甘肅省慶陽(yáng)地區(qū)湖羊皮下膿腫病的流行病學(xué)調(diào)查及病原體分析

楊 帥 段宏偉 呂建樹 曾建林 閆振興 胡俊杰 張 勇 趙興緒

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

羊皮下膿腫病包括由偽結(jié)核棒狀桿菌引起的干酪性淋巴結(jié)炎（caseous lymphadenitis，CLA）［1-3］和其他化膿性細(xì)菌引起的皮下膿腫［4-5］，在世界范圍廣泛流行，對(duì)小反芻動(dòng)物中的綿羊（Ovis aries）和山羊（Capra hircus）危害較大，發(fā)病率為1%～30%［6-8］。病羊以成年羊?yàn)橹鳎憩F(xiàn)為食欲減退，逐漸消瘦，生產(chǎn)性能下降，繁殖功能受損。

羊皮下膿腫病是由細(xì)菌侵入家畜皮下而引發(fā)的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致皮下出現(xiàn)局部腫大、熱痛，引發(fā)功能障礙，如不進(jìn)行人為處理將導(dǎo)致病情十分頑固，甚至?xí)?jīng)血液、淋巴管轉(zhuǎn)移至其他組織，發(fā)生膿毒敗血癥，對(duì)生產(chǎn)造成不利影響［9］。該病的特點(diǎn)是亞急性或慢性病程，膿腫多見于面頰、下頜、頸部和肩關(guān)節(jié)，常通過外界引種將病原體引入畜群，并主要通過動(dòng)物間的直接接觸在畜群內(nèi)傳播，皮膚和粘膜是感染的主要途徑，其次是呼吸道和消化道［10］。引起皮下膿腫的病原較復(fù)雜，據(jù)目前相關(guān)報(bào)道，主要致病菌有金黃色葡萄球菌［11-13］和偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌［14］等。另外，有研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌也可以引起牛的軟組織膿腫［15］。

綜上，羊皮下膿腫病在全球范圍廣泛流行，病原菌組成復(fù)雜，膿腫類型多種多樣，不同的飼養(yǎng)管理因素也可能對(duì)該病的發(fā)生發(fā)展造成影響。目前國(guó)內(nèi)對(duì)皮下膿腫病的研究以山羊?yàn)橹鳎?-4，6-7，11-13］，對(duì)綿羊皮下膿腫病的大面積流行缺乏調(diào)查和病原研究。因此，本試驗(yàn)對(duì)慶陽(yáng)地區(qū)6 個(gè)典型發(fā)病湖羊場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查采樣，通過微生物多樣性測(cè)序和分離培養(yǎng)鑒定致病菌，并通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行致病菌毒力鑒定及組織病理學(xué)檢查，以期為甘肅慶陽(yáng)地區(qū)湖羊皮下膿腫病的防控及其致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，北京Solarbio公司；羊血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌脫纖維綿羊血，南京森貝伽生物科技有限公司；藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京Tiangen 生化有限公司；DL2000DNA Maker、2×Taq PCR Mix、核酸染料、Safe DNA Dye，北京TransGen有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DYCP-31A 電泳儀，北京六一儀器廠；ZQTY-70S恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DP-73正置光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；PCR 擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；LDZX-50 高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；ST8R 低溫高速離心機(jī)，美國(guó)THERMO公司。

1.3 調(diào)查內(nèi)容及樣品采集

于2022年6月對(duì)慶陽(yáng)地區(qū)存在湖羊皮下膿腫病的3 家育肥場(chǎng)（Q、K、Z）和3 家繁育場(chǎng)（X、Y、M）進(jìn)行實(shí)地調(diào)查，累計(jì)調(diào)查湖羊群體數(shù)量17 305 只。統(tǒng)計(jì)發(fā)病部位、發(fā)病湖羊性別、年齡及發(fā)病率等。以訪問形式了解該病發(fā)病病程、發(fā)病季節(jié)、養(yǎng)殖場(chǎng)管理和檢疫情況?，F(xiàn)場(chǎng)分別隨機(jī)采集各場(chǎng)患病湖羊體表膿腫中的膿汁樣本，將用于分離培養(yǎng)的樣本冷藏保存并于當(dāng)天送至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，將用于16S 微生物多樣性測(cè)序的樣本立即放入液氮冷凍保存。

1.4 三代微生物多樣性測(cè)序分析

將無(wú)菌采集冷凍保存的膿汁送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行三代微生物多樣性測(cè)序分析，三代微生物多樣性基于PacBio 測(cè)序平臺(tái)，利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule real-time，SMRT）的方法對(duì)marker基因進(jìn)行測(cè)序，之后對(duì)環(huán)形一致性序列（circular consensus sequencing，CCS）進(jìn)行過濾、聚類或去噪，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，以揭示樣品的物種構(gòu)成。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定

將無(wú)菌采集的膿汁在無(wú)菌生理鹽水中按1∶100 的比例充分稀釋，劃線接種于血平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待長(zhǎng)成單個(gè)菌落時(shí)觀察其形態(tài)以及是否溶血，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢鑒定，并進(jìn)行細(xì)菌的分離和純培養(yǎng)。純培養(yǎng)后繼續(xù)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢鑒定，初步判斷其細(xì)菌種屬，保存單一菌種進(jìn)行16S測(cè)序鑒定。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的提取步驟進(jìn)行DNA 提取。以細(xì)菌16SrRNA通用引物為引物［16］，序列為：F：5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3'，以提取的細(xì)菌DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL：上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 15 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取7 μL 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在含1%瓊脂糖的凝膠上進(jìn)行電泳。將條帶單一的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘭州天啟生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）官網(wǎng)上進(jìn)行堿基局部對(duì)準(zhǔn)檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)分析。使用MEGA5.0軟件分析序列，構(gòu)建分子遺傳樹。

1.6 分離菌株的動(dòng)物致病性試驗(yàn)和組織病理觀察

分別挑取一株金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單菌落接種于含血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)24 h后收集菌液，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌的菌落形成單位（colony-forming units，CFU），用生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU·mL-1。試驗(yàn)組分金黃色葡萄球菌感染組和大腸桿菌感染組，每組18只小鼠，皮下、腹腔和胃腸分別各接種6 只，每只接種0.2 mL。對(duì)照組18 只小鼠分別用等量生理鹽水接種。所有試驗(yàn)小鼠在相同條件下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠生長(zhǎng)情況，及時(shí)剖檢死亡小鼠，采集病料做涂片檢查和病理切片。將小鼠組織固定在4%多聚甲醛溶液中，48 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.7 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)

采用K-B 紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。接種環(huán)蘸取純化的菌落后，使用無(wú)菌生理鹽水分別將其稀釋為0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木海?7］。取100 μL至MH肉湯培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。使用游標(biāo)卡尺對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

對(duì)甘肅省慶陽(yáng)地區(qū)存在湖羊皮下膿腫病的6 個(gè)湖羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查，結(jié)果見表1。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病全年均可發(fā)生，以育成公羊多發(fā)。發(fā)病常見于湖羊頸部、耳下、乳房等部位（圖1），病初觸摸腫塊質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，隨著病程的發(fā)展，膿腫部位逐漸變軟，之后破裂流出大量膿汁，幾天后會(huì)自動(dòng)結(jié)痂愈合，但會(huì)在周圍或者原處長(zhǎng)出新的膿腫，病情十分頑固。該病病程緩慢，在羊群中逐漸蔓延，嚴(yán)重者發(fā)病率達(dá)20%。

圖1 湖羊皮下膿腫病自然病例Fig.1 Natural case of sheep subcutaneous abscess disease

表1 2022年甘肅省慶陽(yáng)市湖羊皮下膿腫病發(fā)病情況調(diào)查Table 1 Investigation on the incidence of sheep subcutaneous abscess in Qingyang City，Gansu Province in 2022

2.2 微生物多樣性測(cè)序分析結(jié)果

對(duì)6 個(gè)病料樣本進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序，結(jié)果顯示（圖2），6 份樣本的菌種組成均以金黃色葡萄球菌占優(yōu)勢(shì)，尤其在樣本組K、M、Q中的相對(duì)豐度達(dá)到99%以上。在Y、X、Z 中還發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌、皮爾洛斯頓菌、熒光假單胞菌等菌種。

圖2 細(xì)菌物種分布柱狀圖（種水平）Fig.2 Histogram of bacterial species distribution in pus（species level）

2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

6 份膿腫病料經(jīng)處理后接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)平板劃線法分離菌株。X、Y、Z 3份樣本分離純化出菌株A，6 份樣本均分離出菌株B。分離菌A 在鮮血瓊脂平板上表現(xiàn)為乳白色，荷包蛋狀，邊緣不平整，菌落周圍產(chǎn)生透明溶血圈（圖3-A），分離菌B 在鮮血瓊脂平板上表現(xiàn)為無(wú)色，圓形，菌落表面光滑，無(wú)擴(kuò)展生長(zhǎng)特點(diǎn)，菌落周圍產(chǎn)生透明溶血圈（圖3-B）。鏡檢結(jié)果顯示，從膿腫病料中分離出革蘭氏陰性桿菌3株，染色特征為兩端鈍圓，中等大小，單個(gè)存在（圖3-C）。分離出革蘭氏陽(yáng)性球菌6 株，染色特征為球型呈葡萄串狀排列（圖3-D）。6 株陽(yáng)性葡萄球菌和3 株陰性腸桿菌16SrRNA 擴(kuò)增長(zhǎng)度均在1 400～1 500 bp 之間（圖3-E），16SrRNA 測(cè)序后經(jīng)GenBank 進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果表明陽(yáng)性球菌與金黃色葡萄球菌同源性最高，陰性桿菌與大腸桿菌同源性最高。用兩株分離菌的16SrRNA 全長(zhǎng)與GenBank 中公布的參考序列構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹（圖3-F），其中分離菌株A 測(cè)序得到兩組序列ST1、ST2，分別與不同金黃色葡萄球菌參考序列形成分支；分離菌株B 測(cè)序得到的序列EC 與大腸桿菌參考序列形成分支。

圖3 分離菌株的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果Fig.3 Growth status and identification results of the isolates

2.4 小鼠致病試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 解剖觀察結(jié)果 小鼠在腹腔、灌胃接種分離菌后均表現(xiàn)出打堆、精神萎靡、毛發(fā)散亂等癥狀，皮下感染組小鼠狀態(tài)正常。觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染毒性大于大腸桿菌組，腹腔感染毒性大于灌腸組。體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌小鼠胸腔背側(cè)均出現(xiàn)干酪樣化膿灶（圖4-A），皮下感染小鼠在感染部位出現(xiàn)干酪樣化膿灶，導(dǎo)致背側(cè)皮膚粘連，難以剝離（圖4-B）；體內(nèi)感染大腸桿菌小鼠背側(cè)出現(xiàn)散在的淡灰色化膿灶，觸摸堅(jiān)實(shí)（圖4-C），皮下感染大腸桿菌小鼠在感染部位出現(xiàn)同樣質(zhì)地較小化膿灶（圖4-D）。最后，采集小鼠膿腫病料后分離培養(yǎng)得到與接種菌株相同的細(xì)菌。

圖4 分離菌感染小鼠臨床病變Fig.4 Abscess lesions in infected mice

2.4.2 組織切片觀察結(jié)果 小鼠感染兩種分離菌死亡后迅速取材制作病理切片，可見感染金黃色葡萄球菌小鼠心臟充血（淺藍(lán)色箭頭）（圖5-A）；肝臟中央靜脈充血（黑色箭頭），肝竇充血（淺藍(lán)色箭頭）（圖5-B）；脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，脾小體萎縮（圖5-C），肺臟肺泡隔充血出血（黑色箭頭）（圖5-D）；腎臟腎小管腫脹（黑色箭頭），腎小球充血出血（淺藍(lán)色箭頭）（圖5-E）；膿腫部位皮膚表現(xiàn)為化膿壞死性肌炎，肌細(xì)胞溶解壞死（淺藍(lán)色箭頭），可見大量增生纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭），局灶性壞死（黃色箭頭）（圖5-F）。感染大腸桿菌小鼠心臟心肌纖維變性（黑色箭頭），且可見充血出血（圖5-G）；肝臟肝細(xì)胞局灶性病變壞死（黑色箭頭），肝竇充血和大面積的藍(lán)紫色壞死灶（淺藍(lán)色箭頭）（圖5-H）；脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞彌漫性出血型壞死，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5-I）；肺臟肺泡隔充血出血，肺泡隔變寬（黑色箭頭）（圖5-J）；腎臟病變與金黃色葡萄球菌感染一致（圖5-K）；膿腫部位同樣增生大量纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（黃色箭頭）（圖5-L）。

圖5 分離菌感染小鼠病理切片（HE染色）Fig.5 Pathological sections of isolated bacteria-infected mice （HE staining）

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），兩種分離菌對(duì)幾種常用抗生素藥物均有較好的敏感性。大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星和多粘菌素B 敏感，對(duì)頭孢噻吩表現(xiàn)為耐藥。金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、紅霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、苯唑西林和利福平敏感。

表2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥物敏感性Table 2 Drug sensitivity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論

由于綿羊皮下膿腫病致病病原復(fù)雜且癥狀相似，難以通過臨診診斷為CLA 或其他細(xì)菌感染，為該病的防治帶來一定困難。本研究對(duì)甘肅省慶陽(yáng)地區(qū)湖羊皮下膿腫病的流行特點(diǎn)及致病病原進(jìn)行調(diào)查研究，以期對(duì)該地區(qū)及全國(guó)湖羊皮下膿腫病的防治措施制定提供依據(jù)。本研究得到湖羊皮下膿腫病的病情發(fā)病率與李鄉(xiāng)城［13］的研究結(jié)果相似，但調(diào)查結(jié)果顯示育肥羊場(chǎng)的發(fā)病率普遍高于繁育羊場(chǎng)。金黃色葡萄球菌與大腸桿菌在環(huán)境中廣泛存在，在養(yǎng)殖場(chǎng)中具有更高的帶菌率，感染造成人和動(dòng)物其他部位膿腫的病例也較常見［18-19］，當(dāng)出現(xiàn)如皮膚損傷等易感現(xiàn)象時(shí)極易造成皮下化膿感染［20-22］。由此推測(cè)育肥羊場(chǎng)發(fā)病率高于繁育羊場(chǎng)可能與短期育肥導(dǎo)致的亞急性瘤胃酸中毒引起的綿羊腸道屏障受損有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。16S微生物多樣性檢測(cè)結(jié)果顯示，6 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)病料具有共同的病原菌金黃色葡萄球菌，且種源關(guān)系接近，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)羊只市場(chǎng)流通頻繁，各養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)調(diào)引羊只疏于檢疫，可能是造成病原體在地區(qū)內(nèi)全面流行的風(fēng)險(xiǎn)因素。前人研究表明，羊皮下膿腫病以偽結(jié)核棒狀桿菌和金黃色葡萄球菌的單純感染和混合感染為主［23-26］，其他化膿性細(xì)菌感染散發(fā)［13-14］。本研究細(xì)菌分離鑒定結(jié)果表明6 份樣本均為金黃色葡萄球菌感染，另有3 份大腸桿菌的混合感染，并未檢測(cè)到偽結(jié)核棒狀桿菌，這與國(guó)外規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)的羊皮下膿腫病大多由偽結(jié)核棒狀桿菌引起的結(jié)果不同［27-29］，表明金黃色葡萄球菌也可造成類似于CLA 癥狀的膿腫病的廣泛流行，為國(guó)內(nèi)湖羊皮下膿腫病的防治研究補(bǔ)充了數(shù)據(jù)。

本研究動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種菌對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物具有致病性，解剖觀察可見金黃色葡萄球菌感染面積較大腸桿菌更大，出現(xiàn)膿腫病變更嚴(yán)重。小鼠內(nèi)臟器官病理變化主要以充血、出血、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，皮膚組織結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生廣泛炎癥，這與王銳鴻等［3］、韓曉芳［9］人工感染試驗(yàn)動(dòng)物的臨床與病理變化結(jié)果相似。藥敏試驗(yàn)顯示，大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星和多粘菌素B 4 種藥物敏感，對(duì)頭孢噻吩表現(xiàn)為耐藥；金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素等藥物均敏感。這與徐志豪等［7］、張斯旂等［12］有關(guān)金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗生素普遍耐藥的結(jié)果不同，說明該地區(qū)在治療該病時(shí)未長(zhǎng)期使用抗生素。根據(jù)本研究流行病學(xué)調(diào)查與致病原檢測(cè)結(jié)果，提出以下防治建議：在調(diào)引羊只時(shí)嚴(yán)格檢疫，阻止病原體流入；嚴(yán)格查群，對(duì)病羊及時(shí)隔離并進(jìn)行手術(shù)治療，在膿腫部位及全身配合敏感抗生素治療，手術(shù)場(chǎng)所需遠(yuǎn)離羊群；做好圈舍消毒和手術(shù)室消毒。

4 結(jié)論

本研究從病原學(xué)和流行病學(xué)兩方面對(duì)甘肅慶陽(yáng)地區(qū)湖羊皮下膿腫病的爆發(fā)進(jìn)行了調(diào)查研究。發(fā)現(xiàn)該地區(qū)湖羊皮下膿腫病發(fā)病率較高，繁殖場(chǎng)與育肥場(chǎng)發(fā)病率存在差異，地區(qū)內(nèi)流行病原菌存在同源性。研究確定了金黃色葡萄球菌是該病的主要病原菌，同時(shí)存在大腸桿菌的混合感染。手術(shù)配合抗生素治療病羊可見成效，地區(qū)疫病的防治需嚴(yán)格執(zhí)行程序化檢疫和消毒。