陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜研究*

邱盼子，肖作奇，潘 濤，黃 懿，黃 濤，歐陽(yáng)波

（湖南省婦幼保健院，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

陰炎凈洗液是湖南省婦幼保健院臨床應(yīng)用二十余年的中醫(yī)婦科制劑，由黃連、黃柏、苦參、蒲公英、龍膽、連翹、地膚子等9味中藥材配伍而成。全方組成結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)，黃連、黃柏均具有瀉火燥濕、解毒殺蟲之功效，二者同用，共清中下焦之濕熱，共為方中君藥[1-5]；苦參，大苦大寒，退熱泄降，蕩滌濕火，其燥尤烈，故能殺濕熱所生之蟲，為方中臣藥[6-8]；并佐以其余6味清熱燥濕藥，具有清熱解毒、消炎止痛、殺蟲止癢、消腫止痛之功效[9-18]，主要用于霉菌、滴蟲及細(xì)菌引起的陰道炎、宮頸炎、外陰瘙癢、濕疹及淋病的輔助治療。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》僅采用個(gè)別指征性成分的含量來(lái)對(duì)中藥材或中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，但中藥是以多成分作為一個(gè)整體來(lái)發(fā)揮藥效的，僅對(duì)幾個(gè)成分進(jìn)行定性或定量控制難以全面評(píng)價(jià)中藥材或中藥制劑的質(zhì)量特征?；谥兴幷w質(zhì)量控制觀，本研究選用10批陰炎凈洗液中藥飲片制備陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用HPLC-DAD法建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并對(duì)13種主要成分進(jìn)行了指認(rèn)，可為陰炎凈洗液的整體質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent HP 1260型HPLC儀，包括G13222在線脫氣機(jī)、G1312B二元泵、G1316A柱溫箱、G1379B DAD檢測(cè)器、Agilent Open Lab化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；TDZ4低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。對(duì)照品信息見(jiàn)表1 。

表1 對(duì)照品信息

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；磷酸、磷酸二氫鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。所有中藥飲片均購(gòu)自湖南省衡東縣中藥飲片廠，由湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部潘濤副主任中藥師鑒定為正品。10批次中藥飲片批號(hào)見(jiàn)表2。

表2 10 批次中藥飲片批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACE EXCEL C18-AR色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（B）：10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（A），流速：1.0 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相梯度為：0～8 min：95%A；8～20 min：95～84%A；26～30 min：84%～70%A；30～45 min：70%A；45～50 min：70%～15%A；50～55 min：15%A；57～60 min：95%A。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別取苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、地膚子皂苷Ic和蛇床子素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含213.2、234.0、143.4、201.6、212.6、205.6、211.0、209.2、212.2、203.8、206.6、2 086.0、46.3 μg的溶液，即得。分別取適量苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、地膚子皂苷Ic和蛇床子素于容量瓶中，用甲醇定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，制得含有13種成分的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 按照處方量（共364 g）精密稱取藥材置不銹鋼鍋中，參考《湖南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》，加2 944 mL（8倍）水浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火煎煮45 min，濾過(guò)得藥液；殘余藥渣再加2 184 mL（6倍）水煎煮45 min，使用布氏漏斗過(guò)濾，合并2次濾液，減壓濃縮（60 ℃），轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用純凈水定容至1 000 mL，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液。

2.2.3 單味藥材溶液的制備 按照處方量分別稱取陰炎凈洗液?jiǎn)挝端幉模础?.2.2”項(xiàng)下樣品制備方法制備各單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.9%，相對(duì)峰面積RSD均小于1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.5%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.1%，表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液6份，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.3%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 參照峰的選擇 在標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液色譜峰中，連翹酯苷A峰（30號(hào)峰）峰面積最大，保留時(shí)間適中，分離度好，故選為參照峰。

2.4.2 指紋圖譜的建立 按“2.2.2”項(xiàng)下陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備10個(gè)不同批次的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”進(jìn)行多點(diǎn)校正，然后匹配生成對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖1），確定有53個(gè)共有峰，10批陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜比較相似度均大于0.950（見(jiàn)表3），表明不同批次中藥飲片的化學(xué)成分及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法比較穩(wěn)定。

圖1 10 批次陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑疊加指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

表3 10 批次陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

2.4.3 色譜峰歸屬分析 結(jié)合陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和各單味藥材供試品溶液的色譜圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4、5、10、11、14、28、29、30、35、36、45、46、47、48、49號(hào)峰來(lái)源于苦參；2、8、15、18、24、25、29、34、36、41、44、46、47、52 號(hào)峰來(lái)源于蒲公英；17、19、29、31、32、33、46、47號(hào)峰來(lái)源于龍膽；2、6、7、12、13、14、17、20、21、23、25、26、27、29、30、32、33、34、36、42、44、46、47、48號(hào)峰來(lái)源于黃柏；2、6、12、26、28、29、30、33、35、36、38、40、43、51、52號(hào)峰來(lái)源于連翹；3、4、9、16、17、22、23、27、28、30、33、35、38、39、41、42、44、47、51、52號(hào)峰來(lái)源于黃連；47、48、50號(hào)峰來(lái)源于地膚子；47、48、52、53號(hào)峰來(lái)源于蛇床子；1、9、14、15、16、17、20、32、33、34、37、47、49號(hào)峰來(lái)源于百部。其中2號(hào)峰為蒲公英、黃柏、連翹共有；4號(hào)峰為苦參、黃連共有；6號(hào)峰為黃柏、連翹共有；9號(hào)峰為黃連、百部共有；12號(hào)峰為黃柏、連翹共有；14號(hào)峰為苦參、黃柏、百部共有；16號(hào)峰為黃連、百部共有；17號(hào)峰為龍膽、黃柏、黃連、百部共有；20號(hào)峰為黃柏、百部共有；23號(hào)峰為黃連、黃柏共有；25號(hào)峰為蒲公英、黃柏共有；26號(hào)峰為黃柏、連翹共有；27號(hào)峰為黃柏、黃連共有；28號(hào)峰為苦參、連翹、黃連共有；29號(hào)峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏、連翹共有；30號(hào)峰為苦參、黃柏、連翹、黃連共有；32號(hào)峰為龍膽、黃柏、百部；33號(hào)峰為龍膽、黃柏、連翹、黃連、百部共有；34號(hào)峰為蒲公英、黃柏、百部共有；35號(hào)峰為苦參、連翹、黃連共有；36號(hào)峰為苦參、蒲公英、黃柏、連翹共有；38號(hào)峰為連翹、黃連共有峰；41號(hào)峰為蒲公英、黃連共有；42號(hào)峰為黃柏、黃連共有；44號(hào)峰為蒲公英、黃柏、黃連共有；46號(hào)峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏共有；47號(hào)峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏、黃連、地膚子、蛇床子、百部共有；48號(hào)峰為苦參、黃柏、地膚子、蛇床子共有；49號(hào)峰為苦參、百部共有；51號(hào)峰為連翹、黃連共有；52號(hào)峰為蒲公英、連翹、黃連、蛇床子共有。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液比對(duì)分析，可確定其中13種成分：5號(hào)峰為苦參堿、10號(hào)峰為氧化苦參堿、18號(hào)峰為咖啡酸、19號(hào)峰為龍膽苦苷、23號(hào)峰為黃柏堿、30號(hào)峰為連翹酯苷A、39號(hào)峰為表小檗堿、40號(hào)峰為連翹苷、41號(hào)峰為黃連堿、42號(hào)峰為巴馬汀、44號(hào)峰為小檗堿、50號(hào)峰為地膚子皂苷Ic、53號(hào)峰為蛇床子素?；旌蠈?duì)照品溶液、陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和單味藥材溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品溶液、陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和單味藥材溶液色譜圖

3 討 論

本研究考察了Agilent C18、Thermo Hypersil GOLD C18和ACE EXCEL C18-AR 3種色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，采用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰數(shù)較少，峰形較差；采用Agilent C18色譜柱時(shí)，色譜峰數(shù)較多，但個(gè)別化合物色譜峰分離效果差，峰形差；采用ACE EXCEL C18-AR色譜柱時(shí)，色譜峰數(shù)目多，各目標(biāo)化合物的分離效果和峰形均較好，故本研究最終采用ACE EXCEL C18-AR色譜柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

此外，本研究還考察了不同流動(dòng)相體系（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液）的洗脫能力，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸水溶液時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰多、信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)，但峰形不好，個(gè)別化合物峰出現(xiàn)分裂；采用乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰數(shù)多且分離效果好。

根據(jù)文獻(xiàn)資料[19-22]，苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、蛇床子素分別在220、220、327、277、220、330、345、220、238、345、265、322 nm處有最大吸收。文獻(xiàn)報(bào)道[23]地膚子皂苷Ic多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，本研究采用紫外檢測(cè)器在低波長(zhǎng)處（215 nm）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，可獲得良好的峰形和響應(yīng)。綜合比較上述9個(gè)波長(zhǎng)，最終選擇可測(cè)定的色譜峰數(shù)多、分離度好及峰響應(yīng)值較大的215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和《湖南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》，考察了兩種不同的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法，并分別計(jì)算出膏率。第一種制備方法平均出膏率為8.76%，第二種制備方法平均出膏率為11.02%，故本研究選擇第二種方法制備陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

本研究建立的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、可靠，可用于陰炎凈洗液的質(zhì)量控制。