長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠自發(fā)活動及認知功能的影響

張 婧，童 云，朱藝華，唐曉璐，李延檸

（1. 贛南醫(yī)學院公共衛(wèi)生與健康管理學院；2. 贛南醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，江西 贛州 341000）

氯胺酮是非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDAR）的拮抗劑，在臨床上作為一種分離性麻醉劑用于手術(shù)麻醉。臨床所用的氯胺酮是等量對映體右旋氯胺酮和左旋氯胺酮的外消旋混合物。艾司氯胺酮（Esketamine， ESK）作為氯胺酮的右旋單體，與NMDAR 的親和力比左旋單體高3～4 倍，鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果更佳。臨床上艾司氯胺酮的應用廣泛，在抗抑郁方面的作用尤為突出，單次注射不同濃度的艾司氯胺酮后，即可產(chǎn)生不同程度的抗抑郁效果［1］。大量研究已證實，長期反復給予氯胺酮能產(chǎn)生強烈的致欣快作用及神經(jīng)組織損傷，氯胺酮的不良反應呈劑量相關(guān)性，艾司氯胺酮的給藥劑量是氯胺酮的一半，因此其產(chǎn)生的不良反應更小。有研究顯示，艾司氯胺酮可引起擬精神病和解離不良反應［2］，但對于其他方面的不良反應研究較少，且存在分歧。為探究這一問題，本實驗以小鼠為研究對象，采用自發(fā)活動實驗和新物體識別實驗觀察艾司氯胺酮對小鼠自發(fā)活動和認知功能的影響，并檢測小鼠體質(zhì)量變化。臨床上艾司氯胺酮治療難治性抑郁癥最多不超過每周3 次用藥，且藥物用量主要為10 mg·kg-1和20 mg·kg-1［3］，因此，本實驗采用艾司氯胺酮每周注射1次及3次，并使用3種劑量（10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1），觀察不同頻次和劑量給藥對小鼠行為的影響，為進一步研究艾司氯胺酮的用藥安全性和預防藥物濫用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），8 周齡，體質(zhì)量18～23 g，在12 h 光照/12 h 黑暗、舒適和安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。按完全隨機設(shè)計將80 只小鼠根據(jù)給藥頻次分為每周1 次組和每周3 次組，每組再根據(jù)給藥濃度分為生理鹽水組（Saline組）和艾司氯胺酮實驗組（10 mg·kg-1組、20 mg·kg-1組及40 mg·kg-1組），每組10 只小鼠，持續(xù)腹腔注射8 周。本研究經(jīng)贛南醫(yī)學院動物倫理委員會批準。

1.2 藥物和試劑鹽酸艾司氯胺酮，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為210220BL，規(guī)格為2 mL∶50 mg。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 自發(fā)活動檢測通過曠場實驗觀察小鼠自發(fā)活動。曠場裝置為一個白底、無頂黑色塑料箱，大小40 cm×40 cm×30 cm。將小鼠從曠場一角置入，自由活動10 min，視頻采集系統(tǒng)記錄小鼠的運動總距離。每只小鼠測試完后使用70%乙醇擦拭箱底，去除氣味痕跡。

1.3.2 新物體識別實驗實驗分為適應、訓練和測試3 個階段。適應階段：各組小鼠在場地自由探索10 min，熟悉箱子環(huán)境。訓練階段：第2 天在箱子兩側(cè)分別放入兩個完全相同的圓錐體，兩個物體距離最近的角落保持相同的距離，讓小鼠在場地自由探索5 min。測試階段：1 h 后將其中一個圓錐體置換成一個材質(zhì)相同、大小相等、顏色不同的圓柱體，讓小鼠在場地內(nèi)進行自由探索。視頻采集系統(tǒng)記錄小鼠分別對新、舊物體的探索時間（物體探索時間定義為小鼠將鼻子指向物體周圍3 cm 以內(nèi)的時間），分析小鼠探索新物體時間占比。

1.3.3 體質(zhì)量檢測未給予藥物處理時初次測量體質(zhì)量；間斷性注射艾司氯胺酮期間，每周測量體質(zhì)量1次。

1.4 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，每周1 次及每周3 次給藥組分別采用單因素方差分析，隨后采用Newman-Keuls 法進行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠自發(fā)活動的影響每周1 次組中，各劑量實驗組小鼠與生理鹽水組相比，其自發(fā)活動的總運動距離均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中10 mg·kg-1劑量組的差異最為顯著（圖1A）。每周3 次組中，各劑量實驗組小鼠的總運動距離也均有增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1B）。

2.2 長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠認知功能的影響長期間斷注射艾司氯胺酮后，各劑量組小鼠在新物體識別實驗中的新物體探索時間占比相較于生理鹽水組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

2.3 長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠體質(zhì)量的影響長期間斷注射艾司氯胺酮后，各劑量組小鼠的體質(zhì)量相比于生理鹽水組無明顯變化（圖3）。

圖3 長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠體質(zhì)量變化的影響

3 討論

氯胺酮作為一種分離性麻醉劑多用于臨床手術(shù)麻醉，但由于具有致幻、致欣快等藥物濫用潛力，近年來已成為了一種新型毒品席卷全球，其非法制造、販賣以及非醫(yī)療用途在全球范圍內(nèi)不斷增加［4-5］。氯胺酮濫用會對機體產(chǎn)生嚴重不良反應，根據(jù)濫用者描述，使用氯胺酮后出現(xiàn)幻覺以及時間和空間扭曲的分離癥狀，長期使用可出現(xiàn)持續(xù)的精神分裂樣表現(xiàn)［6］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮在高劑量或作為濫用藥物使用時可以引起短暫、可逆或持久的認知障礙，氯胺酮依賴者存在明顯的認知功能損害［7］。氯胺酮和其他NMDAR 拮抗劑，如MK-801 和PCP，在精神分裂癥動物模型中可誘發(fā)認知障礙，對人也有擬精神病作用［8］。

艾司氯胺酮作為氯胺酮的右旋異構(gòu)體，對NMDAR具有更強的親和力，在臨床上用于重度抑郁癥的治療。研究報道，艾司氯胺酮治療抵抗性抑郁癥效果明顯，且發(fā)揮作用時間短［9］。艾司氯胺酮在抗抑郁方面發(fā)揮作用的同時也表現(xiàn)出了一些毒副作用。據(jù)報道，艾司氯胺酮在抑郁癥患者中引起擬精神病和解離作用［10-11］。單次注射艾司氯胺酮即能誘導猴紋狀體區(qū)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，這可能與人的急性擬精神病和解離不良反應相關(guān)［12］。使用高劑量（50 和75 mg·kg-1）艾司氯胺酮單次給藥后引起大鼠壓后皮質(zhì)中熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP-70）表達［1］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的HSP-70 被認為是可逆性神經(jīng)元損傷的敏感標志物，在細胞修復和保護機制中起重要作用［13-14］，HSP-70 的誘導可能是這些神經(jīng)元對艾司氯胺酮神經(jīng)毒性的代償性反應。在25 μM 的艾司氯胺酮中孵育24 h 后，海馬神經(jīng)元中促凋亡蛋白Bax（BCL2-Associated X protein，Bax）表達增加［15］，提示艾司氯胺酮可能導致細胞凋亡。

在認知功能方面，有臨床試驗顯示，艾司氯胺酮鼻內(nèi)給藥可引起短暫性認知障礙［16］。IDE S 等［17］研究證實，10 mg·kg-1及20 mg·kg-1的艾司氯胺酮腹腔注射會損害小鼠識別記憶能力。重復間歇給予艾司氯胺酮會導致小鼠內(nèi)側(cè)前額葉和海馬中小白蛋白（Parvalbumin， PV）免疫活性喪失，艾司氯胺酮引起的認知障礙可能與此相關(guān)［18］。但也有文獻表明，艾司氯胺酮不會對抵抗性抑郁癥患者產(chǎn)生顯著的認知損害［19］。研究者利用改良的Y-迷宮進行實驗，結(jié)果表明，高劑量的氯胺酮損害小鼠空間記憶，但艾司氯胺酮對認知能力無影響［20］?？梢姡韭劝吠欠裼绊懻J知功能尚存在分歧，不同的研究結(jié)果可能與艾司氯胺酮的差異給藥方式相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，每周1 次或3 次注射艾司氯胺酮未損害小鼠的認知功能，表明長期間斷給予艾司氯胺酮在此方面有較高的安全性。

文獻報道，艾司氯胺酮可以引起小鼠自發(fā)活動增強，單次注射艾司氯胺酮的小鼠總運動距離明顯增加［21］，且呈現(xiàn)劑量依賴性，但過度活躍后很快恢復至正常水平［22］。在45 min 的運動能力測試［20］中，單次注射10 mg·kg-1的艾司氯胺酮后5 min 出現(xiàn)運動能力增強、搖頭不止等行為反應，提示艾司氯胺酮誘導自發(fā)活動增加，但低于該劑量的艾司氯胺酮未引起上述行為變化［23］。本實驗結(jié)果顯示，每周1次長期間斷注射艾司氯胺酮顯著增加小鼠的自發(fā)活動，每周3 次長期間斷注射艾司氯胺酮后小鼠的總運動距離也均有小幅增加，但差異無統(tǒng)計學意義，提示每周1 次長期間斷注射艾司氯胺酮可以增強小鼠興奮性。

臨床應用中，艾司氯胺酮常用于與鎮(zhèn)靜麻醉藥聯(lián)合誘導和實施全身麻醉，當僅用艾司氯胺酮麻醉時，部分患者會產(chǎn)生恢復期劑量依賴性反應。有研究者利用條件位置偏好實驗（Conditional position preference，CPP）證實，艾司氯胺酮顯著增加了CPP評分，且呈劑量依賴性，提示艾司氯胺酮具有一定的成癮性［22］。本實驗未對長期間斷艾司氯胺酮給藥后的小鼠成癮行為進行檢測，艾司氯胺酮長期使用是否具有成癮性需要進一步研究。

綜上所述，長期間斷注射艾司氯胺酮增加小鼠自發(fā)活動，程度隨給藥劑量和頻次有所不同，但未呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；長期間斷注射艾司氯胺酮對小鼠的體質(zhì)量及認知功能無顯著變化。艾司氯胺酮長期使用在其他方面是否存在負向作用有待深入研究。