峰面積比值法分析混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的比例關(guān)系

牛青山溫文嬌潘永鋒王金換辛 陽(yáng)

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 遼寧 沈陽(yáng) 110000）

峰面積比值法分析混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的比例關(guān)系

牛青山1溫文嬌1潘永鋒2王金換1辛 陽(yáng)1

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 遼寧 沈陽(yáng) 110000）

探究混合DNA樣本擴(kuò)增前后二者混合比例變化情況。將DNA檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例混合，經(jīng)擴(kuò)增電泳激光掃面檢測(cè)分析，通過(guò)比較峰面積推算混合樣本擴(kuò)增后的比例，并與擴(kuò)增前的混合DNA樣本比例進(jìn)行比較?；旌螪NA經(jīng)擴(kuò)增后其混合比例基本保持不變。

混合DNA PCR-STR 峰面積比例

在法醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)分析中，對(duì)混合樣本的DNA檢驗(yàn)分析已成為熱點(diǎn)。目前對(duì)混合DNA檢材的檢驗(yàn)鑒定的難點(diǎn)是如何確定擴(kuò)增產(chǎn)物的基因座分型。由于沒(méi)有一種科學(xué)有效的方法，使混合DNA樣本的分型遇到很多困難。本文應(yīng)用已知標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品對(duì)混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與混合DNA的比例關(guān)系進(jìn)行研究。通過(guò)研究確認(rèn)，混合DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的峰面積與混合DNA存在正比例關(guān)系，為混合DNA檢材的基因座分型提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

DNA檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品9947A（女性） 與9948（男性）。

1.2 主要試劑與儀器

PowerPlex21 System（美國(guó)），9700型擴(kuò)增儀（ABI公司，美國(guó)），3130XL型序列分析儀（ABI公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 分組

將初始濃度為10ng/μL的9947A和9948分別稀釋至濃度為0.5ng/μL，按照9947A∶9948為1∶1、1∶3、1∶4、1∶9、1∶19的比例配置濃度梯度樣本組。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

用9700型擴(kuò)增儀擴(kuò)增，體系10μL，其中分別取1μL和2μL DNA模板量進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)選用28和29個(gè)循環(huán)分別進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)用3130XL序列分析儀電泳，結(jié)果用GenemapperID-X軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

9947A和9948混合樣品擴(kuò)增產(chǎn)物在D3S1358、D1S1656、PentaE、D18S51、CSF1P0、TH01、D12S391、D19S433、FGA9個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)出3峰狀態(tài)。我們將同一位點(diǎn)的峰根據(jù)峰面積大小依次定義為1、2、3號(hào)峰，其中1號(hào)峰稱之為大峰，2、3號(hào)峰稱之為小峰。通過(guò)已知基因型，我們已知PentaE與D1S1656均為純合子與雜合子的混合，其余7個(gè)位點(diǎn)為雜合子與雜合子的混合，因此，將這兩種混合類型分別進(jìn)行觀察討論。我們通過(guò)觀察計(jì)算比較9個(gè)位點(diǎn)的等位基因峰面積情況，得出下列結(jié)果。

2.1 不同體積DNA模板混合時(shí)，2、3號(hào)峰面積與1號(hào)峰面積比

混合DNA模板量為1μL時(shí)，擴(kuò)增后各基因座上2、3號(hào)峰面積和與1號(hào)峰面積的比值，如表1所示。DNA混合樣本比例為1∶1～1∶19時(shí)，其2、3號(hào)峰面積和與1號(hào)峰面積的比值分布在1.02～1.63之間，平均值分布于 1.12～1.26之間，方差分布于0.007～0.047之間。

表1 DNA模板量為1μL時(shí)各基因座上2、3號(hào)峰面積和與1號(hào)峰面積之比

混合DNA模板量為2μL時(shí)，擴(kuò)增后各基因座上2、3號(hào)峰面積和與1號(hào)峰面積的比值，如表2所示。DNA混合樣本比例為1∶1～1∶19時(shí)，其2.3號(hào)峰和與1號(hào)峰的比值分布在1.00～1.31之間，平均值分布于1.08～1.13之間，方差分布于0.001～0.017之間。

表2 DNA模板量為2μL時(shí)各基因座上2、3號(hào)峰面積和與1號(hào)峰面積之比

2.2 不同體積DNA模板混合時(shí)，2、3號(hào)峰面積比

混合DNA模板量為1μL時(shí)，擴(kuò)增后各基因座上2、3號(hào)峰面積的比值，如表3所示。DNA混合樣本比例為1∶1～1∶19時(shí)，其2、3號(hào)峰比值分布在1.05～18.27之間，平均值分布于1.20～13.50之間，方差分布于0.03～11.857之間。

表3 DNA模板量為1μL時(shí)各基因座上2、3號(hào)峰面積之比

混合DNA模板量為2μL時(shí)，擴(kuò)增后各基因座上2、3號(hào)峰面積的比值，如表4所示。DNA混合樣本比例為1∶1～1∶19時(shí)，其倆小峰比值分布在1.03～19.39之間，平均值分布于1.21～14.05之間，方差分布于0.018～27.177之間。

表4 DNA模板量為2μL時(shí)各基因座上2、3號(hào)峰面積之比

2.3 混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和GenemapperIDX分析后，PentaE與D1S1656位點(diǎn)上2、3號(hào)峰面積與1號(hào)峰面積比較

混合DNA模板量為1μL時(shí)，擴(kuò)增后各基因座上2、3號(hào)峰面積與1號(hào)峰面積的比值，如表5所示。DNA混合樣本比例為 1∶1～1∶19時(shí)，PentaE與D1S1656位點(diǎn)上2、3號(hào)峰和與1號(hào)峰的比值分別分布在1.15～10.82、1.04～1.44之間，2、3號(hào)峰之比分別在1.14～4.96、1.23～30.50之間變化。

混合DNA模板量為2μL時(shí)，DNA混合樣本比例為1∶1～1∶19時(shí)，PentaE與D1S1656位點(diǎn)上2、3號(hào)峰和與 1號(hào)峰的比值分別分布在 1.11～14.82、1.05～1.24之間，2、3號(hào)峰之比分別在1.08～3.90、1.22～11.56之間變化。

表5 PentaE與D1S1656位點(diǎn)2、3號(hào)峰面積與1號(hào)峰面積比較

2.4 混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和GenemapperIDX分析后，X、Y位點(diǎn)上峰面積

混合DNA樣本擴(kuò)增后X、Y位點(diǎn)上峰面積的比值，如表6所示?；旌螪NA樣本比例為11時(shí)，X、Y的峰面積比值分布于2.76～4.59之間；混合DNA樣本比例為1∶3時(shí)，X、Y的峰面積比值分布于1.46～3.12之間；混合DNA樣本比例為1∶4時(shí)，X、Y的峰面積比值分布于1.13～1.67之間；混合DNA樣本比例為1∶9時(shí)，X、Y的峰面積比值分布于1.00～1.41之間；混合DNA樣本比例為1∶19時(shí)，X、Y的峰面積比值分布于0.92～1.38之間。

表6 擴(kuò)增后X、Y的峰面積之比

3 討論

本次試驗(yàn)在排除stutter帶影響的前提下，研究了混合DNA擴(kuò)增產(chǎn)物及基因座的電泳峰與混合比例的關(guān)系。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在某一位點(diǎn)為純合子與雜合子的混合，且沒(méi)有共同位點(diǎn)時(shí)，三個(gè)峰的峰面積的比值隨混合DNA樣本比例的改變而改變，并與初始混合比例近似相等。在系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)其他位點(diǎn)比例關(guān)系的條件下，可以確定混合樣品的基因分型。例如，結(jié)合其他位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，1號(hào)峰為純合子來(lái)自一個(gè)個(gè)體，2、3號(hào)峰為雜合子來(lái)源于另一個(gè)體。

當(dāng)某一位點(diǎn)為雜合子與雜合子的混合，且有共同位點(diǎn)時(shí)，2、3號(hào)峰面積之和與1號(hào)峰面積的比值不隨DNA混合樣本比例的改變而改變，近似等于1，那么可以推斷該位點(diǎn)為雜合子與雜合子的混合，且1號(hào)峰為兩者共有，2、3號(hào)峰分別來(lái)自于兩個(gè)不同的個(gè)體。此時(shí)2、3號(hào)峰的比值隨DNA混合樣本比例的改變而改變，并與初始混合比例近似相等。

在混合DNA樣本比例1∶1時(shí)，2、3號(hào)峰的比率在1.20～1.26之間變化；在混合DNA樣本比例為1∶3時(shí)，2、3號(hào)峰的比率在1.26～4.10之間變化；在混合DNA樣本比例1∶4時(shí)，2、3號(hào)峰的比率在3.47～5.62之間變化；在混合DNA樣本比例為1∶9時(shí)，2、3號(hào)峰的比率在7.37～8.95之間變化；在混合DNA樣本比例 1∶19時(shí)，2、3號(hào)峰的比率在13.48～19.22之間變化。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以看出，在混合 DNA樣本比例在 1∶1～1∶19時(shí)，擴(kuò)增后D3S1358等7個(gè)位點(diǎn)上，2、3號(hào)峰的比率均接近于初始比例。因此當(dāng)混合DNA為雜合子與雜合子的混合形式時(shí)，我們可以用兩個(gè)小峰的峰面積來(lái)估算擴(kuò)增后混合DNA的比例。

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（責(zé)任編輯：于 萍）

DF795.2

A

2014-09-15

牛青山（1964-），男，山東濟(jì)南人，中國(guó)刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系教授，碩士，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。