山西太谷區(qū)谷子紋枯病病原鑒定及其生物學(xué)特性

韓彥卿 范玉杰 黃國(guó)麗 武曉雄 胡春艷 朱 嬌 王 鶴

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 4山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

谷子是我國(guó)北方重要的雜糧作物，具有抗旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)及高光效等特性。由于其基因組較小，目前已逐漸發(fā)展為最具發(fā)展?jié)摿Φ腃4禾谷類模式植物。谷子由野生綠色狗尾草［Setaria viridis（L.） Beauv.］馴化而來(lái)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值［1-2］。隨著谷子品種的同質(zhì)化種植和耕作制度的改變，紋枯病已成為威脅谷子產(chǎn)量的重要病害之一［3-4］。紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起，該病原菌可侵染豆科、禾本科、錦葵科等43 科263 種植物，引起植物紋枯病、根腐病、葉枯病、苗期立枯和猝倒病等［5-8］，危害嚴(yán)重時(shí)可造成巨大的產(chǎn)量損失。由于該病原菌具有廣泛的寄主范圍，防治難度較大。雖然可用大量的殺菌劑控制紋枯病的發(fā)生，但該方法將帶來(lái)更嚴(yán)重的環(huán)境污染和人類健康問(wèn)題［9］。因此，探明紋枯病的發(fā)生、鑒定病原菌絲融合群及生物學(xué)特性至關(guān)重要。迄今的研究發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌有14個(gè)菌絲融合種群，為AG1～AG 13、AG-B1［10］，部分AG 類型的融合群根據(jù)融合頻率、生理生化、形態(tài)特征、致病性和遺傳等又劃分為不同的亞群［11-12］，AG1～AG5、AG7～AG10 在中國(guó)有分布，其中AG1～AG4被公認(rèn)為是全球性菌株。

我國(guó)學(xué)者已對(duì)谷子紋枯病的發(fā)生［13］、生防藥劑篩選［14］開(kāi)展初步研究，但對(duì)病原菌分離鑒定和生物學(xué)特性的研究甚少。因此，本研究對(duì)采自山西省太谷區(qū)的谷子紋枯病病株進(jìn)行病原菌分離、純化，融合群確定，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列鑒定病原類型，利用牙簽嵌入法測(cè)定其致病性并對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為紋枯病的綜合防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病株采自山西晉中市太谷區(qū)。在田間挑選典型發(fā)病植株，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離純化。

供試培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基（water agar，WA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar medium，PSA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）、察氏培養(yǎng)基（Czapek medium）、查理培養(yǎng)基（Richard），所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下濕熱滅菌20 min，放至超凈工作臺(tái)內(nèi)備用。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離。將采集的谷子新鮮病株用滅菌水沖洗干凈，自然晾干，選擇單個(gè)病斑，從病健交界處剪取3 mm×3 mm 組織塊，在超凈工作臺(tái)中將病組織小塊放入75%乙醇中浸泡5 s，隨后移入2.5%次氯酸鈉溶液中消毒2 min，之后在滅菌水中連續(xù)漂洗3次，在滅菌濾紙上晾干后，用滅菌鑷子移至WA 培養(yǎng)基中，隨后將培養(yǎng)皿封口倒置放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，待組織長(zhǎng)出菌落后，接種針挑取菌落邊緣處菌餅轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，后期挑取菌絲塊置于含有PDA 斜面培養(yǎng)基的試管中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

從PDA 平板上用接種針挑取少量培養(yǎng)3 d 的病原菌菌絲，放在加有1滴浮載劑的載玻片上，加蓋玻片制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察病原菌菌絲的形態(tài)特征，參照Hietala等［15］的方法進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌的菌絲融合群鑒定

將本試驗(yàn)分離得到的4個(gè)菌株與14個(gè)紋枯病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別對(duì)峙培養(yǎng)，進(jìn)行菌絲融合測(cè)定［16］。

1.5 病原菌致病性檢測(cè)

采用柯赫氏法則驗(yàn)證病原菌的致病性。選用寄主品種晉谷21，挑選飽滿的谷粒，用2.5%的次氯酸鈉對(duì)種子表面進(jìn)行消毒20 min，75%的乙醇消毒5 min，滅菌水沖洗3次，于滅菌濾紙上晾干備用。將121 ℃高壓濕熱滅菌30 min 后的種植土放烘箱內(nèi)60 ℃烘干2 h 后分裝到直徑為25 cm 的花盆中。將消毒后的種子進(jìn)行播種，每盆5 株，后續(xù)接種紋枯病菌。待谷子生長(zhǎng)至拔節(jié)期，用直徑5 mm 的打孔器從培養(yǎng)2 d 菌齡的紋枯病菌菌落邊緣處打取菌餅，接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，將其置于28 ℃搖床內(nèi)搖培3 d。接著參考賀閩等［17］的牙簽嵌入法進(jìn)行處理，稍有改動(dòng)。將牙簽剪成1.0 cm左右的小段，整齊平鋪于皿底，鋪滿后加入PDA 培養(yǎng)基（剛好沒(méi)過(guò)牙簽），隨后將適量含有紋枯病菌菌絲片段的菌液涂布到PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d，待培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿菌絲。將帶有菌絲的牙簽嵌入到谷子倒三葉葉鞘內(nèi)，用滅菌的濕脫脂棉保濕，于25～28 ℃的條件下誘導(dǎo)植株發(fā)病，每處理3 次重復(fù)，設(shè)清水對(duì)照。待植株發(fā)病后取單個(gè)病斑，再次分離純化病原菌，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定是否與首次分離的病原菌相同，具體方法同1.2、1.3。采用上述接種方法分別將長(zhǎng)滿紋枯病菌菌絲的牙簽嵌入谷子、小麥、水稻、高粱的倒三葉葉鞘內(nèi)，相同溫室培養(yǎng)條件下脫脂棉保濕培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況，以不接菌為對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 病原菌分子生物學(xué)鑒定

用打孔器在紋枯病菌菌落上打取直徑5 mm 菌餅置于PDB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u培4～5 d，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基液面以后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用滅菌紗布過(guò)濾菌絲，再用滅菌水清洗3 次，用滅菌濾紙吸除過(guò)多水分后自然晾干，液氮研磨以后采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取病菌的基因組DNA［18］，使用Biodrop*uLite 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（上海奧然科貿(mào)有限公司）檢測(cè)DNA 純度和濃度。利用真菌ITS 序列通用引物：ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［19-20］。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板 DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，下載同源性較高的序列和1 個(gè)外群序列（小核菌屬Sclerotium coffeicola），用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.7 病原菌生物學(xué)特性分析

1.7.1 不同酸堿度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生的影響用1 mol·L-1的HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)酸堿度，分別配制成pH 值為5、6、7、8、9、10 的PDA 培養(yǎng)基，隨后，將2 d 菌齡的病原菌菌餅分別置于不同pH值的培養(yǎng)基中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)36 h時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)至第14 天時(shí)觀測(cè)菌核的產(chǎn)生情況。

1.7.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核形成的影響 使用直徑5 mm的打孔器從2 d菌齡的紋枯病菌菌落邊緣打取菌餅，分別接種于PDA、PSA、WA、Richard 培養(yǎng)基中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)36 h 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，14 d后觀測(cè)菌核的產(chǎn)生情況。

1.7.3 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇和葡萄糖作為唯一碳源取代培養(yǎng)基中的蔗糖，制備含不同碳源的培養(yǎng)基。將2 d菌齡的病原菌菌餅分別置于不同培養(yǎng)基中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，培養(yǎng)36 h 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，14 d后觀測(cè)菌核的產(chǎn)生情況。

1.7.4 不同氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生的影響以察氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的硝酸鈉、硫酸銨、胰蛋白胨作為唯一氮源代替其中的硝酸鉀，制備含不同氮源的培養(yǎng)基。將2 d 菌齡的病原菌菌餅分別置于不同培養(yǎng)基中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，培養(yǎng)36 h 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，14 d 后觀測(cè)菌核的產(chǎn)生情況。

1.7.5 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將2 d菌齡的紋枯病菌菌餅接種到PDA 平板中央，分別設(shè)置5、10、15、20、25、30、35 和40 ℃共8 個(gè)溫度梯度進(jìn)行培養(yǎng)觀察，每個(gè)溫度處理設(shè)3 次重復(fù)。培養(yǎng)至2 d 時(shí)用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.7.6 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將2 d菌齡的紋枯病菌菌餅接種于PDA 平板上，光暗培養(yǎng)條件分別設(shè)置為：24 h全光照、24 h全黑暗和12 h光照/12 h黑暗交替，溫度條件為25 ℃。每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)。培養(yǎng)至2 d時(shí)，觀察記錄菌絲生長(zhǎng)及菌落形成情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan 新復(fù)極差法對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子紋枯病癥狀及病原菌致病性

谷子紋枯病苗期到抽穗期均可發(fā)生。田間自然條件下，紋枯病的主要發(fā)病高峰在分蘗末期，以侵染基部葉鞘為主，有時(shí)葉片上也可見(jiàn)發(fā)病癥狀。病害發(fā)生時(shí)，在谷子葉鞘外緣形成暗褐色、中間淺褐色或灰白色，呈現(xiàn)不規(guī)則云紋狀病斑，有時(shí)多個(gè)病斑交錯(cuò)匯合，使莖稈呈“花稈”狀，若病斑環(huán)繞葉鞘，可導(dǎo)致其上面的葉片干枯死亡（圖1-A）。從病株上分離純化的菌株，采用牙簽嵌入法接種至健康谷子植株分蘗期的葉鞘內(nèi)，接種3 d在接種部位產(chǎn)生典型的外緣褐色、中間灰白色不規(guī)則的云紋狀的病斑（圖1-Bb），對(duì)照組未出現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖1-Ba）。后續(xù)從接種的葉鞘發(fā)病部位重新分離到與接種菌株菌落形態(tài)、生長(zhǎng)性狀相同的病原菌。經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，所分離菌株對(duì)谷子存在典型的致病性，初判定該菌株為谷子紋枯病的病原菌。將紋枯病菌分別接種于高粱、水稻、小麥的莖基部葉鞘，一周后發(fā)現(xiàn)在高粱葉鞘上產(chǎn)生紫紅色的病斑（圖1-Cb），在水稻葉鞘上產(chǎn)生邊緣褐色、中間白色的近圓形病斑（圖1-Db），小麥莖基部出現(xiàn)淺褐色病斑（圖1-Eb），對(duì)照組均未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。結(jié)果表明，該病菌對(duì)水稻、小麥、高粱等禾谷類作物也具有一定的致病性。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離的病原菌菌株在PDA 平板上培養(yǎng)3 d 于顯微鏡下觀察，病菌菌落生長(zhǎng)良好，呈圓形或近圓形，菌絲濃密、生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲初期為白色，隨后逐漸變?yōu)闇\褐色（圖2-A、C），生長(zhǎng)后期會(huì)在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生環(huán)形分布的褐色菌核（圖2-C）。顯微鏡下觀察，菌絲具有隔膜，呈直角分枝或近直角分支，基部稍縊縮（圖2-D）。對(duì)太谷區(qū)不同發(fā)病地塊的紋枯病病株上分離獲得的4 個(gè)菌株（WK*、WK-1、WK-2 和WK-3）的菌絲融合測(cè)定結(jié)果表明，4 個(gè)菌株均屬于立枯絲核菌（R.solani）AG-4 HG-Ⅲ融合群（表1）。

圖2 分離菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the isolates

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

提取分離得到的谷子紋枯病菌基因組DNA，核酸儀檢測(cè)合格后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA 條帶清晰（圖3-A）。用ITS5/ITS4 通用引物擴(kuò)增出病原菌的ITS區(qū)保守序列，4個(gè)菌株均得到長(zhǎng)度為 650 bp擴(kuò)增片段（圖3-B），經(jīng)BLAST分析，菌株WK*、WK-1、WK-2和WK-3的ITS序列和R.solaniAG-4 HG-Ⅲ相似度為99%。隨后，下載立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）不同菌株的ITS序列，并以小菌核屬（Sclerotium coffeicola）作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析結(jié)果表明，本研究分離的菌株與Rhizoctonia solaniAG-4-HG-Ⅲ聚在一個(gè)分支上（圖4）。因此，結(jié)合以上形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果，將該菌鑒定為絲核菌屬立枯絲核菌R.solaniAG-4 HG-Ⅲ亞群。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree based on ITS sequence

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 不同pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在不同pH 值的PDA 培養(yǎng)基上，谷子紋枯病菌生長(zhǎng)初期菌絲為白色，后略呈淺褐色，有褐色菌核產(chǎn)生。通過(guò)十字交叉法對(duì)培養(yǎng)36 h 的菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)pH 值6 時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，為41.20 mm（表2 和圖5），然后依次為pH值7、5、8、4、9、10，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)對(duì)菌落的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響。同時(shí)在培養(yǎng)至第6 天，分別統(tǒng)計(jì)菌核產(chǎn)生的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在不同pH 值的PDA 培養(yǎng)基上，產(chǎn)生的菌核數(shù)量存在一定的差異。在pH 值5、6、7 的培養(yǎng)基上菌核產(chǎn)生的數(shù)量多，菌核多呈現(xiàn)環(huán)形分布；在pH 值9、10 時(shí)，產(chǎn)生的菌核數(shù)量明顯減少，菌核分布相對(duì)分散（表2）。研究結(jié)果表明，pH值接近中性，菌絲生長(zhǎng)速度快，且產(chǎn)生的菌核數(shù)量較多；在過(guò)酸和過(guò)堿的條件下，菌絲生長(zhǎng)速度和菌核產(chǎn)生數(shù)量均受到不同程度的抑制。

表2 不同酸堿度下病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的差異Table 2 The colony growth of R. solani cultured in PDA of different pH values

圖5 不同pH值條件下病原菌菌落形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of R. solani in different pH value

2.4.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)和菌核形成的影響 將病原菌分別接種到PDA、Richard、PSA 和WA 這4 種不同的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至36 h時(shí)測(cè)定菌落直徑，培養(yǎng)至第14 天時(shí)觀察菌核的產(chǎn)生情況（圖6）。在Richard 培養(yǎng)基上，位于菌落中心的菌絲呈灰白色，表層產(chǎn)生的氣生菌絲呈米黃色，菌絲的濃密程度相對(duì)于在PDA 上培養(yǎng)的菌絲較稀疏，但比在WA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲濃密，所測(cè)的菌落直徑為43.20 mm，在病原菌生長(zhǎng)后期可見(jiàn)少量菌核產(chǎn)生。在PSA 培養(yǎng)基上，菌絲濃密程度與在PDA培養(yǎng)基上的相近，菌絲呈米黃色，菌落生長(zhǎng)速度最快，測(cè)得直徑為44.10 mm，生長(zhǎng)后期病原菌產(chǎn)生的菌核數(shù)量較多，多呈環(huán)狀分布。在WA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌絲較少，且菌絲最為稀疏，呈松散絨毛狀，菌落生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑為35.30 mm，菌絲生長(zhǎng)后期未見(jiàn)菌核產(chǎn)生。

圖6 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的病原菌菌落（A）及菌落直徑（B）Fig.6 The colony （A） and colony diameter （B） of R. solani under different culture media

2.4.3 不同氮源和碳源對(duì)菌落生長(zhǎng)和菌核形成的影響在5 種不同碳源的培養(yǎng)基上，病原菌菌落形態(tài)和菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯差異（圖7-A、C）。在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為43.60 mm，但菌絲相對(duì)稀疏。在以甘露醇和葡萄糖分別為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢，特別是在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑為35.56 mm。此外，對(duì)菌核產(chǎn)生情況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第5 天時(shí)，在以蔗糖和葡萄糖分別為碳源的培養(yǎng)基上均觀察到了菌核的產(chǎn)生，而以麥芽糖、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌核產(chǎn)生的時(shí)間推遲1～2 d，在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌核產(chǎn)生的時(shí)間最晚，在培養(yǎng)至第12天時(shí)僅有少量菌核產(chǎn)生。

圖7 不同氮源、碳源培養(yǎng)條件下病原菌菌落及菌落直徑Fig.7 The colony characteristics and colony diameter of R. solani on different carbon or nitrogen source

在4 種不同氮源的培養(yǎng)基上，病原菌菌落形態(tài)及菌絲生長(zhǎng)也表現(xiàn)出明顯差異（圖7-B、D）。以硝酸鉀為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑為46.70 mm，在培養(yǎng)至第6 天時(shí)，菌落邊緣開(kāi)始產(chǎn)生少量菌核，且菌核隨機(jī)分布；以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度次之，產(chǎn)生白色或淡黃色的致密菌絲，但無(wú)菌核產(chǎn)生；以硫酸銨為氮源時(shí)菌落直徑最小，為42.13 mm，菌核產(chǎn)生的時(shí)間最早，第4 天時(shí)已經(jīng)有菌核產(chǎn)生；以硝酸鈉為氮源時(shí)，病原菌菌落呈白色，培養(yǎng)至第5 天時(shí)在菌落邊緣有少量菌核產(chǎn)生。

2.4.4 不同溫度和光照對(duì)菌落生長(zhǎng)和菌核形成的影響將PDA 平板上的紋枯病菌置于不同溫度下于12 h 光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)，在病原菌生長(zhǎng)2 d后測(cè)量菌落直徑，發(fā)現(xiàn)病原菌在10～35 ℃條件下均可生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，菌落直徑最大，平均直徑為73.00 mm。溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì)抑制其生長(zhǎng)。在10 ℃下，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑最?。▓D8-A）。

圖8 溫度和光照處理?xiàng)l件下的病菌菌落直徑Fig.8 The colony diameter of R. solani under temperature and light treatment conditions

不同光照條件病原菌的菌落直徑如圖8-B 所示，發(fā)現(xiàn)不同光照條件對(duì)病原菌的菌落直徑影響差異不顯著，黑暗和光照條件菌絲均能正常生長(zhǎng)。在3 種不同的處理?xiàng)l件下，菌落直徑為58.00～64.00 mm。

3 討論

谷子紋枯病菌是一種世界性真菌病害，主要侵害谷子葉鞘，嚴(yán)重時(shí)可侵染至莖稈，使莖稈軟化腐爛，特別是灌漿后期，隨著穗重的增加，容易造成植株倒折，大發(fā)生時(shí)可嚴(yán)重降低谷子產(chǎn)量。目前，關(guān)于谷子紋枯病的研究甚少，僅僅局限于病害發(fā)生及藥劑防治等方面的初步研究，明確該病害病原菌的類型、致病性、生物學(xué)特性、寄主范圍等，是開(kāi)展后續(xù)病害防治、從根源上解決病害發(fā)生的前提條件和研究基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)山西太谷區(qū)谷子紋枯病癥狀的觀察、病原菌的分離純化、致病性測(cè)定、以及結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定，明確了引起谷子紋枯病的病原為絲核菌屬立枯絲核菌R.solaniAG-4 HG-Ⅲ類型。研究結(jié)果與Hao 等［21］最新鑒定的采自河北保定的紋枯病菌菌株菌絲融合群一致，與2014年Li等［4］報(bào)道的從河北邯鄲市的冀谷19上分離鑒定到的紋枯病菌AG-A 不同，而高衛(wèi)東［22］早期分離鑒定的山西紋枯病病菌菌絲融合群類型為AG-1-1A 和AG-4。由此推測(cè)，可能由于時(shí)空和土壤微生物環(huán)境等變化，紋枯病菌的融合群類型和致病力也會(huì)隨之發(fā)生改變，病原菌致病力可能會(huì)增強(qiáng)。經(jīng)接菌發(fā)現(xiàn)該病原菌不僅對(duì)谷子造成危害，對(duì)水稻、小麥、高粱均具一定的致病性（圖1），反映出立枯絲核菌具有較廣泛的寄主范圍［23-27］，并且本研究所測(cè)得的紋枯病菌生物學(xué)特性與其他研究人員在不同寄主上所測(cè)定的結(jié)果比較一致［28-29］。本研究鑒定的紋枯病菌菌株R.solaniAG-4 HG-Ⅲ可能是一個(gè)新的紋枯病菌的變異類型，其在多種培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，可利用多種碳源、氮源，對(duì)溫度的適應(yīng)范圍也較廣，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境條件，寄主范圍廣及對(duì)多種作物均具有較強(qiáng)的致病性，這些特性可能會(huì)導(dǎo)致菌株在時(shí)間和空間上及在不同作物間的傳播和擴(kuò)散，從而增加對(duì)該病害的防治難度。

本研究對(duì)太谷紋枯病菌菌株采集數(shù)量較少，后續(xù)將繼續(xù)廣泛采集更具代表性的谷子紋枯病病菌進(jìn)行鑒定，以期為谷子品種的合理布局及病害防治提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段，將山西太谷區(qū)谷子紋枯病病原菌鑒定為立枯絲核菌R.solaniAG-4 HG-Ⅲ類型。該病原菌可危害除了谷子以外的水稻、小麥和高粱等重要的糧食作物。病原菌在PDA 上菌絲生長(zhǎng)最快，PDA和PSA培養(yǎng)基有利于菌核的形成；菌絲生長(zhǎng)的最適pH 值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃；黑暗和光照條件病原菌均可生長(zhǎng)；該病原菌的最適的碳源和氮源分別為蔗糖和硝酸鉀。