姜黃素經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對缺血再灌注損傷大鼠心肌凋亡的保護作用及機制研究

曾石秀，陳 艷，韓巧秀，劉賤豐，王 麗，鐘一鳴

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；2. 贛州市會昌縣中醫(yī)院內(nèi)二科；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；4. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科；5. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院信息科，江西 贛州 341000）

目前我國心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）患病率及死亡率仍處于持續(xù)上升階段，心血管疾病死亡人數(shù)位居城鄉(xiāng)居民總死亡首位［1］。心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia/reperfusion injury，I/R）是缺血性心血管病患者在接受早期溶栓、冠狀動脈旁路移植術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等再灌注治療時，導(dǎo)致心肌進一步損傷的一種常見的臨床癥狀［2-3］，是再灌注治療后早期死亡的重要原因。姜黃素（Curcumin）是從姜黃（姜科）根部提取出來的一種自然產(chǎn)生的化合物。姜黃是姜科植物，其根莖可入藥，氣香特異，味苦、辛，性溫，歸脾、肝經(jīng)；具有破血行氣、通經(jīng)止痛功能，用于胸脅刺痛、胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、風濕肩臂疼痛、跌撲腫痛的治療［4-5］。姜黃素具有多種藥理活性，目前已被證明可有效治療慢性炎癥性疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、關(guān)節(jié)炎和心血管疾?。?-7］。本研究建立急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，研究姜黃素在大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的保護作用機制，即能否通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress， ERS）發(fā)揮其抗I/R 作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物健康SPF 級雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠50 只，體重200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗有限公司提供［合格證號SCXK（湘）2019-0004］。

1.1.2 藥品與試劑姜黃素購自Sigma公司，TUNEL試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，GRP78、Caspase-12、CHOP、GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器熒光顯微鏡（Zeiss，德國），全自動脫水機（Leica，德國），石蠟包埋機（Leica，德國），切片機（Leica，德國），連續(xù)光譜多功能酶標儀（Thermo Fisher，美國），超微量紫外分光光度計（Thermo Fisher，美國），熒光定量PCR（Bio-Rad，美國），蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組、給藥建模雄性SD 大鼠50 只，5只1 籠，飼養(yǎng)在恒溫（22±2）℃、恒濕（55±5）%、人工光照明暗各12 h 的飼養(yǎng)室內(nèi)，標準飼料和自來水隨機取食。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為5 組，每組10 只，并接受相應(yīng)的處理：①假手術(shù)組（sham組）：先給予生理鹽水10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再行假手術(shù)。②缺血再灌注組（I/R組）：先給予生理鹽水10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。③姜黃素［10 mg·（kg·d）-1］+I/R 組（Cur-L 組）：先姜黃素10 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。④姜黃素［20 mg·（kg·d）-1］+I/R 組（Cur-M 組）：先姜黃素20 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。⑤姜黃素［30 mg·（kg·d）-1］+I/R 組（Cur-H組）：先姜黃素30 mg·（kg·d）-1灌胃15 d，再建立缺血再灌注模型。

1.2.2 動物模型制備假手術(shù)方法：左側(cè)開胸，左冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎。根據(jù)WU Y W 等［8］方法構(gòu)建缺血再灌注損傷大鼠模型：術(shù)前12 h 大鼠禁食不禁飲，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 mL·kg-1）麻醉大鼠，仰臥位固定，小白線拴牙固定頭部。沿胸骨柄左側(cè)向劍突方向備出一長約3 cm 寬約1.5 cm的皮膚區(qū)域，然后用碘伏消毒。經(jīng)口腔插入氣管插管，插管時需拉住舌尖將氣管插管一端抵至咽喉處，看到有潮濕氣體進入插管后再向內(nèi)推入0.5 cm即可。氣管插管放置妥當后縫合固定。將電極金屬夾夾持1寸針灸針刺入大鼠四肢皮下，連接BL-420S生物醫(yī)學(xué)記錄系統(tǒng)記錄Ⅱ、Ⅵ心電圖，觀察大鼠心電圖變化。設(shè)置動物呼吸機的呼吸比為1∶1，呼吸頻率為85～90 次·min-1，潮氣量為6～12 mL/次，然后將呼吸機氣管與氣管插管連接。開啟呼吸機，胸骨柄正中位切口，逐層分離暴露心包，分離心包使心臟暴露。使用7-0 的絲線在左前降支下穿線，以結(jié)扎血管供血區(qū)域心臟的顏色由紅轉(zhuǎn)白表明心肌缺血成功。缺血30 min 后剪斷結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注2 h。

1.2.3 樣本制備于實驗第21 d 行手術(shù)，手術(shù)成功后從頸靜脈取血后立即處死大鼠，迅速取心臟放于PBS溶液中清洗干凈，再用過濾紙吸干表面液體，保持標本干凈，部分組織放入4%多聚甲醛溶液固定；余心臟組織置于液氮中保存。

1.2.4 心肌細胞凋亡的檢測用4%的多聚甲醛固定心肌組織樣本24 h 后石蠟包埋。按照TUNEL凋亡試劑盒的步驟染色。在熒光顯微鏡高倍鏡下（400 倍）隨機選取3 個視野觀察并計數(shù)TUNEL 陽性細胞數(shù)目及總細胞數(shù)，計算心肌細胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（AI）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 檢測血清心肌酶的水平大鼠頸靜脈采血，室溫靜置20 min，隨后3 000 r·min-1離心15 min；取血清，分裝后保存-80 ℃。血清心肌酶含量檢測按肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-MB， CK-MB）ELISA 試劑盒說明書進行操作，然后于酶標儀上檢測CK-MB 的吸光度值（A450 nm），最后根據(jù)標準曲線換算出各組的血清心肌酶含量。

1.2.6 RT-qPCR 檢測相關(guān)mRNA 的表達Trizol法抽提總RNA，并測定總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再按照熒光定量PCR 試劑盒說明書進行cDNA 擴增。引物序列見如下：GRP78 F：5'-AGGAGGACAAGAAGGAGGA-3'，R：5'-GAGTGAAGGCCACATACGA-3'；CHOP F：5'-CTTGACCCTGCATCCCT-3'，R：5'-CCTCTTCTTCC TCCTGAGC-3'；Caspase-12 F：5'-ATTGTGAGAGCCA CCCCTTC-3'，R：5'-TGGGGAACCACCAGACCTTA-3'；GAPDH F：5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3'，R：5'-ACACCGACCTTCACCATCT-3'。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s 并收集熒光，共40 個循環(huán)；并做溶解曲線（60～94 ℃）。數(shù)據(jù)采用相對定量法，以2-△△Ct來進行分析，△Ct=Ct 目的-Ct 內(nèi)參，△△Ct=△Ct 實驗組-△Ct對照組。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的表達取少量心肌組織塊置于1～2 mL勻漿器中盡量粉碎，加400 mL 單去污劑裂解液裂解勻漿；置于冰上重復(fù)碾碎；裂解30 min 后，將裂解液移至1.5 mL 離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，10% SDS-PAGE 凝膠電泳，濕式電轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉2 h后加入GRP78、CHOP、Caspase-12一抗（1∶1 000）及兔抗GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜3 次，每次10 min。然后分別加入山羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光液顯影蛋白條帶，使用Image Lab軟件分析目標蛋白（GRP78、CHOP 和Caspase-12）和內(nèi)參照GAPDH 的灰度值，以各目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值的比值分別反映各目的蛋白的相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 或Dunnett T3 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞凋亡比較假手術(shù)（sham）組大鼠心肌組織無明顯細胞凋亡，與sham 組比較，I/R 組及Cur-L 組、Cur-M 組、Cur-H 組可見明顯的凋亡細胞，凋亡指數(shù)增加（P＜0.01）；與I/R 組比較，Cur-L組、Cur-M組、Cur-H組凋亡細胞減少，凋亡指數(shù)降低（P＜0.01），其中，Cur-H 組的凋亡指數(shù)最?。≒＜0.01）（圖1、圖2）。

圖1 TUNEL染色熒光鏡下各組心肌細胞凋亡情況比較（×400）

圖2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)比較

2.2 各組血清心肌酶水平比較與sham 組比較，I/R 組及Cur-L 組、Cur-M 組、Cur-H 組大鼠血清中CK-MB 顯著升高（P＜0.001）；與I/R 組比較，Cur-L組、Cur-M 組、Cur-H 組大鼠血清中CK-MB 顯著降低（P＜0.001）；與Cur-L 組比較，Cur-M 組、Cur-H 組血清CK-MB顯著降低（P＜0.001）（表1）。

表1 各組大鼠血清CK-MB水平比較/

表1 各組大鼠血清CK-MB水平比較/

注：與sham組比較①P＜0.001；與I/R組比較②P＜0.001；與Cur-L組比較③P＜0.001。

?

2.3 各組GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA 比較與sham 組比較，I/R 組及Cur-L 組、Cur-M 組、Cur-H 組GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA 表達增加（P＜0.05）；與I/R 組比較，Cur-L 組、Cur-M 組、Cur-H組GRP78 mRNA表達增加，CHOP、Caspase-12 mRNA表達降低（P＜0.05）；與Cur-L 組比較，Cur-M 組GRP78 mRNA 表達增加，CHOP、Caspase-12 mRNA表達降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各組GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA表達比較/

表2 各組GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA表達比較/

注：與sham組比較①P＜0.01，②P＜0.001；與I/R組比較③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001；與Cur-L組比較⑥P＜0.05。

?

2.4 各組GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白比較與sham組比較，I/R組及Cur-L組、Cur-M組、Cur-H組GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表達增加（P＜0.05）；與I/R 組比較，Cur-L 組、Cur-M 組、Cur-H 組GRP78 蛋白表達增加，CHOP、Caspase-12 蛋白表達降低（P＜0.05）；與Cur-L 組比較，Cur-M 組GRP78蛋白表達增加，CHOP、Caspase-12 蛋白表達降低（P＜0.05）（表3）。

表3 各組GRP78、CHOP 和Caspase-12蛋白表達比較/

表3 各組GRP78、CHOP 和Caspase-12蛋白表達比較/

注：與sham組比較①P＜0.05，②P＜0.001；與I/R組比較③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001；與Cur-L組比較⑥P＜0.05。

?

3 討論

目前，已從姜黃中鑒定出200 多種活性成分［9］，姜黃素安全性高，在治療上表現(xiàn)出多種生物效應(yīng)，如抗炎［10］、降糖［11］、抗氧化［12-13］、免疫調(diào)節(jié)［14-15］、抗凝［16］、降脂［17］、保肝［18-19］和抗抑郁［20-21］等。越來越多的證據(jù)表明姜黃素在心臟缺血再灌注損傷中具有心臟保護作用［22-23］，了解這種保護作用可能有助于深入了解心肌損傷的機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞重要的細胞器，彌散分布在整個胞質(zhì)區(qū)域，在細胞蛋白和脂質(zhì)合成、鈣信號調(diào)控等過程中發(fā)揮了重要作用［24-25］。眾多的病理性細胞刺激往往會引發(fā)未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在胞內(nèi)累積，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress， ERS）［25-26］。適當?shù)腅RS 有利于激活細胞保護性適應(yīng)機制，但一旦ERS 持續(xù)時間過長或過強，會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，則引起細胞凋亡［27］。ERS 誘導(dǎo)的凋亡存在多種途徑，包括CHOP 通路、Caspase-12活化、JNK 通路、Bcl-2蛋白家族和鈣超載等［28］。ZHANG C 等［29］研究顯示在I/R 模型中，未折疊蛋白反應(yīng)被激活，且下游的PERK、IRE1、ATF6 信號通路也均被激活。在缺血性心臟病的發(fā)展過程中ERS 參與了重要的病理機制，抑制ERS 可能對I/R損傷的心肌有益［30-31］。

本實驗結(jié)扎大鼠前降支成功構(gòu)建缺血再灌注損傷模型，為接下來實驗干預(yù)研究提供了穩(wěn)定的動物模型。血清中CK-MB 升高和心肌細胞凋亡程度是I/R 的主要特征之一，可以反映心肌受損程度，心肌細胞損傷CK-MB 水平升高。研究結(jié)果顯示，姜黃素能顯著降低CK-MB 水平，說明使用姜黃素可以改善心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡。細胞凋亡的分子調(diào)控機制復(fù)雜，其中，ERS 誘導(dǎo)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Glucose-regulated protein，GRP78）表達而產(chǎn)生保護作用，正常狀態(tài)下GRP78 與蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER kinase， PERK）結(jié)合，ERS 發(fā)生時，GRP78 與 PERK 解離，PERK 磷酸化并誘導(dǎo)CHOP表達［32］。CHOP 蛋白是ERS 性凋亡的重要蛋白，門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12（Cysteine aspartic acid specific protease-12， Caspase-12）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的凋亡效應(yīng)蛋白，其可通過切割Bid 蛋白，促使活性的p15 Bid 蛋白釋放和堆積，激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，從而抑制或活化Bax、Bcl-2 等凋亡相關(guān)蛋白表達，誘導(dǎo)細胞凋亡［33］。本研究結(jié)果也顯示，與假手術(shù)組比較，模型組GRP78、CHOP、Caspase-12表達增加，與模型組比較，使用姜黃素的大鼠心肌細胞CHOP、Caspase-12 表達降低，其作用機制與增加GRP78 表達，抑制CHOP、Caspase-12 表達有關(guān)，初步顯示姜黃素可能通過抑制ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡而改善大鼠I/R。然而，姜黃素減輕I/R 可能涉及多種作用機制，本實驗的局限性是僅聚焦在ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡，未能從多方面去探討姜黃素的可能機制。

綜上表明，姜黃素對缺血再灌注損傷的心肌細胞有一定的保護作用，其機制可能與其抑制ERS 觸發(fā)的GRP78/Caspase-12 信號通路活化有關(guān)。本研究為解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機制提供了新的思路，也進一步驗證了姜黃素對缺血再灌注損傷的心肌細胞治療作用。此外，抑制GRP78/Caspase-12通路激活也有望成為臨床治療缺血再灌注損傷的新策略及藥物研發(fā)的新思路。