UHPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同采收期茶枝柑青皮中黃酮類成分

張戴英，何小芳，黃健晶，張英，吳孟華，曹暉，馬志國*（1.廣東大翔中藥制藥有限公司，廣州 51085；2.張戴英女職工創(chuàng)新工作室，廣州 51085；.暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心，廣州 511400）

青皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮，具有疏肝破氣、消積化滯的功效[1]。青皮中含有揮發(fā)油、黃酮類化合物、氨基酸、胺類、生物堿、有機(jī)酸等成分，其中以橙皮苷為代表的黃酮類成分是青皮的主要活性成分[2-3]，多采用HPLC法進(jìn)行分析[4-7]。文獻(xiàn)報(bào)道，采收期不同的個(gè)青皮與四花青皮中黃酮類成分、揮發(fā)油含量及組成均存在較大差異[8-12]。茶枝柑（Citrusreticulata‘Chachi’）是橘的眾多栽培品種之一，主產(chǎn)于廣東新會，為廣東道地藥材廣陳皮的基原植物，5月落果曬干為個(gè)青皮，俗稱“柑胎仔”；7～9月份采收未成熟的果實(shí)后將果皮縱向剖成4瓣，去除果籽果肉，曬干后即得四花青皮[13]，俗稱“柑青皮”，文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷在“柑胎仔”中的含量明顯高于“柑青皮”[14]，而其他成分與采收時(shí)間的相關(guān)性未見報(bào)道。本研究采用UHPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)定量方法，對不同采收期茶枝柑青皮的指紋圖譜和8個(gè)黃酮類成分含量進(jìn)行對比，為不同采收期茶枝柑青皮中黃酮類成分變化趨勢和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀（DAD檢測器）；XSR105/A十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多），F(xiàn)A 2204B 萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ單列兩孔恒溫水浴鍋（TAISITE儀器有限公司）；YF-高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精其儀器有限公司）。

1.2 試藥

蕓香柚皮苷（批號：Y-071-190329）、橙皮苷（批號：C-006-191012）、香蜂草苷（批號：X-034-181216）、甜橙黃酮（批號：T-046-190328）、川陳皮素（批號：C-015-180306）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮（批號：Q-113-191016）、桔皮素（批號：J-022-180730）（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于98.0%）；5-去甲川陳皮素（批號：wkq19021312，四川維客奇生物科技有限公司，純度大于98.0%）。乙腈（上海麥克林生化科技有限公司）、甲酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司）均為色譜純，水為純凈水[華潤怡寶飲料（中國）有限公司]，其余試劑均為分析純。

本研究收集了5月產(chǎn)的茶枝柑干燥幼果11批，曬干，為個(gè)青皮；7～9月采摘茶枝柑未成熟鮮果38批，加工為干燥的果皮，為四花青皮。詳見表1。

表1 樣品信息表Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取青皮樣品粉末0.2 g（過5號篩），精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理（700 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮、桔皮素和5-去甲川陳皮素對照品粉末適量，加入甲醇配成質(zhì)量濃度分別為149、334、61.6、15.4、62、16、60.8、15.7 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（B）-0.1%甲酸水（A），梯度洗脫（0～8 min：15%→45%B，8～12 min：45%→65%B，12～15 min：65%→15%B），檢測波長為283 nm或330 nm，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為2 μL。

2.4 UHPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品（QP-0501）粉末（過5號篩），按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.10%，相對峰面積的RSD均小于0.20%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（QP-0501）粉末（過5號篩），按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣測定，以2號峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于0.70%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批樣品（QP-0501）粉末（過5號篩）各6份，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備，進(jìn)樣測定，以2號峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.20%，相對峰面積RSD均小于2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立 取所有批次的樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。利用Agilent Chem Station 軟件將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出為“AIA”格式，并將5、7、8、9月份的青皮樣品所得的數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012）相似度軟件，生成各自的指紋圖譜及共有模式圖譜（見圖1、2）。

圖2 不同采收期青皮的共有模式圖Fig 2 Specific chromatograms of Canarh Fructus at different harvesting periods

2.4.5 共有峰的指認(rèn) 取混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。通過保留時(shí)間結(jié)合紫外光譜圖對指紋圖譜中的8個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為蕓香柚皮苷（1號峰）、橙皮苷（2號峰）、香蜂草苷（3號峰）、甜橙黃酮（4號峰）、川陳皮素（5號峰）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮（6號峰）、桔皮素（7號峰）、5-去甲川陳皮素（8號峰）。

從圖1、2可以看出，5月采收的青皮圖譜與另外3個(gè)月采收的青皮圖譜有明顯差異，而7～9月間的青皮圖譜變化不明顯；隨著生長期的增加，2號峰（橙皮苷）的相對峰高明顯降低，A區(qū)域的共有峰隨著月份的增加變化不明顯，需進(jìn)一步通過含量測定進(jìn)行分析比較。

2.4.6 相似度分析 將以上得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012）相似度軟件，計(jì)算各自的相似度，結(jié)果見表2。

表2 不同采收期青皮樣品相似度評價(jià)Tab 2 Similarity evaluation of Canarh Fructus at different harvesting periods

從表2可知，49批4個(gè)不同采收期（5、7、8、9月份）青皮的指紋圖譜相似度分別是0.996～1.000、0.972～1.000、0.985～1.000、0.984～1.000。相同采收期的青皮相似度均＞0.97，說明相同月份采摘的青皮之間質(zhì)量穩(wěn)定性較好。通過對比4個(gè)不同采摘月份的青皮的共有模式圖的相似度（見表3），發(fā)現(xiàn)7～9月采收的四花青皮相似度極高，而5月份采收的個(gè)青皮與四花青皮相似度＜0.78，相似度較低，表明不同成熟度的青皮質(zhì)量存在一定的差異。

表3 共有模式的相似度比較Tab 3 Similarity of shared patterns

2.5 青皮中8種黃酮類成分的含量測定

參考本課題組已建立的UHPLC法[15]，對不同采收期茶枝柑青皮的樣品中的8個(gè)黃酮類成分進(jìn)行定量分析。

2.5.1 含量測定 分別精密吸取“2.1”及“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對照品溶液2 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法測定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4、5。

表4 不同采收期青皮樣品8個(gè)成分含量測定結(jié)果(%)Tab 4 Content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

由表5可知，不同采收期的青皮樣品中各測定成分有不同程度的差異，采用單因素方差分析，對不同月份的8種成分含量進(jìn)行差異比較。結(jié)果表明，蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷和5-去甲川陳皮素的5月份的含量顯著高于7～9月份（P＜0.001）。甜橙黃酮5月份的含量明顯低于7～9月份（P＜0.001）。川陳皮素5月份的含量明顯低于7月份和8月份（P＜0.001），而9月份的川陳皮素含量低于8月份（P＜0.05）。3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮5月份的含量明顯低于7～9月份（P＜0.001），而且7月份的3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮含量顯著低于8月份（P＜0.01）。桔皮素在5月、7月、8月和9月的含量沒有顯著差異。

表5 不同采收期青皮中8個(gè)成分的含量平均值(%)Tab 5 Average content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

2.5.2 聚類分析 為比較不同采收時(shí)間青皮之間成分的差異，以各樣品中黃酮類成分含量測定結(jié)果為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ImageGP進(jìn)行熱圖聚類分析（見圖3）。由聚類分析結(jié)果可得，5月份采收的青皮可聚為一類，7、8、9月份的青皮聚為另一類，從熱圖可以看出5月份采收的個(gè)青皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷含量均高于其他月份采收的四花青皮，提示隨著采收時(shí)間的后推，黃酮苷類成分有降低的趨勢。

2.5.3 主成分分析 采用SIMCA 14.1軟件，以測得的8個(gè)黃酮類成分含量測得結(jié)果為變量，建立主成分分析模型，繪制主成分分析得分圖（見圖4）。結(jié)果可知，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為93.5%，其中第1主成分貢獻(xiàn)率為 68.8%，第2主成分貢獻(xiàn)率為24.7%。從所得的方差貢獻(xiàn)率來看，建立的模型累積解釋能力參數(shù)R2X和預(yù)測能力參數(shù)Q2分別為0.935 和 0.855，說明模型的區(qū)分度和預(yù)測程度都較好，前2個(gè)主成分已基本能反映出不同月份青皮樣品的主要特征。5月份采收的個(gè)青皮與7、8、9月份采收的四花青皮能顯著區(qū)分開來，個(gè)青皮與四花青皮在成分含量上存在明顯的差異；而7～9月采收的樣品并不能顯著分開，說明這3個(gè)月份采收的青皮黃酮類含量差異不明顯。主成分分析結(jié)果與熱圖聚類分析結(jié)果一致，提示青皮含有的黃酮類成分與采收時(shí)間具有一定的相關(guān)性。

圖4 不同月份青皮主成分分析圖Fig 4 Principal component analysis for different months

3 討論

3.1 不同采收期青皮的指紋圖譜

本研究建立了青皮藥材中黃酮類成分的UHPLC-DAD指紋圖譜，共標(biāo)定了8個(gè)共有峰，分別為蕓香柚皮苷（1號峰）、橙皮苷（2號峰）、香蜂草苷（3號峰）、甜橙黃酮（4號峰）、川陳皮素（5號峰）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮（6號峰）、桔皮素（7號峰）和5-去甲川陳皮素（8號峰）。采用UHPLC指紋圖譜法對不同采收期的青皮進(jìn)行相似度分析，發(fā)現(xiàn)相同月份采收的青皮樣品的指紋圖譜相似度均＞0.9，說明相同采收期的青皮樣品之間均一性相對較高、質(zhì)量相對較穩(wěn)定。5月份與其他月份的共有模式圖相似度均＜0.8，而7～9月采收的青皮的相似度極高。聚類分析與主成分分析均可將5月采收的樣品與7～9月采收的樣品分開，說明采收期是影響青皮質(zhì)量的關(guān)鍵因素，7～9月份采收的青皮質(zhì)量較穩(wěn)定。

3.2 不同采收期青皮的黃酮類成分含量

不同采收期青皮中8種黃酮類成分含量測定結(jié)果表明，7～9月的青皮中甜橙黃酮和3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黃酮的含量明顯高于5月；川陳皮素和桔皮素的含量隨著月份的增加變化不明顯；隨著生長期的增加，蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、5-去甲川陳皮素4種黃酮類成分顯著減少，其中以未成熟幼果入藥的個(gè)青皮（柑胎仔）含量最高，說明青皮中黃酮類成分的含量與生長期密切相關(guān)。