丹參酮ⅡA 通過調(diào)控HMGB1 表達(dá)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕大鼠膿毒癥肺損傷機(jī)制研究

黃約諾 葉 威 鄭青秀 潘錕鐳 李獻(xiàn)超 王世強(qiáng)

膿毒癥是全身嚴(yán)重感染及多器官功能衰竭的炎癥反應(yīng)，死亡率高達(dá)50%～70%[1]。目前膿毒癥發(fā)生急性肺損傷的主要機(jī)制是炎癥反應(yīng)。膿毒癥肺損傷時，高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是人體發(fā)生炎癥反應(yīng)的啟動者，是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致死效應(yīng)的關(guān)鍵促炎因子。HMBG1 通過模式識別Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），TLR4 與HMGB1 結(jié)合后可通過髓樣分化因子88（myeloiddifferentiation-factor88，MyD88）活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），在膿毒癥過程中進(jìn)一步釋放出大量炎癥因子，導(dǎo)致病情進(jìn)展。丹參酮ⅡA 是中藥丹參的脂溶性成分，在眾多靶器官中，肺臟中分布的丹參酮ⅡA 濃度最高，且具有抗炎作用[2-4]。本研究基于動物模型——膿毒癥肺損傷大鼠，探討丹參酮ⅡA 通過TLR4/MyD88/NF-κB 通路參與膿毒癥的發(fā)病和進(jìn)展，為臨床診療提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物 25 只SPF 級健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購于上海斯萊克公司，體質(zhì)量220～250 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0004。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號：SYXK（浙）2021-0012，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（20±2）℃，濕度55%，12 h 光暗環(huán)境交替，大鼠可自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物管理與倫理委員會審核通過（倫理批號：IACUC-20211213-11）。

1.2 主要藥物及試劑 丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（批號C13034027），購自上海麥克林生化科技股份有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1120），購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol（批號15596-018），購自Invitrogen 公司；RT SuperMix for qPCR（批號K1074）、2X SYBR Green qPCR Master Mix（批號K1070），均購自美國APExBIO 生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 石蠟包埋機(jī)（Thermo Fisher 公司，Shandon Histocentre 2），烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9070A），旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（Thermo Fisher 公司，F(xiàn)inesse 325），微量移液器（德國Eppendorf 公司，3123000250，3123000268，3123000225），顯微鏡（OLYMPUS，CKX41），實(shí)時熒光定量PCR 儀（LightCycler 96，Roche），電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司，HW-SY11-KP2），電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，CPA）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 隨機(jī)取20 只SPF 級SD大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and perforation，CLP）造模[5]，隨機(jī)編號后分為四組，即模型組及低、中、高劑量治療組，每組5 只。CLP 術(shù)后2 h，模型組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（20 mL/kg），低、中、高劑量治療組腹腔注射不同劑量丹參酮ⅡA（5、10、20 mg/kg）。另取5 只SPF 級SD 大鼠作為假手術(shù)組，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉成功后，開腹翻動腸道后關(guān)閉腹腔，2 h 后，觀察大鼠一般情況，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（20 mL/kg）。各組大鼠干預(yù)完成后等待24 h，再次麻醉大鼠，采用腹主動脈抽血至大鼠缺血死亡。五組大鼠處置后，用剪刀剪下心肺，快速完整剝離肺臟，用生理鹽水沖洗干凈后，分離左右兩肺。

1.5 肺組織石蠟切片的制作及HE 染色 取大鼠左肺上葉，固定在10%甲醛中24 h，所有組織標(biāo)本經(jīng)梯度乙醇及二甲苯脫水，石蠟包埋、切片、撈片、烤片。蘇木素染液浸3～5 min；流水返藍(lán)2 h；流水沖洗玻片，浸伊紅染液5 min；95%無水乙醇、二甲苯各兩缸分別5 min，中性樹膠封片分別在光鏡下以200 倍數(shù)觀察大鼠肺組織病理變化。

1.6 肺組織濕/干重比（W/D）測定 取大鼠新鮮右肺上葉組織，濾紙擦干，電子天平稱重，即為濕重（W），再放入85 ℃烤箱中連續(xù)干燥24 h，直至重量恒定不變，電子天平稱重，即為干重（D），計算W/D 比值。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表達(dá) 取大鼠右肺中下葉，Trizol 法提取組織RNA。1 mL Trizol裂解組織，200 μL 氯仿抽提，4 ℃，12000 r/min 離心15 min，取上層水相，加入400 μL 異丙醇后，靜置10 min，4 ℃，12000 r/min 離心10 min，取沉淀，無水乙醇洗3 次，靜置干燥，核酸蛋白檢測儀檢測產(chǎn)物濃度。將提取的總RNA 通過PCR 逆轉(zhuǎn)為cDNA。利用實(shí)時熒光定量PCR 檢測目標(biāo)基因表達(dá)水平，用2-△△CT表示mRNA 表達(dá)水平。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，方差齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齊時選Dunnett's T3法，兩兩比較采用多樣本方差檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠的肺組織顏色無異常，結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁完整，沒有塌陷，間隔無增寬，無水腫，肺泡腔清晰、干凈，毛細(xì)血管無充血等；模型組大鼠肺組織呈暗紅色，腫脹，結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡塌陷、滲出、水腫、間隔增寬，毛細(xì)血管充血，淤血，有進(jìn)展，且無減輕趨勢；低、中劑量治療組大鼠肺組織較模型組大鼠肺組織損傷明顯減輕，但較假手術(shù)組嚴(yán)重，高劑量治療組肺組織受損最輕。見圖1。

圖1 光鏡下大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化（HE 染色，200×）

2.2 各組大鼠肺組織W/D 比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織W/D 明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而低、中、高劑量治療組大鼠肺組織W/D較假手術(shù)組增大不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，低劑量治療組大鼠肺組織W/D 減小不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量治療組大鼠肺組織W/D 明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組肺組織W/D 比較（±s）

表2 各組肺組織W/D 比較（±s）

注：假手術(shù)組開腹，僅翻動腸道后關(guān)腹，腹腔注射生理鹽水；模型組造模，腹腔注射生理鹽水；低劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（5 mg/kg）；中劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（10 mg/kg）；高劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（20 mg/kg）；W/D 為肺組織濕/干重比；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別假手術(shù)組模型組低劑量治療組中劑量治療組高劑量治療組F 值P 值鼠數(shù)55555 W/D 4.50±0.12 5.09±0.42a 4.62±0.37 4.46±0.29b 4.27±0.21c 5.164 0.005

2.3 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量治療組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），低劑量治療組肺組織TLR4、MyD88、HMGB1 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01），而NF-κB 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA表達(dá)量比較（2-△△CT，±s）

表3 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA表達(dá)量比較（2-△△CT，±s）

注：假手術(shù)組開腹，僅翻動腸道后關(guān)腹，腹腔注射生理鹽水；模型組造模，腹腔注射生理鹽水；低劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（5 mg/kg）；中劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（10 mg/kg）；高劑量治療組造模，腹腔注射丹參酮ⅡA（20 mg/kg）；TLR4 為Toll 樣受體4；MyD88 為髓樣分化因子88；NF-κB 為核轉(zhuǎn)錄因子-κB；HMGB1 為高遷移率族蛋白B1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別假手術(shù)組模型組低劑量治療組中劑量治療組高劑量治療組F 值P 值鼠數(shù)55555 TLR4 1.00±0.23 2.25±0.35a 1.85±0.20c 1.54±0.12c 1.29±0.18c 40.024＜0.001 MyD88 1.00±0.28 2.59±0.28a 2.14±0.26b 1.78±0.28c 1.52±0.29c 42.128＜0.001 NF-κB 1.00±0.28 1.87±0.29a 1.63±0.13 1.35±0.09c 1.09±0.30c 21.227＜0.001 HMGB1 1.00±0.19 2.06±0.22a 1.72±0.10c 1.45±0.10c 1.26±0.27c 42.049＜0.001

3 討 論

HMGB1 是在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中起“警報性”作用的蛋白，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時，其可進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的分泌[6]。Li 等[7]研究表明，HMGB1 水平升高趨勢與膿毒癥疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性極強(qiáng)。TLR4是HMGB1 參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的受體，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時，HMGB1 激活TLR4[8-9]。TLR4 被激活后，可通過MyD88 來靶點(diǎn)NF-κB，產(chǎn)生炎癥“瀑布”樣效應(yīng)[10-11]。Yao 等[12]研究表明，肺損傷與TLR4 活化有關(guān)，釋放到細(xì)胞外的HMGB1 主要識別并結(jié)合TLRs等受體，MyD88 是TLRs 信號通路的關(guān)鍵接頭蛋白，啟動相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活的TLR4 能夠通過下游MyD88/NF-κB 通路，使大量炎癥介質(zhì)釋放，引起肺損傷。

丹參酮ⅡA 目前在臨床治療上比較常見，是一種性質(zhì)穩(wěn)定，有效成分利用率高，藥理作用廣泛，分子結(jié)構(gòu)明確的黃酮類化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)其具有改善心血管動脈硬化、增加冠脈血流量、抗腫瘤、抗臟器纖維化、抗炎、改善氣道功能等作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量治療組肺組織W/D 顯著減小，TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表達(dá)下調(diào)。低、中、高劑量治療組大鼠肺組織較模型組大鼠肺組織損傷明顯減輕。

綜上所述，丹參酮ⅡA 可能通過下調(diào)HMGB1 表達(dá)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路，減少炎癥因子釋放，從而保護(hù)肺組織，為膿毒癥肺損傷的臨床治療提供新的思路。