β2腎上腺素能受體激動劑對低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓中肺血管重構(gòu)及BMPR2/BMP4表達(dá)的影響

陳祖喬 王芳 李澤罡 尹濤源

(1三亞中心醫(yī)院心內(nèi)科, 海南 三亞 572000;2海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院)

肺動脈高壓(PAH)是一種具有高致死率的進(jìn)行性肺血管疾病,其特征是肺動脈血管重構(gòu)和肺血管阻力增加,最終導(dǎo)致右側(cè)心室肥大和心力衰竭,甚至引起患者死亡〔1,2〕。其中,肺血管重構(gòu)在PAH的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,主要表現(xiàn)為內(nèi)側(cè)增厚、肺動脈肌肉增強(qiáng)及肺動脈平滑肌細(xì)胞不受控制的增殖擴(kuò)張〔3〕。近年來,盡管PAH的治療取得了進(jìn)展,主要通過使用包括內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑和前列環(huán)素類似物等對肺血管進(jìn)行收縮以改善PAH癥狀〔4〕,但這種方法只能適度提高患者生存率,多數(shù)患者的預(yù)后仍然較差。因此,如何有效防治PAH現(xiàn)已成為臨床上亟待研究并解決的一項關(guān)鍵內(nèi)容。β腎上腺素能受體(βAR)是G蛋白耦聯(lián)受體的一種,可作為正常生理條件下心肌收縮力調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。β2AR是G蛋白耦聯(lián)受體超家族的一員,廣泛表達(dá)于平滑肌上,如血管平滑肌、支氣管平滑肌、骨骼肌血管等,該受體與其激動藥劑結(jié)合后可引起平滑肌舒張〔5〕。研究表明,在某些類型導(dǎo)致的心力衰竭中,β2AR丟失可能會失去正常的心臟保護(hù)特性〔6〕。此外,有報道指出β2AR受體激動劑對慢性阻塞性肺疾病患者的肺循環(huán)血流動力學(xué)和右室功能表現(xiàn)出有益作用,能夠延緩疾病的發(fā)生和發(fā)展〔7〕。鑒于此,本研究通過低氧誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠PAH模型,以沙丁氨醇作為β2AR激動劑對PAH大鼠進(jìn)行治療,旨在探討β2AR激動劑在PAH大鼠肺血管重塑中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物 清潔級健康Sprague-Dawley大鼠40只,雄性,體質(zhì)量180～200 g,由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供,飼養(yǎng)于無特定病原體屏障環(huán)境,溫度22～24 ℃,相對濕度為(50±5)%,12 h/12 h明暗交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2主要試劑 β2AR激動劑沙丁氨醇(齊魯制藥),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成生物公司),免疫熒光染色試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(上海碧云天生物研究所),兔抗人肺組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)多克隆抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體、兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)4多克隆抗體、兔抗人BMP受體(BMPR)2多克隆抗體和兔抗人Smad1/5/8多克隆抗體(英國Abcam公司),兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。

1.3低氧誘導(dǎo)PAH模型的建立及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組,每組10只。對照組飼養(yǎng)于常氧環(huán)境下,其余3組飼養(yǎng)于常壓低氧箱內(nèi),氧濃度設(shè)置為(10.0±0.5)%,箱內(nèi)放石灰鈉和無水氯化鈣,用以吸收過量的CO2和水分,連續(xù)3 w后,β2AR激動劑低、高劑量組分別通過腹腔注射2.5、5.0 mg/kg的沙丁氨醇,其他兩組同時腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS),1次/d。連續(xù)2 w,期間各組均自由進(jìn)食、飲水。

1.4肺動脈壓的測量 給藥結(jié)束后,腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉,以仰臥位固定于解剖臺上,皮膚消毒,將導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈插入,經(jīng)右心房送入右心室(RV),固定導(dǎo)管,另一端導(dǎo)管與Power Lab電力生理信號數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接,記錄儀上觀察右心室內(nèi)壓力波形,記錄RV收縮壓(RVSP)。

1.5RV肥厚指數(shù)的測量 RVSP測量結(jié)束后,預(yù)冷PBS灌流,迅速離體肺組織及心臟,分別分離RV、左心室(LV)及室間隔(S),電子分析天平稱重,計算RV肥厚指數(shù)(RVH),公式:RVH=RV/(LV+S)。

1.6HE染色觀察肺組織重構(gòu) 將左側(cè)肺組織置于4%甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)切片,制備成厚度為5 μm的組織切片。取組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水,雙蒸水洗滌,Mayer蘇木素染色10 min,雙蒸水洗滌,1%鹽酸-酒精分化數(shù)秒,流水沖洗,再用雙蒸水洗滌,0.5%伊紅染色2 min,流水沖洗,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化與重構(gòu),并攝取圖像。

1.7肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定 將右側(cè)肺組織用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈,無菌環(huán)境下剪碎,稱取適量于離心管,加入適量RIPA裂解液,超聲波細(xì)胞破碎儀充分磨碎,冰上靜置10 min充分裂解,4 ℃低溫離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min,留取上清液,通過氮藍(lán)四唑顯色法檢測SOD活性,硫代巴比妥酸法測定MDA含量,參照試劑盒說明操作。

1.8免疫熒光染色法檢測肺組織PCNA表達(dá) 取制備的肺組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,PBS洗滌(5 min×3次,下同),微波爐高溫(95 ℃)修復(fù)抗原,室溫冷卻后,以10%山羊血清室溫封閉45 min,棄去多余血清,在切片上滴加經(jīng)PBS稀釋的兔抗人PCNA多克隆抗體(1∶100),4 ℃下孵育過夜。次日,PBS洗滌,滴加經(jīng)PBS稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗(1∶200),室溫避光孵育2 h,PBS沖洗后,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育15 min,防淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)強(qiáng)度變化,并攝取圖像。

1.9免疫組織化學(xué)染色測定肺組織α-SMA表達(dá) 取制備的肺組織切片,經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫處理20 min,PBS清洗后,用10%山羊血清室溫封閉1 h,將切片與經(jīng)PBS稀釋后的鼠抗人α-SMA單克隆抗體(1∶100)置于4 ℃下共孵育過夜。次日,PBS洗滌,切片上滴加經(jīng)PBS稀釋的酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,PBS洗滌。利用DAB試劑液顯色,流水沖洗,蘇木素復(fù)染,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織切片內(nèi)染色情況,并攝取圖像,陽性著色為胞質(zhì)或胞核呈棕黃色至棕褐色,每張切片隨機(jī)選擇5個不同視野,Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計陽性染色的平均光密度值。

1.10Western印跡檢測肺組織BMP4/BMPR2途徑相關(guān)蛋白表達(dá) 取右側(cè)肺組織研磨勻漿后,提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,使用裂解液將各樣品濃度進(jìn)行歸一化處理。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,取50 μg蛋白上樣,進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白,再以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜,將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,將膜與5%脫脂奶粉封閉液共封閉1 h,再分別浸于PBS稀釋的一抗液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。次日,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜(10 min×3次,下同),常溫下將膜與經(jīng)PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)共同孵育 1 h,TBST再洗膜。利用增強(qiáng)型ECL顯色液在暗箱內(nèi)進(jìn)行顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像,Image-Pro Plus6.0軟件分析各目的蛋白及內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad8.30軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組肺動脈壓力及RVH對比 與對照組比較,模型組RVSP和RVH顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH均顯著降低(P<0.05)。而β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2.2各組肺組織HE染色 對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整,管壁周圍未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤;與對照組比較,模型組肺小動脈變窄,管壁增厚,內(nèi)膜增生,重構(gòu)現(xiàn)象明顯;與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現(xiàn)象得到抑制,見圖1。

2.3各組肺組織SOD活性及MDA含量比較 與對照組比較,模型組肺組織中SOD活性顯著降低,MDA含量顯著增高(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中SOD活性顯著升高,MDA含量顯著減少(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組間SOD活性與MDA含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2.4各組肺組織PCNA表達(dá)比較 各組免疫熒光染色結(jié)果顯示,對照組肺組織可見少量PCNA熒光表達(dá),模型組肺組織中PCNA熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增加,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中PCNA熒光表達(dá)強(qiáng)度較模型組均明顯減弱,見圖2。

表1 各組RVSP、RVH、肺組織SOD活性與MDA含量、肺組織α-SMA陽性率及BMP4、BMPR2、p-smad1/5/8蛋白表達(dá)比較

圖1 各組肺組織(HE染色,×200)

箭頭所指為陽性表達(dá)圖2 各組肺組織PCNA表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

2.5各組肺組織α-SMA表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組肺組織中著色細(xì)胞少,模型組肺組織著色細(xì)胞數(shù)明顯增加,α-SMA陽性率較對照組顯著升高(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中著色細(xì)胞數(shù)較少,α-SMA陽性率均較模型組顯著下降(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組肺組織α-SMA表達(dá)(免疫組化染色,×400)

2.6各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組肺組織BMP4蛋白相對表達(dá)顯著上調(diào),而BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織BMP4蛋白相對表達(dá)顯著下調(diào),BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與β2AR激動劑低劑量組比較,β2AR激動劑高劑量組BMP4蛋白相對表達(dá)顯著下調(diào),BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表1、圖4。

1～4:對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組圖4 各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達(dá)

3 討 論

PAH由各種病因引起肺血管結(jié)構(gòu)和功能的改變,其病因復(fù)雜,臨床表現(xiàn)多樣。盡管目前在了解PAH的發(fā)病機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展,但尚未開發(fā)出有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、右心衰竭并提高PAH患者的生存率。目前的治療方法主要針對前列環(huán)素、一氧化氮和內(nèi)皮素信號通路中的血管收縮異常,而對閉塞性血管重塑卻不能起到逆轉(zhuǎn)的作用〔4〕,因此,PAH的臨床研究旨在尋找改善不可逆肺動脈重塑的新療法。肺血管重構(gòu)作為PAH的主要病理特征,包括肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、平滑肌細(xì)胞過度增殖及外膜成纖維細(xì)胞異?；罨６陂L期慢性低氧環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的提高引起了上述幾種細(xì)胞內(nèi)血管活性因子、氣體信號分子及血管平滑肌內(nèi)鈣離子濃度升高,進(jìn)而誘發(fā)肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠的RVSP和RVH均顯著升高,肺動脈結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu),這表明PAH大鼠模型構(gòu)建成功。

β2AR作為重要的G蛋白耦聯(lián)受體,其構(gòu)象的活化或非活化狀態(tài)與哮喘、心血管疾病及一些自身免疫性疾病密切相關(guān),刺激β2AR可同時激活促凋亡和抗凋亡信號途徑,在心力衰竭中促進(jìn)心肌細(xì)胞的生存〔6〕,此外,還有報道指出使用β2AR激動劑非諾特羅能夠使高血壓心力衰竭大鼠的心功能得到恢復(fù)〔9〕。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過β2AR激動劑治療后,PAH大鼠的肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現(xiàn)象也受到了明顯抑制。大量研究表明,氧化應(yīng)激在PAH中發(fā)揮著重要作用,SOD活性下降使得氧自由基清除能力降低,而MDA含量的增高促進(jìn)了其與氧自由基的結(jié)合,提高了肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖水平,進(jìn)而促進(jìn)了肺血管重構(gòu)〔10,11〕。本研究表明,β2AR激動劑能夠抑制低氧誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織SOD活性下降與MDA含量增高,減輕了PAH中氧化應(yīng)激水平,從而起到治療PAH的作用。

肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)增生是肺血管重構(gòu)的主要特征,也是PAH發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。PASMC中增殖表型標(biāo)記是PAH患者或PAH動物模型的關(guān)鍵特征〔12〕。本研究結(jié)果顯示,在PAH大鼠的肺組織中檢測到細(xì)胞增殖性標(biāo)記PCNA蛋白表達(dá)顯著增加,再結(jié)合組織病理學(xué)染色觀察結(jié)果,即肺小動脈變窄及管壁增厚、內(nèi)膜增生的現(xiàn)象,由此推測,PAH大鼠的肺組織中PASMC發(fā)生了異常增殖。PASMC具有極強(qiáng)的可塑性,可響應(yīng)各種環(huán)境刺激而從收縮或靜止表型去分化為增殖或合成表型。PASMC 經(jīng)歷從收縮到合成的表型轉(zhuǎn)換,這是伴隨細(xì)胞過度增殖和血管重塑的主要原因,通常情況下,表型轉(zhuǎn)換會限制一些收縮蛋白如α-SMA的表達(dá)〔13〕。本研究結(jié)果說明,β2AR激動劑可能抑制了PAH大鼠肺組織內(nèi)PASMC的過度增殖,進(jìn)而緩解了肺血管重構(gòu)。

BMPR2及其相關(guān)信號通路是肺血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,據(jù)統(tǒng)計,大約有80%的家族性PAH患者和20%的特發(fā)性PAH患者攜帶BMPR2的雜合突變〔14〕。BMPR2基因突變也在其他因素引起的肺動脈高壓患者中發(fā)現(xiàn),如先天性心臟病、肺靜脈阻塞等〔15,16〕,此外,BMPR2功能減退或喪失也有助于PAH發(fā)病機(jī)制。目前,越來越多的研究將功能失調(diào)的BMPR2相關(guān)信號傳導(dǎo)(包括 BMPR2、p-smad和BMP4)與PAH的過程發(fā)展聯(lián)系起來,而BMPR2基因的靶向遞送對PAH動物模型具有治療作用〔17〕。在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α能夠誘導(dǎo)miR-322表達(dá),而miR-322通過靶向BMPR1a和smad5來下調(diào)BMPR2信號途徑〔18〕。本研究檢測結(jié)果與先前報道一致,BMP4起初被鑒定為調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長和分化的分子,現(xiàn)已知其在包括PASMC在內(nèi)的其他細(xì)胞中也能發(fā)揮調(diào)節(jié)生長、分化和凋亡的作用〔19〕。

綜上,β2AR激動劑對低氧誘導(dǎo)PAH大鼠具有保護(hù)作用,能夠減輕PAH中氧化應(yīng)激水平,抑制BMP4表達(dá)而激活BMPR2及下游蛋白smad1/5/8表達(dá),從而改善低氧誘導(dǎo)PAH 大鼠中肺血管重構(gòu)。然而,在β2AR激動劑介導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)中,涉及相關(guān)細(xì)胞如PASMC增殖的分子機(jī)制還有待探索。