過表達(dá)及敲減LncRNA RP11-521C20.3 的非小細(xì)胞肺癌A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

李春桃，張雪梅，蘇琰迪，張劍青

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是基因易感患者在接觸有害的氣體或顆粒后出現(xiàn)氣道和/或肺泡異常，最終出現(xiàn)呼吸道癥狀，如慢性咳嗽、咳痰、胸悶、氣促；胸部CT 影像提示肺部肺氣腫征象；肺功能檢測提示阻塞性通氣功能障礙；最終導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降、致殘致死等不良結(jié)局，目前COPD 已成為全球死亡和住院的主要原因[1]。目前研究報(bào)道人類基因中只有1.5%左右的基因編碼蛋白質(zhì)，其它大量基因轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）本身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但可以抑制或增強(qiáng)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[2]，從多個(gè)層面參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)生的生理過程，也可參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等病理過程[3]。

lncRNAs 已經(jīng)被證實(shí)在COPD 發(fā)病過程中扮演了重要的角色[4-6]，但其在COPD 中的具體表達(dá)及其生物學(xué)功能仍未完全詮釋清楚，本課題組前期基因芯片的結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA RP11-521C20 與BMF mRNA 有負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能在BMF 的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯上有重要作用。另采用RT-qPCR 技術(shù)檢測吸煙COPD 合并肺癌及無COPD 肺癌的遠(yuǎn)癌肺組織中基因表達(dá)量，結(jié)果顯示吸煙COPD 并肺癌患者肺組織中的BMF mRNA 表達(dá)量高于無COPD 肺癌者，相反lncRNARP11-521C20.3 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)大鼠COPD 模型的肺組織檢測結(jié)果也證實(shí)了該表達(dá)關(guān)系，通過mRNA 和lncRNA 基因芯片的結(jié)果，分析lncRNA RP11-521C20.3 與BMF 的共表達(dá)關(guān)系，結(jié)果顯示兩者存在負(fù)相關(guān)[7]。據(jù)既往研究BMF 在細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用[8]，而lncRNA RP11-521C20.3 則是調(diào)控其表達(dá)的重要分子，這提示lncRNA RP11-521C20.3可能在COPD 的細(xì)胞凋亡機(jī)制中起重要作用。肺泡上皮細(xì)胞是肺的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞，具有分泌肺表面活性物質(zhì)、進(jìn)行氣體交換等作用。肺泡上皮細(xì)胞凋亡在COPD 的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的作用，肺泡間隔內(nèi)肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行性凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)丟失可導(dǎo)致肺泡腔擴(kuò)大、肺泡間隔變薄，形成了COPD 的肺氣腫表現(xiàn)[9-13]。本研究擬構(gòu)建lncRNA RP11-521C20.3慢病毒過表達(dá)及敲減質(zhì)粒，包裝病毒后構(gòu)建lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)及敲減A549 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究lncRNA RP11-521C20.3在COPD 肺泡上皮細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制提供開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

A549 和293T 細(xì)胞購自賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑購自Solarbio 公司；Ham's F-12K 購自于Procell 公司；胎牛血清購自于Sigma 公司；嘌呤霉素購自于Beyotime 公司；PBS 1×、0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）、2xSYBR Green qPCR Master mix、Servicebio RT First Strand cDNA Synthesis Kit 購自于Serivicebio 公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑購自Solarbio 公司；FastQuant RT Kit 購自TIANGEN 公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿購自西隴化工公司；限制性內(nèi)切酶SbfI/EcoRI、限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ購自天根生化科技（北京）有限公司；RP11-521C20抗體購自ABCAM 公司；GAPDH 抗體購自ABCAM 公司；PCR 儀購自Applied Biosystems 公司；凝膠成像分析儀購自培清科技公司；冷凍高速離心機(jī)購自ThermoFisher 公司；倒置顯微鏡購自Questar 公司；倒置熒光顯微鏡購自Mshot 公司；臺式低速離心機(jī)購自可成儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體構(gòu)建（1）PCR 擴(kuò)增引物序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索目的基因的mRNA 序列，選擇其CDS 序列采用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。獲得目的基因的上下游引物后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用Primer-BLAST 在線工具進(jìn)行引物特異性檢測，檢測合格的引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LncRNA RP11-521C20.3 PCR 擴(kuò)增引物序列步驟，見表1。

表1 LncRNA RP11-521C20.3 PCR 擴(kuò)增引物序列步驟Tab.1 LncRNA RP11-521C20.3 PCR amplification primer sequence

（2）LncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)慢病毒重組載體構(gòu)建。采用SbfI/EcoRI 限制性內(nèi)切酶對過表達(dá)載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系，見表2。

表2 過表達(dá)重組載體構(gòu)建酶切反應(yīng)體系Tab.2 Enzyme digestion reaction system for construction of overexpressed recombinant vectors

將上述試劑及材料混合，水浴鍋（37℃）孵育2 h 以上。瓊脂糖凝膠電泳用于檢測酶切產(chǎn)物的效果，瓊脂糖凝膠電泳后將目標(biāo)載體條帶從凝膠上切下，回收凝膠。構(gòu)建重組質(zhì)粒（并設(shè)計(jì)1 組不含lncRNA RP11-521C20.3 片段的質(zhì)粒作為對照組）。反應(yīng)體系，見表3，過表達(dá)質(zhì)粒圖譜，見圖1。

表3 過表達(dá)重組質(zhì)粒反應(yīng)體系Tab.3 Overexpressed recombinant plasmid reaction system

將上述試劑混合均勻，37℃孵育30 min，置于冰上5 min。將適量反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，取適量菌液均勻涂抹于含氨芐青霉素的平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取1 μL 作為模板進(jìn)行菌落PCR 鑒定。鑒定引物：Forward：5′-CCAGATCTGTTGACCAACT TTCAAGAGAAGTTGGTCAACAGATCTGG-3′，Reverse：5′-CCAGATCTGTTGACCAACTTCTCTTGAAAG TTGGTCAACAGATCTGG-3′。鑒定反應(yīng)體系，見表4。PCR 反應(yīng)（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃1 min/kb，循環(huán)30 次）。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取陽性克隆轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化，挑菌，質(zhì)粒抽提，并測序。目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，RTqPCR 檢測表達(dá)。

表4 過表達(dá)重組質(zhì)粒鑒定體系Tab.4 Identification system of overexpressed recombinant plasmid

（3）慢病毒包裝及滴度測定。轉(zhuǎn)染前24 h，將293T 細(xì)胞以5×106細(xì)胞數(shù)/15 mL 接種到10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%后，在滅菌的離心管中加入試劑，見表5。室溫溫育15 min，然后將上述混合液加至293 T 細(xì)胞的培養(yǎng)基中，充分混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)箱（5% CO2，37 ℃）6 h，換新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染48 h，收集上清液，進(jìn)行離心（半徑5 cm，4 000 r/min，4 ℃，10 min），采用0.45 μm濾器過濾上清液后，于40 mL 超速離心管中進(jìn)行離心（25 000 r/min，離心半徑12 cm，離心120 min），棄上清液，加病毒保存液，充分溶解后再次離心（10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min），上清液分裝于試管中，-80℃保存。

表5 慢病毒包裝試劑Tab.5 Lentivirus packaging reagent

1.2.2 LncRNA RP11-521C20.3 慢病毒敲減重組載體構(gòu)建（1）合成lncRNA RP11-521C20.3 shRNA 序列。根據(jù)lncRNA RP11-521C20.3（Gene ID：NM_005082.5）序列設(shè)計(jì)了shRNA 序列并進(jìn)行合成設(shè)計(jì)，序列信息，見表6。

表6 shRNA 序列Tab.6 shRNA sequence

（2）LncRNA RP11-521C20.3 shRNA 載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)好siRNA 靶點(diǎn)，進(jìn)行引物合成。用寡糖退火緩沖液將合成的寡核苷酸溶解于20 μM 溶液中，每條互補(bǔ)單鏈30 μL。然后將低聚核苷酸混合物在95℃的水浴鍋中加熱5 min，打開并在室溫下自然冷卻，形成雙鏈低聚核苷酸片段。載體pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 進(jìn)行AgeI 和EcoRI 雙酶切，酶切反應(yīng)體系，見表7，敲減表達(dá)質(zhì)粒圖譜，見圖2。

圖2 LncRNA RP11-521C20.3 敲減表達(dá)質(zhì)粒圖譜Fig.2 LncRNA RP11-521C20.3 knockdown expression plasmid map

表7 敲減載體構(gòu)建酶切反應(yīng)體系Tab.7 Enzyme digestion reaction system for knockdown vector construction

將上述試劑混合，37℃水浴鍋孵育2 h 以上。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳后將目標(biāo)載體條帶從凝膠中切斷，進(jìn)行膠回收。敲除片段連接到表達(dá)載體上，在16℃下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子于10 μL LB 培養(yǎng)液中，取1 μL 進(jìn)行菌落PCR 鑒定。反應(yīng)體系和PCR 循環(huán)條件，見表8。進(jìn)行PCR 反應(yīng)（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min/kb。共30 個(gè)循環(huán)）。對菌落鑒定得到的陽性克隆進(jìn)行測序和驗(yàn)證。

表8 敲減重組體PCR 鑒定體系Tab.8 Knock-down recombinant PCR identification system

（3）慢病毒包裝。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞并接種于10 cm 培養(yǎng)皿，6 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h。將上清液離心（4 000 r/min，4 ℃，離心半徑5 cm）。對濃縮病毒溶液進(jìn)行過濾、收集和包裝。將包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后檢測病毒滴度。

1.2.3 慢病毒感染A549 細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立在6 孔板中接種約1×105個(gè)細(xì)胞/孔（次日細(xì)胞融合達(dá)到30%～40%）。本次實(shí)驗(yàn)MOI（感染復(fù)數(shù)推薦值w 為5。根據(jù)公式：病毒體積（μL）=細(xì)胞數(shù)×MOI/滴度（TU/mL）×1 000，即慢病毒添加量為：2.5/孔。加入病毒后混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后12 h 細(xì)胞形態(tài)良好，未發(fā)生不良反應(yīng)，感染后24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于感染48 h、72 h、96 h 后在熒光顯微鏡下觀察并作圖。根據(jù)分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)過表達(dá)/敲減慢病毒。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入2 μg/mL 嘌呤霉素清除未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及已轉(zhuǎn)染表達(dá)不正常的細(xì)胞。

1.2.4 RT-qPCR 檢測lncRNA RP11-521C20.3的表達(dá)取細(xì)胞樣品，按照說明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測，PCR 體系為：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，正反義鏈均各0.4 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL，95℃30sec，1 個(gè)循環(huán)進(jìn)行預(yù)變性；95℃ 15sec，60℃30sec，40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism7300 SDS Software。lncRNA RP11-521C20.3 正向引物為5′CCCTGCTTTGGGGTTGT GA-3′，反向引物為 5′-GGAGGCTTTGTGGCTTGCT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 處理分析數(shù)據(jù)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA RP11-521C20.3 重組載體構(gòu)建及鑒定

以人胚腎293 細(xì)胞cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到全長lncRNA RP11-521C20.3 片段。載體pcSLenti-pA-MCS-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE 用SbfI/EcoRI 內(nèi)切酶酶切后與lncRNA RP11-521C20.3 目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序結(jié)果顯示，質(zhì)?；蛐蛄信c目的基因序列一致，見圖3。

圖3 lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 overexpressed recombinant plasmid

設(shè)計(jì)并合成了siRNA 核苷酸序列。將載體pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 用AgeI 和EcoRI 雙酶切，與經(jīng)過退火獲得的目的片段shRNA 連接并過夜，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑菌，質(zhì)粒抽提，測序鑒定，結(jié)果顯示插入的片段序列與設(shè)計(jì)合成的靶向lncRNA RP11-521C20.3 核苷酸序列一致，見圖4。

圖4 lncRNA RP11-521C20.3 敲減重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 knockdown recombinant plasmid

2.2 慢病毒包裝及滴度測定

對構(gòu)建好的lncRNA RP11-521C20.3 重組載體進(jìn)行包裝，包裝后的慢病毒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，進(jìn)行病毒滴度檢測。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染72 h，100×熒光顯微鏡下可觀察到293T 細(xì)胞熒光數(shù)量明顯增加，見圖5。計(jì)算轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)、病毒稀釋倍數(shù)、稀釋后的病毒體積和每個(gè)基因組整合的平均病毒拷貝數(shù)，并計(jì)算病毒滴度。其中pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFPP2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3 過表達(dá)）滴度為：5.91E+08（Tu/mL），pcSLenti-pA-MCS–CMVSFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3 過表達(dá)對照）滴度為：6.64E+08（Tu/mL），pSLenti-U6-shRNA（RP11-521C20.3）-CMV-EGFP-F2APuro-WPRE（RP11-521C20.3 敲減）滴度為：5.34E +08（Tu/mL）。各慢病毒的滴度均大于1.0E +08（Tu/mL），能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖5 293T 細(xì)胞中慢病毒滴度檢測熒光圖片（100×）Fig.5 Fluorescent image of lentivirus titer detection in 293T cells（100×）

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選及鑒定

2.3.1 LncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選及鑒定將過表達(dá)lncRNA RP11-521C20.3 的慢病毒載體感染A549 細(xì)胞，在感染后24 h、48 h、72 h 在100×熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并收集明場圖像和熒光圖像。結(jié)果表明lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)的慢病毒感染A549 細(xì)胞72 h 后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大于90%，可以驗(yàn)證lncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)水平，見圖6。

圖6 LncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞明場圖像和熒光圖像（100×）Fig.6 LncRNA RP11-521C20.3 overexpressed lentiviral vector transfected A549 cells with bright field image and fluorescence image（100×）

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后RP11-521C20.3 表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染96h 后收集細(xì)胞樣品進(jìn)行RT-qPCR 檢測。結(jié)果表明，OV-lncRNA RP11-521C20.3 組的lncRNA RP11-521C20.3 基因mRNA 表達(dá)量高于NC-lncRNA RP11-521C20.3 組（P<0.001），差異倍數(shù)為（20.43±0.69），見圖7。

圖7 RT-qPCR 檢測A549 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中l(wèi)ncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)量Fig.7 The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain was detected by RT-qPCR

2.3.2 LncRNA RP11-521C20.3 敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選及鑒定分別用構(gòu)建好的lncRNA RP11-521C20.3 敲減的慢病毒載體，感染A549 細(xì)胞，感染后24 h、48 h、72 h 在100×熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并采集明場圖像和熒光圖像。結(jié)果表明：lncRNA RP11-521C20.3 敲減的慢病毒感染A549 細(xì)胞72 h 后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大于90%，可以進(jìn)行一步驗(yàn)證lncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)水平，見圖8。

圖8 RP11-521C20.3 敲減慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞明場圖像和熒光圖像（100×）Fig.8 RP11-521C20.3 knockdown virus vector transfected A549 cells bright field image and fluorescence image（100×）

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后lncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染96 h 后收集細(xì)胞樣品進(jìn)行RT-qPCR 檢測。結(jié)果表明，sh-lncRNA RP11-521C20.3 組的lncRNA RP11-521C20.3 基因mRNA 表達(dá)量低于sh-NC 組（P<0.001），差異倍數(shù)為（0.21±0.08），見圖9。

圖9 RT-qPCR 檢測A549 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中l(wèi)ncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)量Fig.9 The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain detected by RT-qPCR

3 討論

lncRNAs 因其在調(diào)節(jié)多種生物過程中的作用而備受關(guān)注，其可以通過靶向mRNAs 調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程，如增殖、凋亡、炎癥、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，借此來調(diào)節(jié)慢性氣道疾病的發(fā)生和進(jìn)展[14-15]。多研究[16-18]提示COPD 患者較健康者存在大量lncRNAs 差異表達(dá)，且在COPD 的相關(guān)發(fā)病機(jī)制如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥、肺功能受損中具有重要作用。Tang 等[16]對COPD 和健康對照肺組織進(jìn)行l(wèi)ncRNAs 基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的lncRNAs 有5，094 個(gè)，其中TUG1、BC038205、MEG3、LOC646329 和BC13059 顯著增加，SNHG5、LOC729178、LINC00229、LOC339529和PLAC 顯著減少，敲除lncRNA TUG1 可通過抑制纖維連接蛋白和α-SMA 的表達(dá)水平促進(jìn)HFL1 和BEAS-2B 細(xì)胞增。Gu 等[19]發(fā)現(xiàn)lncRNA可能通過介導(dǎo)SIRT1/FoxO3a 和SIRT1/p53 信號通路，調(diào)控COPD 患者AEC II 的細(xì)胞衰老。CNVR_3425.1 通過抑制lncRNA FENDRR 水平，從而增加中國人群肺癌和COPD 的罹患風(fēng)險(xiǎn)[20]。lncRNA 在COPD 病理生理過程中的炎癥反應(yīng)和肺功能受損中發(fā)揮重要關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)lnc-IL7R 表達(dá)降低不僅與氣道上皮細(xì)胞的炎癥有關(guān)，且能夠預(yù)測肺功能受損、COPD 惡化/加重[6]。Bi等[17]選取非COPD 吸煙者、COPD 吸煙者和健康不吸煙者的肺組織行全基因組lncRNAs 分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)RNA175876|ENST00000554946 的表達(dá)可能影響炎癥反應(yīng)的過程。運(yùn)動對COPD 引起膈肌功能障礙的防治具有積極作用，劉等[21]對其進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動可以降低COPD 誘導(dǎo)的lncRNA H19 表達(dá)，從而抑制lncRNA H19 通過靶向miR-181/PDCD4 軸促進(jìn)與煙霧相關(guān)的慢性阻塞性肺病的進(jìn)展。lncRNA CASC2 過表達(dá)可減輕香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，血清CASC2 在重度COPD 患者中過表達(dá)，且與非COPD 吸煙者相比，COPD 患者血清中CASC2 降低，與FEV1 呈正相關(guān)[22]。Lnc-NEAT1 的表達(dá)與GOLD 分期及IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 水平呈正相關(guān)，在COPD 急性加重期患者中最高，其次是COPD 期患者和健康人群[18]。

慢病毒載體可以有效地將外源shRNA 或外源基因整合到宿主染色體中，長期表達(dá)目的基因序列，顯著提高目的shRNA 或目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而實(shí)現(xiàn)目的shRNA 或目的基因的穩(wěn)定、長期表達(dá)[23]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，與非COPD 吸煙組相比，COPD 組的lncRNA RP11-521C20.3 表達(dá)下調(diào)，因此本研究擬構(gòu)建lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)及敲減的A549 細(xì)胞株，為研究lncRNA 在COPD 的凋亡機(jī)制中的具體機(jī)制作用做準(zhǔn)備。AEC II 的凋亡，在COPD 的發(fā)病中具有重要作用，AEC II 的凋亡可造成肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，肺氣腫形成[24-25]，本研究采用的A549 細(xì)胞為體外常用II 型肺泡上皮細(xì)胞模型，通過重組質(zhì)粒載體制備了lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)和敲減慢病毒，轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后，成功獲得了lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)和敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，最終用RT-qPCR 證明過表達(dá)組lncRNA RP11-521C20.3表達(dá)量較對照組上升，敲減組lncRNA RP11-521C20.3 則較對照組下降。為后續(xù)感染AECⅡ凋亡細(xì)胞模型，觀察lncRNA RP11-521C20.3 過表達(dá)或敲減對肺泡上皮細(xì)胞存活與凋亡的影響，從而進(jìn)一步研究闡明lncRNA RP11-521C20.3-BMF信號通路調(diào)控COPD 中AEC Ⅱ凋亡的作用及機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。