• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    β2腎上腺素能受體激動劑對低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓中肺血管重構(gòu)及BMPR2/BMP4表達(dá)的影響

    2023-11-27 11:56:38陳祖喬王芳李澤罡尹濤源
    中國老年學(xué)雜志 2023年22期
    關(guān)鍵詞:組肺激動劑肺動脈

    陳祖喬 王芳 李澤罡 尹濤源

    (1三亞中心醫(yī)院心內(nèi)科, 海南 三亞 572000;2海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院)

    肺動脈高壓(PAH)是一種具有高致死率的進(jìn)行性肺血管疾病,其特征是肺動脈血管重構(gòu)和肺血管阻力增加,最終導(dǎo)致右側(cè)心室肥大和心力衰竭,甚至引起患者死亡〔1,2〕。其中,肺血管重構(gòu)在PAH的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,主要表現(xiàn)為內(nèi)側(cè)增厚、肺動脈肌肉增強(qiáng)及肺動脈平滑肌細(xì)胞不受控制的增殖擴(kuò)張〔3〕。近年來,盡管PAH的治療取得了進(jìn)展,主要通過使用包括內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑和前列環(huán)素類似物等對肺血管進(jìn)行收縮以改善PAH癥狀〔4〕,但這種方法只能適度提高患者生存率,多數(shù)患者的預(yù)后仍然較差。因此,如何有效防治PAH現(xiàn)已成為臨床上亟待研究并解決的一項關(guān)鍵內(nèi)容。β腎上腺素能受體(βAR)是G蛋白耦聯(lián)受體的一種,可作為正常生理條件下心肌收縮力調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。β2AR是G蛋白耦聯(lián)受體超家族的一員,廣泛表達(dá)于平滑肌上,如血管平滑肌、支氣管平滑肌、骨骼肌血管等,該受體與其激動藥劑結(jié)合后可引起平滑肌舒張〔5〕。研究表明,在某些類型導(dǎo)致的心力衰竭中,β2AR丟失可能會失去正常的心臟保護(hù)特性〔6〕。此外,有報道指出β2AR受體激動劑對慢性阻塞性肺疾病患者的肺循環(huán)血流動力學(xué)和右室功能表現(xiàn)出有益作用,能夠延緩疾病的發(fā)生和發(fā)展〔7〕。鑒于此,本研究通過低氧誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠PAH模型,以沙丁氨醇作為β2AR激動劑對PAH大鼠進(jìn)行治療,旨在探討β2AR激動劑在PAH大鼠肺血管重塑中的作用及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗動物 清潔級健康Sprague-Dawley大鼠40只,雄性,體質(zhì)量180~200 g,由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供,飼養(yǎng)于無特定病原體屏障環(huán)境,溫度22~24 ℃,相對濕度為(50±5)%,12 h/12 h明暗交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批。

    1.2主要試劑 β2AR激動劑沙丁氨醇(齊魯制藥),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成生物公司),免疫熒光染色試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(上海碧云天生物研究所),兔抗人肺組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)多克隆抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體、兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)4多克隆抗體、兔抗人BMP受體(BMPR)2多克隆抗體和兔抗人Smad1/5/8多克隆抗體(英國Abcam公司),兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。

    1.3低氧誘導(dǎo)PAH模型的建立及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組,每組10只。對照組飼養(yǎng)于常氧環(huán)境下,其余3組飼養(yǎng)于常壓低氧箱內(nèi),氧濃度設(shè)置為(10.0±0.5)%,箱內(nèi)放石灰鈉和無水氯化鈣,用以吸收過量的CO2和水分,連續(xù)3 w后,β2AR激動劑低、高劑量組分別通過腹腔注射2.5、5.0 mg/kg的沙丁氨醇,其他兩組同時腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS),1次/d。連續(xù)2 w,期間各組均自由進(jìn)食、飲水。

    1.4肺動脈壓的測量 給藥結(jié)束后,腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉,以仰臥位固定于解剖臺上,皮膚消毒,將導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈插入,經(jīng)右心房送入右心室(RV),固定導(dǎo)管,另一端導(dǎo)管與Power Lab電力生理信號數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接,記錄儀上觀察右心室內(nèi)壓力波形,記錄RV收縮壓(RVSP)。

    1.5RV肥厚指數(shù)的測量 RVSP測量結(jié)束后,預(yù)冷PBS灌流,迅速離體肺組織及心臟,分別分離RV、左心室(LV)及室間隔(S),電子分析天平稱重,計算RV肥厚指數(shù)(RVH),公式:RVH=RV/(LV+S)。

    1.6HE染色觀察肺組織重構(gòu) 將左側(cè)肺組織置于4%甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)切片,制備成厚度為5 μm的組織切片。取組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水,雙蒸水洗滌,Mayer蘇木素染色10 min,雙蒸水洗滌,1%鹽酸-酒精分化數(shù)秒,流水沖洗,再用雙蒸水洗滌,0.5%伊紅染色2 min,流水沖洗,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化與重構(gòu),并攝取圖像。

    1.7肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定 將右側(cè)肺組織用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈,無菌環(huán)境下剪碎,稱取適量于離心管,加入適量RIPA裂解液,超聲波細(xì)胞破碎儀充分磨碎,冰上靜置10 min充分裂解,4 ℃低溫離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min,留取上清液,通過氮藍(lán)四唑顯色法檢測SOD活性,硫代巴比妥酸法測定MDA含量,參照試劑盒說明操作。

    1.8免疫熒光染色法檢測肺組織PCNA表達(dá) 取制備的肺組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,PBS洗滌(5 min×3次,下同),微波爐高溫(95 ℃)修復(fù)抗原,室溫冷卻后,以10%山羊血清室溫封閉45 min,棄去多余血清,在切片上滴加經(jīng)PBS稀釋的兔抗人PCNA多克隆抗體(1∶100),4 ℃下孵育過夜。次日,PBS洗滌,滴加經(jīng)PBS稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗(1∶200),室溫避光孵育2 h,PBS沖洗后,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育15 min,防淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)強(qiáng)度變化,并攝取圖像。

    1.9免疫組織化學(xué)染色測定肺組織α-SMA表達(dá) 取制備的肺組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫處理20 min,PBS清洗后,用10%山羊血清室溫封閉1 h,將切片與經(jīng)PBS稀釋后的鼠抗人α-SMA單克隆抗體(1∶100)置于4 ℃下共孵育過夜。次日,PBS洗滌,切片上滴加經(jīng)PBS稀釋的酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,PBS洗滌。利用DAB試劑液顯色,流水沖洗,蘇木素復(fù)染,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織切片內(nèi)染色情況,并攝取圖像,陽性著色為胞質(zhì)或胞核呈棕黃色至棕褐色,每張切片隨機(jī)選擇5個不同視野,Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計陽性染色的平均光密度值。

    1.10Western印跡檢測肺組織BMP4/BMPR2途徑相關(guān)蛋白表達(dá) 取右側(cè)肺組織研磨勻漿后,提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,使用裂解液將各樣品濃度進(jìn)行歸一化處理。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,取50 μg蛋白上樣,進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白,再以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜,將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,將膜與5%脫脂奶粉封閉液共封閉1 h,再分別浸于PBS稀釋的一抗液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。次日,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜(10 min×3次,下同),常溫下將膜與經(jīng)PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)共同孵育 1 h,TBST再洗膜。利用增強(qiáng)型ECL顯色液在暗箱內(nèi)進(jìn)行顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像,Image-Pro Plus6.0軟件分析各目的蛋白及內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

    1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad8.30軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1各組肺動脈壓力及RVH對比 與對照組比較,模型組RVSP和RVH顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH均顯著降低(P<0.05)。而β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.2各組肺組織HE染色 對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整,管壁周圍未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤;與對照組比較,模型組肺小動脈變窄,管壁增厚,內(nèi)膜增生,重構(gòu)現(xiàn)象明顯;與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現(xiàn)象得到抑制,見圖1。

    2.3各組肺組織SOD活性及MDA含量比較 與對照組比較,模型組肺組織中SOD活性顯著降低,MDA含量顯著增高(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中SOD活性顯著升高,MDA含量顯著減少(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組間SOD活性與MDA含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.4各組肺組織PCNA表達(dá)比較 各組免疫熒光染色結(jié)果顯示,對照組肺組織可見少量PCNA熒光表達(dá),模型組肺組織中PCNA熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增加,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中PCNA熒光表達(dá)強(qiáng)度較模型組均明顯減弱,見圖2。

    表1 各組RVSP、RVH、肺組織SOD活性與MDA含量、肺組織α-SMA陽性率及BMP4、BMPR2、p-smad1/5/8蛋白表達(dá)比較

    圖1 各組肺組織(HE染色,×200)

    箭頭所指為陽性表達(dá)圖2 各組肺組織PCNA表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

    2.5各組肺組織α-SMA表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組肺組織中著色細(xì)胞少,模型組肺組織著色細(xì)胞數(shù)明顯增加,α-SMA陽性率較對照組顯著升高(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中著色細(xì)胞數(shù)較少,α-SMA陽性率均較模型組顯著下降(P<0.05),見表1、圖3。

    圖3 各組肺組織α-SMA表達(dá)(免疫組化染色,×400)

    2.6各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組肺組織BMP4蛋白相對表達(dá)顯著上調(diào),而BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織BMP4蛋白相對表達(dá)顯著下調(diào),BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與β2AR激動劑低劑量組比較,β2AR激動劑高劑量組BMP4蛋白相對表達(dá)顯著下調(diào),BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表1、圖4。

    1~4:對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組圖4 各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達(dá)

    3 討 論

    PAH由各種病因引起肺血管結(jié)構(gòu)和功能的改變,其病因復(fù)雜,臨床表現(xiàn)多樣。盡管目前在了解PAH的發(fā)病機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展,但尚未開發(fā)出有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、右心衰竭并提高PAH患者的生存率。目前的治療方法主要針對前列環(huán)素、一氧化氮和內(nèi)皮素信號通路中的血管收縮異常,而對閉塞性血管重塑卻不能起到逆轉(zhuǎn)的作用〔4〕,因此,PAH的臨床研究旨在尋找改善不可逆肺動脈重塑的新療法。肺血管重構(gòu)作為PAH的主要病理特征,包括肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、平滑肌細(xì)胞過度增殖及外膜成纖維細(xì)胞異?;罨6陂L期慢性低氧環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的提高引起了上述幾種細(xì)胞內(nèi)血管活性因子、氣體信號分子及血管平滑肌內(nèi)鈣離子濃度升高,進(jìn)而誘發(fā)肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠的RVSP和RVH均顯著升高,肺動脈結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu),這表明PAH大鼠模型構(gòu)建成功。

    β2AR作為重要的G蛋白耦聯(lián)受體,其構(gòu)象的活化或非活化狀態(tài)與哮喘、心血管疾病及一些自身免疫性疾病密切相關(guān),刺激β2AR可同時激活促凋亡和抗凋亡信號途徑,在心力衰竭中促進(jìn)心肌細(xì)胞的生存〔6〕,此外,還有報道指出使用β2AR激動劑非諾特羅能夠使高血壓心力衰竭大鼠的心功能得到恢復(fù)〔9〕。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過β2AR激動劑治療后,PAH大鼠的肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現(xiàn)象也受到了明顯抑制。大量研究表明,氧化應(yīng)激在PAH中發(fā)揮著重要作用,SOD活性下降使得氧自由基清除能力降低,而MDA含量的增高促進(jìn)了其與氧自由基的結(jié)合,提高了肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖水平,進(jìn)而促進(jìn)了肺血管重構(gòu)〔10,11〕。本研究表明,β2AR激動劑能夠抑制低氧誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織SOD活性下降與MDA含量增高,減輕了PAH中氧化應(yīng)激水平,從而起到治療PAH的作用。

    肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)增生是肺血管重構(gòu)的主要特征,也是PAH發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。PASMC中增殖表型標(biāo)記是PAH患者或PAH動物模型的關(guān)鍵特征〔12〕。本研究結(jié)果顯示,在PAH大鼠的肺組織中檢測到細(xì)胞增殖性標(biāo)記PCNA蛋白表達(dá)顯著增加,再結(jié)合組織病理學(xué)染色觀察結(jié)果,即肺小動脈變窄及管壁增厚、內(nèi)膜增生的現(xiàn)象,由此推測,PAH大鼠的肺組織中PASMC發(fā)生了異常增殖。PASMC具有極強(qiáng)的可塑性,可響應(yīng)各種環(huán)境刺激而從收縮或靜止表型去分化為增殖或合成表型。PASMC 經(jīng)歷從收縮到合成的表型轉(zhuǎn)換,這是伴隨細(xì)胞過度增殖和血管重塑的主要原因,通常情況下,表型轉(zhuǎn)換會限制一些收縮蛋白如α-SMA的表達(dá)〔13〕。本研究結(jié)果說明,β2AR激動劑可能抑制了PAH大鼠肺組織內(nèi)PASMC的過度增殖,進(jìn)而緩解了肺血管重構(gòu)。

    BMPR2及其相關(guān)信號通路是肺血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,據(jù)統(tǒng)計,大約有80%的家族性PAH患者和20%的特發(fā)性PAH患者攜帶BMPR2的雜合突變〔14〕。BMPR2基因突變也在其他因素引起的肺動脈高壓患者中發(fā)現(xiàn),如先天性心臟病、肺靜脈阻塞等〔15,16〕,此外,BMPR2功能減退或喪失也有助于PAH發(fā)病機(jī)制。目前,越來越多的研究將功能失調(diào)的BMPR2相關(guān)信號傳導(dǎo)(包括 BMPR2、p-smad和BMP4)與PAH的過程發(fā)展聯(lián)系起來,而BMPR2基因的靶向遞送對PAH動物模型具有治療作用〔17〕。在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α能夠誘導(dǎo)miR-322表達(dá),而miR-322通過靶向BMPR1a和smad5來下調(diào)BMPR2信號途徑〔18〕。本研究檢測結(jié)果與先前報道一致,BMP4起初被鑒定為調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長和分化的分子,現(xiàn)已知其在包括PASMC在內(nèi)的其他細(xì)胞中也能發(fā)揮調(diào)節(jié)生長、分化和凋亡的作用〔19〕。

    綜上,β2AR激動劑對低氧誘導(dǎo)PAH大鼠具有保護(hù)作用,能夠減輕PAH中氧化應(yīng)激水平,抑制BMP4表達(dá)而激活BMPR2及下游蛋白smad1/5/8表達(dá),從而改善低氧誘導(dǎo)PAH 大鼠中肺血管重構(gòu)。然而,在β2AR激動劑介導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)中,涉及相關(guān)細(xì)胞如PASMC增殖的分子機(jī)制還有待探索。

    猜你喜歡
    組肺激動劑肺動脈
    疏風(fēng)解毒膠囊經(jīng)miR-155/JAK1-STAT1信號通路發(fā)揮對甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的保護(hù)作用*
    異甘草酸鎂對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠治療作用及其機(jī)制
    81例左冠狀動脈異常起源于肺動脈臨床診治分析
    肺動脈肉瘤:不僅罕見而且極易誤診
    綠蘿花中抗2型糖尿病PPARs激動劑的篩選
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:41:22
    GPR35受體香豆素類激動劑三維定量構(gòu)效關(guān)系研究
    體外膜肺氧合在肺動脈栓塞中的應(yīng)用
    AMPK激動劑AICAR通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖
    肺癌合并肺動脈栓塞癥的CTA表現(xiàn)
    多巴胺受體激動劑戒斷綜合征
    大型黄色视频在线免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜免费激情av| 久久久久久久久大av| 不卡视频在线观看欧美| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人一区二区视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 日韩人妻高清精品专区| 久久久a久久爽久久v久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲在线观看片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 级片在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 搞女人的毛片| 午夜激情欧美在线| 一级毛片电影观看 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久久久成人| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 岛国在线免费视频观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 中文字幕熟女人妻在线| 中文字幕熟女人妻在线| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲国产欧美在线一区| 成人三级黄色视频| 亚洲av男天堂| 日韩强制内射视频| 观看美女的网站| 毛片女人毛片| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产成人a区在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国模一区二区三区四区视频| 午夜激情欧美在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 中文资源天堂在线| 中文欧美无线码| 久久久久久久久中文| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜视频国产福利| 久久久久性生活片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产av一区在线观看免费| 69人妻影院| 美女大奶头视频| 国产午夜精品一二区理论片| 黄色视频,在线免费观看| 岛国毛片在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 婷婷六月久久综合丁香| 人人妻人人看人人澡| 一本久久精品| 亚洲真实伦在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品粉嫩美女一区| www.av在线官网国产| 国产成人aa在线观看| av免费观看日本| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人午夜高清在线视频| 国产毛片a区久久久久| 韩国av在线不卡| av.在线天堂| av免费在线看不卡| 亚洲经典国产精华液单| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久久久久久黄片| 免费av观看视频| 久久精品夜色国产| 国产成人freesex在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 少妇熟女欧美另类| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一级黄色大片毛片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 大香蕉久久网| 国产伦理片在线播放av一区 | 久久午夜亚洲精品久久| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜福利高清视频| 六月丁香七月| 国产中年淑女户外野战色| 真实男女啪啪啪动态图| 国产毛片a区久久久久| av天堂在线播放| 男女边吃奶边做爰视频| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一个人看视频在线观看www免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产久久久一区二区三区| 特级一级黄色大片| 22中文网久久字幕| 亚洲国产欧洲综合997久久,| videossex国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲最大成人中文| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久6这里有精品| 国产精品蜜桃在线观看 | 国产精品三级大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩一区二区视频免费看| 国产免费一级a男人的天堂| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产精品国产精品| 在线a可以看的网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 日韩一区二区视频免费看| 成人欧美大片| 一级av片app| 国国产精品蜜臀av免费| 黄色视频,在线免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久久伊人网av| 国产男人的电影天堂91| 综合色av麻豆| 免费观看人在逋| 夜夜爽天天搞| 久久久色成人| 日本黄色片子视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 99九九线精品视频在线观看视频| 干丝袜人妻中文字幕| 搞女人的毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 如何舔出高潮| 国产精品1区2区在线观看.| 国产高清激情床上av| 亚洲高清免费不卡视频| 国产av一区在线观看免费| 亚洲中文字幕日韩| 亚州av有码| 亚洲国产精品成人久久小说 | 一夜夜www| 欧美成人免费av一区二区三区| 大香蕉久久网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99久国产av精品国产电影| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 日本在线视频免费播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲欧美日韩东京热| 国语自产精品视频在线第100页| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男人的好看免费观看在线视频| 麻豆成人午夜福利视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩av不卡免费在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产一区二区激情短视频| 日韩欧美精品v在线| 免费大片18禁| 男人狂女人下面高潮的视频| 白带黄色成豆腐渣| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本一本二区三区精品| 欧美精品一区二区大全| 激情 狠狠 欧美| 晚上一个人看的免费电影| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲内射少妇av| 女人被狂操c到高潮| 九草在线视频观看| 国产视频首页在线观看| 国产日本99.免费观看| 色5月婷婷丁香| 欧美bdsm另类| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩大尺度精品在线看网址| 神马国产精品三级电影在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品久久久久久久久久久久久| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产免费男女视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费人成视频x8x8入口观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产高潮美女av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久精品国产亚洲av天美| 不卡一级毛片| 色综合站精品国产| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 在线天堂最新版资源| a级毛片免费高清观看在线播放| 又爽又黄无遮挡网站| 国产老妇女一区| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲av不卡在线观看| 全区人妻精品视频| 成年女人永久免费观看视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 岛国在线免费视频观看| 亚洲人成网站高清观看| 中文欧美无线码| 亚洲欧美清纯卡通| 中文资源天堂在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 热99re8久久精品国产| 黄色一级大片看看| 长腿黑丝高跟| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产精品一区二区性色av| 校园人妻丝袜中文字幕| 十八禁国产超污无遮挡网站| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 赤兔流量卡办理| 日韩制服骚丝袜av| 国产中年淑女户外野战色| 在线观看66精品国产| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 内地一区二区视频在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 色播亚洲综合网| 欧美最黄视频在线播放免费| 最新中文字幕久久久久| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲18禁久久av| 免费人成视频x8x8入口观看| 中文字幕制服av| 国产精品.久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 哪里可以看免费的av片| 国产爱豆传媒在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 99在线人妻在线中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人一区二区视频在线观看| 婷婷亚洲欧美| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲在线自拍视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲美女视频黄频| 久久综合国产亚洲精品| 99久国产av精品国产电影| 天堂影院成人在线观看| 国产伦理片在线播放av一区 | av免费在线看不卡| 亚洲四区av| 黄色欧美视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧洲日产国产| 韩国av在线不卡| 亚洲欧美成人精品一区二区| 深夜a级毛片| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av不卡在线观看| 少妇高潮的动态图| 精品一区二区免费观看| 欧美丝袜亚洲另类| 国产黄片美女视频| 青春草亚洲视频在线观看| 丝袜喷水一区| 欧美bdsm另类| 青春草国产在线视频 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 看黄色毛片网站| 亚洲精品色激情综合| 午夜福利成人在线免费观看| 波多野结衣高清无吗| 国模一区二区三区四区视频| 免费看光身美女| 欧美性猛交黑人性爽| 99热这里只有是精品50| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 秋霞在线观看毛片| 身体一侧抽搐| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品日韩av片在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文字幕av在线有码专区| 美女黄网站色视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品福利在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品久久久久久久电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产午夜精品论理片| 国产亚洲91精品色在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 好男人视频免费观看在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 舔av片在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产人妻一区二区三区在| 全区人妻精品视频| 亚洲高清免费不卡视频| 黄色配什么色好看| 黄色视频,在线免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久99热这里只有精品18| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩欧美精品v在线| 久久久久性生活片| 国产三级中文精品| 午夜爱爱视频在线播放| 高清午夜精品一区二区三区 | 国内精品美女久久久久久| videossex国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 床上黄色一级片| 男女那种视频在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| av在线蜜桃| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美区成人在线视频| 精品久久久久久久末码| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲在久久综合| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| av专区在线播放| 美女国产视频在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99热全是精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产美女午夜福利| 我的老师免费观看完整版| 精品欧美国产一区二区三| 寂寞人妻少妇视频99o| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av二区三区四区| 久久6这里有精品| 黄色配什么色好看| 欧美激情在线99| 国产毛片a区久久久久| 丝袜美腿在线中文| 看免费成人av毛片| 欧美在线一区亚洲| 三级经典国产精品| 国产黄片视频在线免费观看| 青春草视频在线免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲最大成人av| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产 一区精品| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品人妻久久久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久久久久久久免费av| АⅤ资源中文在线天堂| 成人亚洲精品av一区二区| 身体一侧抽搐| av视频在线观看入口| 99热这里只有是精品50| 美女大奶头视频| 51国产日韩欧美| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产视频首页在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品一区www在线观看| 91狼人影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 日本一二三区视频观看| av在线亚洲专区| 久久久久久伊人网av| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美zozozo另类| 中文在线观看免费www的网站| 日韩一本色道免费dvd| 中国美女看黄片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产 一区精品| 久久久久久久久久成人| 久久99精品国语久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产三级在线视频| 日韩高清综合在线| 欧美+日韩+精品| 久久久久久久午夜电影| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美精品一区二区大全| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日韩欧美精品免费久久| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品三级大全| 免费观看精品视频网站| 国产精品一及| 内地一区二区视频在线| 午夜a级毛片| 桃色一区二区三区在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一本久久精品| 在线a可以看的网站| 夜夜爽天天搞| 亚洲在久久综合| 青青草视频在线视频观看| 99久久精品一区二区三区| 成人三级黄色视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久中文看片网| 成熟少妇高潮喷水视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产精品成人综合色| 赤兔流量卡办理| 久久久久久大精品| 97超碰精品成人国产| 久久久久久大精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一级毛片电影观看 | 色尼玛亚洲综合影院| 黄片无遮挡物在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| www.av在线官网国产| 中文字幕熟女人妻在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲人成网站高清观看| 高清日韩中文字幕在线| 人妻久久中文字幕网| 久久久午夜欧美精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 熟女电影av网| 能在线免费看毛片的网站| 精品不卡国产一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 中国美女看黄片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国模一区二区三区四区视频| 欧美+日韩+精品| 我要搜黄色片| 欧美激情国产日韩精品一区| 淫秽高清视频在线观看| av专区在线播放| 哪里可以看免费的av片| 久久人妻av系列| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久草成人影院| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产一级毛片在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产日本99.免费观看| 免费看a级黄色片| 国产一级毛片在线| 亚洲乱码一区二区免费版| a级毛色黄片| 亚洲真实伦在线观看| 青春草国产在线视频 | 亚洲精品国产成人久久av| 日韩成人伦理影院| 99九九线精品视频在线观看视频| 免费av观看视频| 国产精品精品国产色婷婷| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 看免费成人av毛片| 91久久精品国产一区二区成人| 搞女人的毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 97超碰精品成人国产| 少妇的逼好多水| 中文字幕久久专区| 久久精品国产清高在天天线| 高清毛片免费看| 97超视频在线观看视频| 成人美女网站在线观看视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产日本99.免费观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲成人久久爱视频| 男的添女的下面高潮视频| 久99久视频精品免费| 成人毛片60女人毛片免费| 成人av在线播放网站| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲国产色片| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产精品无大码| 国产精品久久电影中文字幕| 一区福利在线观看| 国产91av在线免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 级片在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 黄色欧美视频在线观看| 精品久久久久久久久av| 人人妻人人看人人澡| 深爱激情五月婷婷| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产成年人精品一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品三级大全| 少妇的逼水好多| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲图色成人| 97超视频在线观看视频| 亚洲av成人精品一区久久| 长腿黑丝高跟| 波多野结衣巨乳人妻| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美精品一区二区大全| 热99re8久久精品国产| 日本与韩国留学比较| 精品日产1卡2卡| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲在线观看片| 亚洲无线在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩av在线大香蕉| 精品不卡国产一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日本黄色片子视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本黄色片子视频| 成人国产麻豆网| 天堂影院成人在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美+日韩+精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产美女午夜福利| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成熟少妇高潮喷水视频| 99热只有精品国产| 美女被艹到高潮喷水动态| 综合色av麻豆| 一个人看视频在线观看www免费| 成人漫画全彩无遮挡| 岛国毛片在线播放| 97热精品久久久久久|