯示，IL-6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、白蛋白（serum albumin，ALB、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、TNF、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、STAT3、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MAPK8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）、趨化因子配體8（chemokine ligand 8，CXCL8）、JUN、MAPK1 等靶點(diǎn)蛋白擁有較多相互作用關(guān)系，位于PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)中心，這些蛋白涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、活血、鎮(zhèn)痛、滑膜增生等方面，提示痹祺膠囊抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用與這些蛋白有關(guān)。進(jìn)一步了解PPI 網(wǎng)絡(luò)的生物作用，使用Cytoscape 的MCODE 插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Cluster 模塊分析，共獲得2 個(gè)Cluster 模塊（圖4-C）。對2 個(gè)模塊分別進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)Cluster 1主要與免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凝血級聯(lián)、血小板激活等生物過程有關(guān)；Cluster 2 主要與血管生成、中樞及外周疼痛、血小板激活等生物過程相關(guān)。

利用OmicsBean 分析軟件對相關(guān)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行功能注釋分析，選取P值最小的前10 個(gè)進(jìn)行作圖呈現(xiàn)（圖4-D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白在CC 方面主要參與細(xì)胞囊泡、細(xì)胞器內(nèi)腔形成、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)等過程；在MF 方面主要參與蛋白結(jié)合綁定、受體結(jié)合、酶結(jié)合、細(xì)胞功能調(diào)控等過程；在BP 方面主要涉及有機(jī)物或含氧化合物的應(yīng)激反應(yīng)、對化學(xué)刺激的細(xì)胞應(yīng)答、對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)等過程。

在STRING 10 數(shù)據(jù)庫中得到229 條相關(guān)通路，取false discovery rate＜0.01 的通路并篩出無關(guān)的通路后共146 條，隨后對這146 條通路進(jìn)行KEGG 通路分析及相關(guān)文獻(xiàn)查閱，得到80 條相關(guān)信號通路，并對前20 的通路進(jìn)行可視化處理（圖4-E），分析富集的通路發(fā)現(xiàn)，主要涉及與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路，如IL-17 信號通路、TNF-α 信號通路、NOD 樣受體信號通路等；與免疫應(yīng)答相關(guān)的通路，如T 細(xì)胞受體信號通路、輔助性T 細(xì)胞1（helper T cell，Th1）和Th2 細(xì)胞分化等；與凋亡相關(guān)的通路，如FoxO信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt 信號通路等；與活血相關(guān)的通路，如血小板活化、黏著斑、VEGF 信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)等；與疼痛相關(guān)的信號通路，如瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、Wnt 信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸等。

根據(jù)對應(yīng)關(guān)系在Cytoscape 3.6.0 軟件中，構(gòu)建痹祺膠囊“藥材-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，黃色代表藥材，綠色代表化合物，紫色代表靶點(diǎn)，藍(lán)色代表通路，紅色代表疾病（圖5）。采用軟件的插件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)平均度值為11.4，其中大于度值中位數(shù)的化合物有13 個(gè)，分別為三七皂苷R1、丹參酮IIA、異甘草素、咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸、人參皂苷Rg1、丹參酮I、丹酚酸B、士的寧、隱丹參酮等；靶點(diǎn)有58 個(gè)，主要有MAPK1、MAPK3、AKT1、磷脂酰肌醇3 激酶調(diào)節(jié)亞基（ phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha，PIK3R1）、MAPK8、MAPK10、TNF、JUN、IL1B、核因子-κB抑制劑α（nuclear factor-κB inhibitor α，NFKBIA）、糖原合成酶激酶3β（glycose sythase kinase 3β，GSK3B）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、EGFR、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等；通路有54 個(gè)，主要有TNF 信號通路、IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NOD 樣受體信號通路、Th17 細(xì)胞分化、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等。網(wǎng)絡(luò)中既存在1 個(gè)分子與多個(gè)靶點(diǎn)蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同1個(gè)靶點(diǎn)蛋白的現(xiàn)象，顯示出痹祺膠囊治療RA 具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，而多靶點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)在于痹祺膠囊中含有的特征成分，可能通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成等多種途徑發(fā)揮治療RA 作用。

4 討論

RA 作為一種慢性自身免疫性疾病，全世界約有1%～2%的人口受困于RA，選擇理想的動物模型對于評價(jià)藥效至關(guān)重要，CIA 動物模型始于1977年，此動物模型在臨床表現(xiàn)和病理機(jī)制上與人RA在臨床表現(xiàn)、病理、免疫上十分相似，是研究RA 機(jī)制和治療較為理想的動物模型，本研究采用II 型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型，在體征上表現(xiàn)出多關(guān)節(jié)腫脹等現(xiàn)象，病理上表現(xiàn)出明顯的大量炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生和軟骨破壞等，而痹祺膠囊可明顯改善RA大鼠足趾腫脹并降低關(guān)節(jié)炎評分。從HE 染色結(jié)果可見痹祺膠囊可顯著改善CIA 大鼠的關(guān)節(jié)損傷，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞減輕，關(guān)節(jié)腔內(nèi)壞死組織減少，軟骨細(xì)胞增生或壞死減少，滑膜結(jié)締組織增生減少，炎性細(xì)胞浸潤情況也顯著降低。

RA 病理生理學(xué)較為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為始于血液中的免疫復(fù)合物，即關(guān)節(jié)前階段，在這個(gè)階段會產(chǎn)生針對自身組織成分的自身抗體，同時(shí)與自體抗原進(jìn)入關(guān)節(jié)，此為過渡階段?？贵w抗原結(jié)合至前哨細(xì)胞上的Fc 受體γ，先天免疫反應(yīng)被激活，T 細(xì)胞被分化和增殖為Th 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），Th 細(xì)胞通過漿細(xì)胞激活B 細(xì)胞產(chǎn)生RF 等抗體，從而通過不同途徑破壞骨、軟骨和滑膜[4]。本研究表明RA 大鼠血清中RF 水平顯著增加，而痹祺膠囊呈劑量相關(guān)性降低血清中RF水平，表明痹祺膠囊可以延緩因RF 的大量產(chǎn)生導(dǎo)致對骨、軟骨和滑膜的損傷。

RA 特征主要是炎癥細(xì)胞向滑膜關(guān)節(jié)浸潤增多，最終導(dǎo)致軟骨和骨骼損傷，而滑膜巨噬細(xì)胞與RA 嚴(yán)重程度密切相關(guān)?；罨木奘杉?xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如IFN-γ、TNF-α 等推動RA的進(jìn)展[12]。巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的激活依賴遷移至關(guān)節(jié)中活化的T 細(xì)胞，其中Th1 和Th17 細(xì)胞亞群是炎癥滑膜組織中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類型。Th1細(xì)胞在滑膜關(guān)節(jié)中促進(jìn)促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 等釋放，繼而誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞活化，分泌IL-17 促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致關(guān)節(jié)病變[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊在臨床實(shí)踐和動物實(shí)驗(yàn)（佐劑型關(guān)節(jié)炎及CIA等）中可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群Th/Ts 之間的平衡，下調(diào)IL-1 和TNF-α 水平，顯示抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等藥效作用[15]。本研究表明，痹祺膠囊可顯著降低CIA大鼠血清中IL-17、TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平。Treg 通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-35 等細(xì)胞因子參與免疫負(fù)性調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 可通過多種途徑參與免疫負(fù)性調(diào)節(jié)，如抑制T 細(xì)胞向Th 細(xì)胞轉(zhuǎn)化并抑制Th 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，另外IL-10 可抑制B 細(xì)胞活化，抑制骨化三醇介導(dǎo)的免疫球蛋白 E（immunoglobulin E，IgE）表達(dá)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者Treg 細(xì)胞百分比及其生成IL-10 的含量較正常人低[17-18]。本研究表明，痹祺膠囊可升高IL-10 的水平，綜合以上結(jié)果提示痹祺膠囊顯示出較好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

RA 中因特異性自身抗原的持續(xù)存在，持續(xù)的免疫細(xì)胞激活導(dǎo)致關(guān)節(jié)中一種自我永存的慢性炎癥狀態(tài)和滑膜腫脹，被識別為疼痛和關(guān)節(jié)腫脹[19]。研究發(fā)現(xiàn)，滑膜成纖維細(xì)胞（ fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）產(chǎn)生TNF-α，通過p38/JNK MAPK 通路造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，而ROS 經(jīng)NF-κB 反饋形成ROS/TNFα 正反饋，促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞，傷害感受器致敏[20]。同時(shí)在TNF-α、IL-17 等細(xì)胞因子的存在下，NF-κB 信號通路、JAK-STAT 信號通路的激活可導(dǎo)致T 細(xì)胞活化，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)RA-FLS 異常增殖，激發(fā)破骨細(xì)胞分泌RANKL，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的增殖與活化，導(dǎo)致關(guān)節(jié)的畸形與骨侵蝕[21]，而此過程可被Wnt 信號通路阻斷[22]。此外，IL-17A 還可促進(jìn)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生MMP1，導(dǎo)致軟骨破壞，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMPs，促進(jìn)FLS 產(chǎn)生VEGF、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）[23]，從而促進(jìn)滑膜組織內(nèi)血管增生，滑膜不規(guī)則增厚，并伸向關(guān)節(jié)腔和軟骨邊緣部擴(kuò)展導(dǎo)致血管翳形成[24]。此外，RA 患者中，在各種細(xì)胞活化和凋亡過程中釋放的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）水平升高，可能與體內(nèi)凝血激活有關(guān)[25]。血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）是目前最強(qiáng)的脂質(zhì)介質(zhì)，又是強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)，PAF 在RA 中與滑膜炎、組織破壞及血管新生密切相關(guān)，并且能夠誘導(dǎo)血小板聚集，與RA 患者存在血液學(xué)異常關(guān)系密切[26]。而抑制纖凝、促進(jìn)纖溶，糾正RA 凝血異常，能阻止滑膜炎癥的進(jìn)展，進(jìn)而阻止骨質(zhì)破壞[27]。

本研究的靶點(diǎn)預(yù)測及作用通路分析結(jié)果提示，痹祺膠囊中黨參炔苷、黨參苷I、黨參苷II、土莫酸、茯苓素、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II 等成分可作用于IL-10、IL-4、IL-2、酪氨酸受體激酶Lck（tyrosine-protein kinase Lck，LCK）、熱休克蛋白A5（heat shock protein A5，HSPA5）、MAPK1、MAPK9、MAPK14、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓性分化原發(fā)反應(yīng)蛋白88（myeloid differentiation primary response protein MyD88，MYD88）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、CASP3、骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）等靶點(diǎn)，通過Toll 樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Wnt 信號通路、MAPK 信號通路等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、成骨/破骨細(xì)胞平衡等的作用；咖啡酸、迷迭香酸、丹參酮I、丹參酮IIA、三七皂苷R1、異甘草素、奎寧酸、蒼術(shù)酮、丹參新酮、三七皂苷CK 等作用于神經(jīng)源性位點(diǎn)Notch 同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N1）、凝血酶（thrombin，F(xiàn)2）、連接黏附分子A（Junctional adhesion molecule A，F(xiàn)11R）、VEGFA、NOS3、ALB、細(xì)胞間黏附分子1（Intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）等靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)JAK-STAT、Ca2+、VEGF通路、Ras 通路、FoxO 通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路等信號通路過程，抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、降解纖維蛋白、抑制血小板聚集，維持血液滲透壓，抑制血栓形成和血管翳形成；士的寧、馬錢子堿、番木鱉苷酸、咖啡酸、奎寧酸、甘草苷、異甘草素、甘草次酸、迷迭香酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、黨參苷II、丹參酮IIA、人參皂苷Rg1等作用于PTGS2、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）、TNF、IL1B、CXCL8、NOS2、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1）、μ-阿片受體δ1（Delta-type opioid receptor，OPRD1）、OPRM1 等蛋白靶點(diǎn)，通過NF-κB 信號通路、花生四烯酸代謝、C 型凝集素受體信號通路、5-羥色胺突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）-蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）信號通路等通路，抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附及TNF-α、IL-1β 等炎癥因子釋放和前列腺素的生成以及拮抗前列腺素受體、外周痛覺神經(jīng)元的刺激或抑制中樞神經(jīng)興奮和5-羥色胺釋放等發(fā)揮外周和中樞鎮(zhèn)痛作用。

痹祺膠囊由馬錢子、黨參、白術(shù)、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味藥材組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黨參多糖可通過影響TLR4 信號通路激活CD4+T 細(xì)胞，觸發(fā)Th2 轉(zhuǎn)化為Th1[28]，從而維持Th1/Th2 細(xì)胞、Tregs/Th17、IL-10/TNF-α及IL-10/IL-1β 的免疫穩(wěn)態(tài)[29]。黨參醇提物可促進(jìn)造血干（祖）細(xì)胞CD34+、CD3+、CD19+及CD71+分子的表達(dá)，抑制CD45+、CD14+分子的表達(dá)，使其處于分化早期階段，維持造血干（祖）細(xì)胞的干性，其物質(zhì)基礎(chǔ)主要為黨參炔苷和黨參苷I[30]。丹參中丹參酮IIA、丹參素和丹酚酸A 可通過抑制血小板蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶ERp57 和整合素αIIbβ3 的相互作用，降低凝血因子7 的活性，增加血小板中環(huán)磷酸腺苷的含量，降低血液黏度，還可激活纖溶酶原-纖溶酶系統(tǒng)，促使纖維蛋白溶解，但同時(shí)保持血細(xì)胞正常狀態(tài)等途徑發(fā)揮活血化瘀作用[31-33]。三七中皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1等通過增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的磷酸化，激活PI3K/Akt/eNOS途徑增加內(nèi)源性一氧化氮的釋放，發(fā)揮血管舒張作用[34-35]。地龍中蚓激酶、纖溶酶類成分可直接降解纖維蛋白原與纖維蛋白，活化纖溶酶原、促進(jìn)組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogenactivator，t-PA）等纖溶激活因子的釋放，抑制凝血途徑，促進(jìn)凝血因子的水解，防止血小板發(fā)生聚集[36]。馬錢子堿能抑制外周炎癥組織前列腺素E2、5-羥色胺、6-酮-前列腺素Fla 與血栓烷素等炎癥介質(zhì)的釋放，并可降低感覺神經(jīng)末梢對痛覺敏感性，并通過抑制鈣激活鉀離子通道抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，增加腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)-腦啡肽含量發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用[37-39]。

綜上，本研究通過CIA 動物模型及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段綜合分析了痹祺膠囊的藥效作用和可能的作用機(jī)制，表明痹祺膠囊可能通過多種與免疫調(diào)控、血管生成、骨形成/侵蝕平衡、凝血、鎮(zhèn)痛等相關(guān)通路調(diào)控相關(guān)活性物質(zhì)達(dá)到治療RA 的效果，并為進(jìn)一步確定痹祺膠囊中的活性成分、具體作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，然而本研究并未對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出的靶點(diǎn)及通路進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，具體單體組分的作用機(jī)理和靶效應(yīng)也需進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突