基于ERK 信號通路研究補陽還五湯促糖尿病足潰瘍愈合的作用機制

賀倩倩 楊曉紅 曹 毅

糖尿病足潰瘍是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，目前治療主要有局部清創(chuàng)、高壓氧、封閉負壓引流、血管介入等，但均存在相應(yīng)的禁忌證，且療程較長，人均治療費用高昂[1]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是細胞信號傳遞的關(guān)鍵，在創(chuàng)面愈合、炎癥反應(yīng)等過程中扮演了重要的角色。在潰瘍愈合過程中，角質(zhì)形成細胞參與了損傷修復(fù)的過程[2]。HaCaT 細胞由角質(zhì)形成細胞培育而來，在細胞實驗中常被用于模擬人角質(zhì)形成細胞。研究表明，ERK 信號途徑對HaCaT 細胞的增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用[3]。臨床已證實補陽還五湯可通過改善血循、抑制血栓形成、改善周圍神經(jīng)病變、控制血糖等有效促進糖尿病足潰瘍的愈合[4-6]。本實驗觀察補陽還五湯對HaCaT 細胞生物學(xué)行為的影響以及p-ERK1/2 表達水平的變化，探討補陽還五湯修復(fù)表皮的可能機制。

1 實驗材料

1.1 細 胞 HaCaT 細胞株購于中國科學(xué)院昆明細胞庫（批號CX0027）。

1.2 實驗試劑 補陽還五湯：生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁（江陰天江藥業(yè)有限公司，劑型為顆粒劑）、ERK 抑制劑U0126（上海生工生物工程公司，批號9903S）、1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)液（Hyclone公司，批號SH30809.01B）、胎牛血清（北京利維寧生物科技有限公司，批號11011-8611）、0.25%胰酶（吉諾科技公司，批號CM00231）、CCK-8（上海生工生物工程公司，批號E606335）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（美國Amersham 公司，批號PVDF022）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma 公司，批號BCA1-1KT）、增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑盒（美國Amersham 公司，批號28990608）、兔抗人多克隆p-ERK1/2 抗體（美國Cell Signaling 公司，批號9101）、兔抗人多克隆ERK 抗體（美國Cell Signaling公司，批號9102）、生物素標記數(shù)二抗（山羊抗兔IgG）（美國Cell Signaling 公司，批號7074）。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（上凈凈化，型號BSC-1000/1600IIA2 -1），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Forma 公司，型號Forma 700），倒置顯微鏡（重慶重光實驗有限公司，型號COIC-XJP-6A），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek，型號ELx808IU），電泳儀及電泳槽（美國BIO-RAD 公司，型號PowerPac Basic），凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司，型號ChemiDoc XRS+）。

2 實驗方法

2.1 藥物配制和貯存 補陽還五湯：由生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，地龍、川芎、紅花、桃仁各3 g 組成，將全方藥物放入鍋中，經(jīng)水浴充分溶解，轉(zhuǎn)速3000 r/min、直徑20 mm，離心15 min，離心2 次，取上清，無菌過濾，濃縮至50 mg/mL；同樣方法分別配置5、10、15、25 mg/mL 補陽還五湯，-20 ℃保存。ERK抑制劑（U0126）：用1640 培養(yǎng)基稀釋至10 mmol/L，-20 ℃保存。

2.2 HaCaT 細胞的培養(yǎng)及傳代 HaCaT 細胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱。待細胞融合約瓶底85%～95%狀態(tài)時，用胰酶消化，以1∶3 的比例接種到培養(yǎng)瓶中。

2.3 CCK-8 法

2.3.1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖的影響 （1）待細胞長滿96 孔板板底約50%時，移出培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2 次；（2）每孔加入200 μL 含有不同濃度補陽還五湯（0、5、10、15、25、50 mg/mL）的1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h；（3）每孔加入20 μL CCK-8 溶液和180 μL 1640 培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中30 min；（4）置于分光光密度儀450 nm讀取吸光度值。

2.3.2 補陽還五湯對ERK 抑制劑（U0126）作用下HaCaT 細胞增殖的影響 （1）同“2.3.1”的（1）；（2）本實驗設(shè)四組：空白組、補陽還五湯組、ERK 抑制劑組、ERK 抑制劑聯(lián)合補陽還五湯作用組（聯(lián)合組），根據(jù)實驗設(shè)組，分別加入200 μL 用1640 培養(yǎng)基稀釋的25 mg/mL 補陽還五湯和25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126），繼續(xù)孵育24 h；（3）后續(xù)操作同“2.3.1”中的（3）、（4）。

2.4 Western blot 法

2.4.1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞ERK1/2蛋白表達的影響 設(shè)立0、5、15、25 mg/mL 補陽還五湯組。收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌3次，裂解細胞，離心后收集蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度。根據(jù)所測蛋白濃度，計算40 μg 溶液蛋白的體積為上樣量。將40 μg 樣品蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，4 ℃過夜孵育一抗（1∶1000）。一抗反應(yīng)結(jié)束后，用1×TBST 在搖床上室溫洗3 次，每次10 min；室溫孵育二抗2 h（1∶1000），最后用ECL 試劑盒顯影拍照。

2.4.2 25 mg/mL 補陽還五湯對ERK 抑制劑（U0126）作用下HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白表達的影響 設(shè)立空白組、ERK 抑制劑組、補陽還五湯組、ERK 抑制劑聯(lián)合補陽還五湯組（聯(lián)合組），余步驟同“2.4.1”。

2.5 細胞劃痕實驗 設(shè)立空白組和25 mg/mL 補陽還五湯組，根據(jù)分組，在6 孔板中加入約5×105個細胞，24 h 后換無血清培養(yǎng)基，用10 μL 槍頭均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS 洗滌2 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，拍照（0 h），然后放入37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中，每12 h 測量1 次細胞運動的距離，計算遷移率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示，上述所有實驗均重復(fù)3 次以上，采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 CCK-8 法檢測不同濃度補陽還五湯對HaCaT細胞增殖的影響 與空白組比較，補陽還五湯濃度依賴性促進HaCaT 細胞增殖（P＜0.05 或P＜0.01），在25 mg/mL 時促增殖效應(yīng)最佳。見表1。

表1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖影響的比較（±s）

表1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞增殖影響的比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；與空白組（0 mg/mL）比較，aP＜0.05，bP＜0.01

補陽還五湯濃度（mg/mL）孔數(shù)051 0 15 25 50 666666吸光度值1.0514±0.080 1.1704±0.076a 1.2642±0.078b 1.3845±0.060b 1.6996±0.080b 1.7211±0.088b

3.2 Western blot 法檢測不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白表達的影響 與空白組比較，補陽還五湯呈濃度依賴性促進HaCaT 細胞p-ERK1/2 蛋白的表達（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響

表2 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

表2 不同濃度補陽還五湯對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK1/2 為細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2；p-ERK1/2 為磷酸化ERK1/2；與空白組（0 mg/mL）比較，aP＜0.01；與5 mg/mL 補陽還五湯濃度組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與15 mg/mL 補陽還五湯濃度組比較，dP＜0.01

補陽還五湯濃度（mg/mL）實驗次數(shù)051 5 25 3333 p-ERK1/2/ERK1/2 0.260±0.092 0.545±0.005a 1.038±0.126ab 2.414±0.456acd

3.3 劃痕實驗檢測25 mg/mL 補陽還五湯對HaCaT細胞遷移的影響 與空白組比較，25 mg/mL 補陽還五湯有效促進HaCaT 細胞遷移（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 HaCaT 細胞劃痕遷移結(jié)果比較（±s）

表3 HaCaT 細胞劃痕遷移結(jié)果比較（±s）

注：HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；空白組給予0 mg/mL 補陽還五湯；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別空白組補陽還五湯組實驗次數(shù)平均遷移率33 12 h 0.43±0.02 0.55±0.06a 24 h 0.58±0.06 0.84±0.06b

3.4 CCK-8 法檢測補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響 與ERK 抑制劑組比較，25 mg/mL 補陽還五湯能明顯促進ERK 抑制劑作用下的HaCaT 細胞的增殖（P＜0.01）。見表4。

表4 補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響（±s）

表4 補陽還五湯對ERK 抑制劑作用下HaCaT 細胞增殖的影響（±s）

注：空白組不加補陽還五湯及ERK 抑制劑（U0126）；ERK 抑制劑組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；聯(lián)合組給予25μmol/L ERK 抑制劑（U0126）和25 mg/mL 補陽還五湯；HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK 抑制劑為細胞外調(diào)節(jié)激酶抑制劑；與空白組比較，aP＜0.01；與ERK 抑制劑組比較，bP＜0.01

組別空白組ERK 抑制劑組補陽還五湯組聯(lián)合組孔數(shù)6666吸光度值1.2629±0.126 1.0474±0.056a 1.6237±0.200a 1.3167±0.088b

3.5 Western blot 法檢測25 mg/mL 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響與空白組相比，25 mg/mL 補陽還五湯可以促進p-ERK1/2 蛋白的表達，同時促進ERK 抑制劑（U0126）作用下p-ERK1/2 蛋白的表達（P＜0.01）。見圖2、表5。

圖2 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2 表達的影響

表5 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

表5 補陽還五湯和ERK 抑制劑對HaCaT 細胞p-ERK1/2表達量的比較（±s）

注：空白組不加補陽還五湯及ERK 抑制劑（U0126）；ERK 抑制劑組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）；補陽還五湯組給予25 mg/mL 補陽還五湯；聯(lián)合組給予25 μmol/L ERK 抑制劑（U0126）和25 mg/mL 補陽還五湯；HaCaT 細胞為人永生化表皮細胞；ERK1/2 為細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2；p-ERK1/2 為磷酸化ERK1/2；與空白組比較，aP＜0.01；與ERK抑制劑（U0126）組比較，bP＜0.01；與補陽還五湯組比較，cP＜0.01

組別空白組ERK 抑制劑組補陽還五湯組聯(lián)合組實驗次數(shù)3333 p-ERK1/2/ERK1/2 0.900±0.127 0.356±0.108a 1.677±0.319ab 0.855±0.008bc

4 討 論

糖尿病足潰瘍的修復(fù)是個復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要依靠角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞及相應(yīng)的細胞因子互相作用，完成損傷部位的再上皮化。角質(zhì)形成細胞在這個過程中發(fā)揮了重要作用，它通過大量增殖、遷移等生物學(xué)行為修復(fù)、覆蓋創(chuàng)面，主導(dǎo)創(chuàng)面的再上皮化過程，同時，分泌各種細胞因子和生長因子，共同調(diào)控并促進創(chuàng)面愈合的過程[7-8]。研究顯示，再上皮化過程可通過激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)解蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路在體外調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞遷移[9]。ERK 信號通路是細胞信號傳遞的關(guān)鍵，激活后介導(dǎo)細胞因子的轉(zhuǎn)錄活化，調(diào)節(jié)細胞生命進程，參與細胞增殖、分化、凋亡，參與維持細胞形態(tài)，構(gòu)建細胞骨架等多種生物學(xué)反應(yīng)。葛新紅等[10]在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的延長，糖尿病大鼠背部皮膚表皮與真皮厚度逐漸變薄，且p-ERK1/2 的表達逐漸下降。唐乾利等[11]研究表明，通過調(diào)控ERK1/2 信號通路，進而改變病理炎癥反應(yīng)狀態(tài)，促進慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)。上述研究證實，ERK 信號通路與潰瘍創(chuàng)面的愈合密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ERK 抑制劑能抑制HaCaT 細胞的增殖及p-ERK1/2 蛋白的表達（P 均＜0.01）。

中醫(yī)學(xué)認為，糖尿病足潰瘍屬于“消渴”“脫疽”“脈痹”的范疇，主要由于氣陰虧虛、瘀阻脈絡(luò)、外感濕熱等導(dǎo)致，早期本虛以氣虛、陽虛為主，成癰期多見氣陰兩虛夾瘀，潰瘍期以氣血陰陽虧虛為主，但脈絡(luò)瘀阻貫穿疾病始終，是最關(guān)鍵的發(fā)病因素[12-14]，因此治療原則在于補益氣血、活血化瘀。本實驗所用的補陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，此方大劑量黃芪補脾胃之氣而生營血，外走肌表生肌托瘡，輔以歸尾補血行血，赤芍、川芎、桃仁、紅花化瘀行滯，地龍通絡(luò)活血，共奏氣旺血行、瘀消脈通之效。目前已有臨床研究顯示，補陽還五湯可促進糖尿病足潰瘍的愈合[15-16]。本研究結(jié)果顯示，補陽還五湯能濃度依賴性促進HaCaT 細胞的遷移和增殖（P＜0.05），且觀察到產(chǎn)生上述影響的機制與激活ERK 信號通路有關(guān)。同時在ERK 信號通路受到抑制的情況下，補陽還五湯仍能部分逆轉(zhuǎn)ERK 信號通路抑制劑對HaCaT 細胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。

綜上，本研究驗證了補陽還五湯可通過ERK 信號通路的激活發(fā)揮生物學(xué)作用，但補陽還五湯是否通過其他途徑或者其他信號通路促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移還有待進一步研究，且單一細胞實驗難以完全模擬糖尿病足潰瘍的真實環(huán)境，補陽還五湯是否還通過對其他類型細胞的影響進一步促進糖尿病足潰瘍的愈合也有待進一步研究。