PGPR菌劑對攀西高原植煙土壤nifH基因群落的影響

李思思 陳玉藍(lán)， 王 勇 秦磊濤 陳 強 辜運富，

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130；2四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615050）

氮是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素，增施氮肥是農(nóng)業(yè)上常見的提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)的方法，但其利用效率較低，僅為30%～50%左右，氮肥損失嚴(yán)重，未被利用的氮肥主要通過地表徑流向下滲透及向上揮發(fā)等造成水體污染、富營養(yǎng)化以及溫室效應(yīng)等環(huán)境問題［1］。近年來有大量關(guān)于解決氮肥利用效率等問題的研究，如從改變肥料種類、不同的輪作制度、調(diào)整灌溉等方式以及固氮微生物等角度探索提高氮的利用效率［2-3］。

農(nóng)業(yè)管理措施中，合理施肥能夠增加土壤微生物含量，提高土壤微生物多樣性［4］。土壤固氮微生物是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮素的主要來源之一，能通過固氮酶實現(xiàn)生物固氮。編碼固氮酶的基因有nifH、nifK和nifD，其中nifH最為保守［5］。nifH基因是固氮菌發(fā)揮固氮作用的必要保證，適量施肥能提高土壤固氮微生物nifH基因的豐度以及固氮微生物的多樣性，從而改變土壤環(huán)境，加速土壤養(yǎng)分釋放，為植物生長提供有利環(huán)境［6］。微生物菌劑可提高土壤養(yǎng)分含量及其利用率、加快土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，同時改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌多樣性，進(jìn)而為微生物活動創(chuàng)造適宜的微生態(tài)環(huán)境［7-9］。

涼山地區(qū)光熱資源充足，是我國優(yōu)質(zhì)煙葉生長適宜區(qū)之一。氮是烤煙健康生長的一種重要元素［10］。近年來，伴隨化肥過量施用，傳統(tǒng)優(yōu)勢煙區(qū)的植煙土壤出現(xiàn)明顯土壤酸化、板結(jié)、微生物數(shù)量下降、病蟲害增加等一系列問題，限制了烤煙正常生產(chǎn)［11］，而增施微生物肥料以提高土壤養(yǎng)分有效性對煙區(qū)化肥減施增效具有重要意義。鑒于此，本研究以四川涼山州會理市的植煙土壤為研究對象，研究了不同植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）菌劑對植煙土壤理化性質(zhì)、固氮酶活性以及nifH基因多樣性與群落組成的影響，以期深入認(rèn)識PGPR 菌劑處理下的植煙土壤氮素固定機制，為在烤煙種植上合理施用氮肥、減少化肥投入、提高土壤質(zhì)量并最終實現(xiàn)植煙土壤環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

本試驗于2020—2021 年度在四川省涼山州會理市龍河村植煙示范點（26°64'61''N，102°36'93''E）進(jìn)行，試驗連續(xù)進(jìn)行兩年。該地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫17 ℃，年均降水量1 000 mm 左右，干濕季節(jié)明顯，雨熱同季，光照充足，是煙葉種植區(qū)劃中烤煙生態(tài)最適宜區(qū)。試驗地土壤為滲育紫泥田土屬，成土母質(zhì)為紫色頁巖風(fēng)化殘坡積物，酸紫泥田土種。土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分為：pH 值5.12，有機碳5.24 g·kg-1，全氮1.58 g·kg-1，堿解氮68.60 mg·kg-1，有效磷26.60 mg·kg-1，速效鉀322.62 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)5個處理，每個處理3次重復(fù)。常規(guī)施肥基肥中復(fù)合肥用量為600 kg·hm-2。具體處理為：無肥處理（C1）；常規(guī)施肥（農(nóng)家肥7 500 kg·hm-2+復(fù)合肥600 kg·hm-2，C2）；PGPR 細(xì)菌+農(nóng)家肥7 500 kg·hm-2+復(fù)合肥 600 kg·hm-2（C3）；PGPR 放線菌+農(nóng)家肥7 500 kg·hm-2+復(fù)合肥600 kg·hm-2（C4）；PGPR 真菌+農(nóng)家肥7 500 kg·hm-2+復(fù)合肥600 kg·hm-2（C5）。試驗所用農(nóng)家肥及復(fù)合肥均由涼山州煙草公司提供。農(nóng)家肥養(yǎng)分含量為：有機質(zhì)含量≥42%，氮+磷+鉀≥6%，pH值5.7～8.3。復(fù)合肥中N、P2O5、K2O 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%、12%、25%。移栽后30 d 各處理均追施復(fù)合肥225 kg·hm-2。

各處理采用田間隨機區(qū)組排列，每個處理設(shè)置3個煙草種植小區(qū)，單個小區(qū)面積為5 m×6 m，做3次重復(fù)，每小區(qū)種植煙苗30株。

PGPR菌劑由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供，細(xì)菌為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.）SCAU1，放線菌為暗色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces Phaeochromogenes）SICAU417，真菌為黑曲霉（Aspergillus niger）SICU-33，三個菌株均已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號分別為CCTCCM2016106、CCTCCM2018661 和CCTCCM2019778。細(xì)菌用LB 液體培養(yǎng)基、放線菌用高氏一號液體培養(yǎng)基、真菌用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)5 d，然后用無菌蒸餾水稀釋成含活菌數(shù)約為1×107CFU·mL-1的菌液進(jìn)行煙苗灌根處理，每小區(qū)用量1 500 mL，每株用量約50 mL。

烤煙品種為云煙87（Nicotiana tabacumL.），于每年4月下旬施基肥、起壟、覆膜及烤煙移栽。相關(guān)的田間管理均按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)規(guī)范進(jìn)行。

1.3 土壤樣品采集

于煙株生長旺盛期，采用五點取樣法對根際0～20 cm 土層土壤進(jìn)行采集，混合后土樣采集總量不少于0.5 kg，每個處理取3 個平行樣品，每個樣品去除石礫和雜質(zhì)落葉后裝袋密封，并儲存于有冰袋的保溫箱中，運回實驗室，一部分用于高通量測序的樣品于-80 ℃保存，其他土樣風(fēng)干后磨碎過2 mm 篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定 采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定采集土壤的速效磷含量，土壤pH值用玻璃電極法測定，土水比為1∶2.5，有機碳含量采用重鉻酸鉀容量法測定，速效鉀含量采用火焰光度計法測定，全氮和堿解氮含量分別采用凱氏定氮法和擴散吸收法進(jìn)行測定，具體操作方法參考《土壤農(nóng)化分析》［12］。

1.4.2 土壤固氮酶活性測定 土壤固氮酶活性利用乙炔還原法進(jìn)行測定［13］，將10 g土壤樣品置于50 mL血清瓶中，瓶口密封，抽取瓶內(nèi)10%的氣體再補充注入等體積的乙炔，在28 ℃恒溫條件下?lián)u床避光培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，抽取少量瓶內(nèi)氣體用氣相色譜法檢測乙烯含量，以不加土壤、注入乙炔的血清瓶作為對照，3次重復(fù)。

1.4.3 土壤總DNA 提取及nifH基因擴增子測序 稱取0.5 g 土壤樣品，采用Fast DNA SPIN Kit For Soil試劑盒（MP Biomedical 公司，美國），按照說明書上的步驟提取土壤微生物總DNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存。使用特異性引物nifH-F（5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'）與nifH-R（5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGC-CATCAT-3'）對nifH基因片段進(jìn)行擴增［14］。擴增體系20 μL：PCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，10 ng·μL-1DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

土壤理化性質(zhì)及nifH基因群落多樣性指數(shù)等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的處理和繪圖利用Excel 2013 進(jìn)行，單因素方差分析利用SPSS 21.0 軟件完成。利用CANOCO 5.0 軟件對土壤環(huán)境參數(shù)和nifH基因群落相關(guān)性進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PGPR菌劑對植煙土壤理化性質(zhì)的影響

由表1 可知，與C1 和C2 相比，不同菌劑處理顯著降低了植煙土壤的pH 值，5 種不同施肥處理下，以不施肥處理（C1）的pH 值最高，C5 處理最低，較C1 降低了10.84%。施用PGPR 菌劑可提升土壤有機碳含量，其中C4 處理最高，較C1 提高了47.39%，不施肥處理（C1）和常規(guī)施肥處理（C2）的土壤有機碳含量較低。施用PGPR 菌劑同樣有利于提高植煙土壤全氮含量，其中以C4 處理的全氮含量最高，較C1 提高了11.11%，C2 處理最低。菌劑處理同樣提高了土壤有效磷含量，其中以C4 處理的土壤有效磷含量最高，較C1提高了15.56%。C5處理可以顯著提高土壤速效鉀含量，較C1提高了13.54%。上述結(jié)果表明PGPR菌劑對土壤理化性質(zhì)有明顯影響，可以改善烤煙根際微環(huán)境。

2.2 固氮酶活性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

由表1 可知，固氮酶活性的變化范圍為0.83～1.04 nmol·g-1·h-1，不同PGPR 菌劑處理能顯著提高植煙土壤固氮酶活性。由表2 可知，固氮酶活性與土壤pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.642，P＜0.01）。

表2 土壤固氮酶活性與理化性質(zhì)的皮爾遜相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis between nitrogenase activity and physical and chemical properties

2.3 PGPR菌劑對植煙土壤nifH基因群落的影響

2.3.1 PGPR 菌劑對植煙土壤nifH基因群落多樣性指數(shù)的影響 對不同PGPR 菌劑處理下的土樣nifH基因進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類后，其在OTU 數(shù)量上的差異見圖1。結(jié)果顯示，不同PGPR 菌劑處理會對植煙土壤nifH基因群落數(shù)量產(chǎn)生明顯影響。5 個土樣的共有OTU 數(shù)目是311，而特有OTU數(shù)量差異明顯，介于45～473之間。以C3 處理下的土壤特異OTU 數(shù)量最多，為473；C2 處理最少，僅有45。

圖1 不同PGPR菌劑處理下植煙土壤nifH基因群落的Venn花瓣分析圖Fig.1 Venn analysis of the nifH gene community composition of the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR strains

不同PGPR 菌劑處理下植煙土壤nifH基因群落多樣性如表3 所示，其中C3 處理（即PGPR 細(xì)菌+化肥常規(guī)施用）Shannon 和Simpson 指數(shù)最高，表明PGPR 細(xì)菌+化肥常規(guī)施用處理可提高植煙土壤nifH基因群落多樣性。

表3 不同PGPR菌劑處理下土壤nifH基因的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indexes of the nifH gene communities under different PGPR inoculum

2.3.2 PGPR 菌劑對土壤nifH基因群落組成的影響不同菌劑處理下的土壤nifH基因群落組成見圖2。結(jié)果顯示，在門水平上，土壤優(yōu)勢菌群是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和藍(lán)菌門（Cyanobacteria）。變形菌門（Proteobacteria）在C1、C2、C3、C4、C5 處理中的相對豐度分別為93.9%、85.0%、83.7%、96.1%、90.4%，均為優(yōu)勢菌門。而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度在C3處理最高，為9.2%，藍(lán)菌門（Cyanobacteria）相對豐度在C2處理中最高，為6.9%。

圖2 不同PGPR菌劑處理下植煙土壤nifH基因群落在門（A）和屬（B）水平上的組成Fig.2 Community composition of the nifH gene at the phylum （A） and genus level （B） in the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR inoculum

在屬水平，基于排名前10 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，5種處理下的群落組成和豐度在屬水平上存在差異。未標(biāo)明分類物種的占總體14.10%～38.50%，說明該土壤中有仍待挖掘的固氮菌資源。土壤優(yōu)勢菌屬為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、地桿菌屬（Geobacter）和固氮螺菌屬（Azospirillum）。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在C1、C2、C3、C4和C5等5個處理中為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為39.6%、30.7%、21.4%、46.4%和55.6%，其中C5 處理最高，C3 處理最低。而地桿菌屬（Geobacter）在C1 和C3 處理中相對豐度較高，分別為15.9%、12.7%。固氮螺菌屬（Azospirillum）、地桿菌屬（Geobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）均歸屬于變形菌門（Proteobacteria）。在C2、C3、C4、C5 四種施肥處理下的土壤中，變形菌門的慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）是第一優(yōu)勢屬。

2.3.3 PGPR 菌劑對植煙土壤含nifH基因優(yōu)勢物種的影響 為了揭示不同PGPR 菌劑對植煙土壤含nifH基因優(yōu)勢物種的影響，本研究進(jìn)一步統(tǒng)計了不同PGPR 菌劑處理下植煙土壤含nifH基因細(xì)菌前20 優(yōu)勢物種相對豐度值的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 PGPR菌劑對植煙土壤nifH基因在屬水平上前20優(yōu)勢物種相對豐度值的影響Fig.3 Variation of the relative abundance of the top 20 nifH gene at the genus level in the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR inoculum

由圖3 可知，相對于兩個對照處理（C1 和C2），不同PGPR 菌劑對植煙土壤屬水平上的nifH基因群落產(chǎn)生明顯影響。C3（細(xì)菌PGPR）處理下，中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、固氮菌屬（Azotobacter）、類伯克霍爾德氏菌屬（Paraburkholderia）、磁螺菌屬（Magnetospirillum）和梭菌屬（Clostridium）等屬的含nifH基因細(xì)菌優(yōu)勢物種相對豐度值顯著增加（P＜0.05）。而在C4（放線菌PGPR）處理下固氮螺菌屬（Azospirillum）、科薩克氏菌屬（Kosakonia）和伯克氏菌屬（Burkholderia）相對豐度顯著增加（P＜0.05）。C5（真菌PGPR）處理下的優(yōu)勢菌屬為慢生根瘤菌屬（Bardyrhizobium）。

2.3.4 不同施肥處理下植煙土壤nifH基因群落結(jié)構(gòu)與土壤肥力間的關(guān)系 本研究以土壤有機碳（soil organic carbon，SOC）、全氮（total nitrogen，TN）、堿解氮（available nitrogen，AN）、有效磷（available phosphorus，AP）、速效鉀（available potassium，AK）、pH 值來表征各處理的土壤理化性質(zhì)改變情況。對不同施肥處理土壤中nifH基因的群落與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析（RDA），結(jié)果表明（圖4），兩軸解釋量共達(dá)到41.92%。C2 處理的土壤nifH基因群落結(jié)構(gòu)與堿解氮含量呈負(fù)相關(guān)；在第四象限中，C3 處理的土壤nifH基因群落結(jié)構(gòu)與有效磷、有機碳含量、pH 值呈正相關(guān)；C5 處理的土壤nifH基因群落結(jié)構(gòu)則相反，與有效磷、有機碳含量、pH 值等呈負(fù)相關(guān)，從箭頭的連線長度可以看出影響土壤nifH基因群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子依次為pH 值＞堿解氮＞速效鉀＞有效磷＞全氮＞土壤有機碳。

圖4 不同菌劑處理下土壤nifH基因群落與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.4 RDA analysis between nifH gene community composition and physical-chemical properties of soil treated with different PGPR inoculum

3 討論

近年來，PGPR 菌株在大田條件下對植煙土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響及其機制備受關(guān)注［15］，而對植煙土壤功能基因群落結(jié)構(gòu)影響的報道較少。本研究分析了PGPR 菌劑在田間條件下對植煙土壤理化性質(zhì)和土壤固氮酶活性的影響，并以nifH基因為標(biāo)記基因，分析了不同PGPR 菌劑對植煙土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。

3.1 不同PGPR菌劑對植煙土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明，接種PGPR 菌劑能有效提高土壤養(yǎng)分的有效性、促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收利用［16-17］。Chauhan等［18］將分離出的解硫胺素細(xì)菌（Aneurinibacillusaneurinilyticu）CKMV1 接種于番茄種子上，種子萌發(fā)率、植株地上部和地下部的干鮮重顯著提高。王豹祥等［19］研究表明，接種PGPR 菌肥能夠改變烤煙根際微生物數(shù)量，提高烤煙根際微生物生物量碳含量，顯著提高現(xiàn)蕾期烤煙根際解磷菌數(shù)量。Gómez-Godínez 等［20］認(rèn)為PGPR 菌劑具有固氮酶活性，可顯著促進(jìn)玉米苗的生長。與前人研究相似，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在植煙土壤上接種具有PGPR 功能的細(xì)菌、放線菌和真菌菌劑可以有效提高植煙土壤養(yǎng)分含量、降低pH值。分析原因有二：一是PGPR 菌劑可以分泌生長素（indoleacetic acid，IAA）等植物激素，提高土壤酶活性，從而提高植煙土壤養(yǎng)分含量，促進(jìn)烤煙生長［21］；二是土壤微生物在分解有機物時產(chǎn)生的有機酸和呼吸作用產(chǎn)生的二氧化碳溶于水形成碳酸，使得土壤pH值降低［22］。

3.2 不同PGPR 菌劑對植煙土壤nifH 基因群落多樣性指數(shù)的影響

土壤微生物在維護(hù)和提升生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展方面具有潛在功能［23］。Wang等［24］研究表明，接種真菌型PGPR菌劑比細(xì)菌PGPR菌劑更能夠提高土壤微生物的Shannon 多樣性指數(shù)。另外，PGPR 菌劑配施有機肥可以有效提高玉米種植土中的固氮菌、溶磷菌數(shù)量［25］。有關(guān)農(nóng)業(yè)管理措施下nifH基因群落多樣性的響應(yīng)變化已有不少報道。前人研究發(fā)現(xiàn)，nifH基因群落的改變與土壤有機碳密切相關(guān)，且變形菌門是固氮微生物的優(yōu)勢菌門［26-27］。雖然PGPR菌劑被證明能提升土壤肥力、促進(jìn)烤煙生長，但關(guān)于PGPR菌劑對nifH基因群落多樣性和組成影響的報道較少，本試驗中，施用細(xì)菌型PGPR菌劑能提高植煙土壤nifH基因群落多樣性，其具體機制有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 不同PGPR 菌劑對土壤nifH 基因群落組成的影響

接種PGPR 菌劑可以改變土壤微生物群落組成。Yang 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，接種PGPR 菌劑下土壤放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）相對豐度的變化與玉米各時期的生長情況顯著相關(guān)。目前有研究顯示施肥是影響土壤中nifH基因群落組成的重要因素［29］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，不同PGPR 菌劑對植煙土壤中nifH基因群落組成產(chǎn)生影響，不同PGPR 菌劑處理下植煙土壤優(yōu)勢nifH基因群落明顯不同。其中Bradyrhizobium、Geobacter和Azospirillum等含nifH基因微生物是不同PGPR 菌劑處理下的響應(yīng)標(biāo)記物種，受PGPR 菌劑影響。Bradyrhizobium是土壤中常見含nifH基因細(xì)菌，受氮素肥料影響明顯，也會對土壤pH值產(chǎn)生明顯影響［30］。

3.4 不同施肥處理下植煙土壤nifH 基因群落結(jié)構(gòu)與土壤肥力間的關(guān)系

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)［19］。土壤含nifH基因細(xì)菌受土壤有機碳含量和pH值影響顯著，從而影響固氮微生物群落分布和土壤固氮酶活性［26］。本研究結(jié)果表明，土壤pH 值、堿解氮和速效鉀含量是影響植煙土壤nifH基因群落組成及多樣性的重要環(huán)境因子。土壤pH 值是影響土壤微生物多樣性和群落組成的重要因子［31］，本研究結(jié)果顯示，PGPR 菌劑的施用降低了土壤pH 值，從而導(dǎo)致nifH基因群落結(jié)構(gòu)的改變。土壤堿解氮含量也是影響nifH基因群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子，與前人研究結(jié)果一致［32］。關(guān)于土壤速效鉀含量與nifH基因群落結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系，前人鮮有報道，但Zhao 等［33］在有關(guān)鹽堿土中微生物與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，土壤速效鉀含量是影響土壤細(xì)菌群落組成的重要因子，可能是鹽堿土中的Na+含量較高，K+有利于平衡Na+對土壤微生物的毒害。本研究發(fā)現(xiàn)，植煙土壤速效鉀含量是影響nifH基因群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子，可能是由于烤煙是一種喜鉀植物，在生長過程中需要大量的鉀肥，從而影響了植煙土壤中nifH基因群落的結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

PGPR菌劑對攀西高原植煙土壤理化性質(zhì)、固氮微生物群落組成及多樣性產(chǎn)生明顯影響，細(xì)菌型PGPR顯著提高了土壤nifH基因群落的相對豐度值（P＜0.05），變形菌門（Proteobacteria）的慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、地桿菌屬（Geobacter）和固氮螺菌屬（Azospirillum）為植煙土壤的優(yōu)勢屬，土壤pH 值、堿解氮和速效鉀含量是影響土壤nifH基因群落組成的關(guān)鍵因子。