抗菌肽作為免疫調(diào)節(jié)劑治療細菌感染的潛力

梁國柱，阮詩媚，何艷梅，楊海龍

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

抗菌肽在先天宿主免疫調(diào)節(jié)的背景下已被研究了40 多年。初步研究的重點是了解抗菌肽的抗菌機制，確定其對抗菌功能至關(guān)重要的共同結(jié)構(gòu)和理化特征[1]。在過去10 多年中，人們在闡明抗菌肽如何與宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相互作用方面取得了很大進展[2]?？咕目梢岳盟拗髯陨淼拿庖呦到y(tǒng)，抑制潛在的有害炎癥反應(yīng)[3]。同時許多研究表明，抗菌肽可以通過調(diào)節(jié)宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫來清除病原體[4-7]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），也稱為宿主防御肽（host defense peptides，HDPs），是一種通常帶正電荷的短肽，存在于多種生命形式中。在一定條件下，大部分陽離子抗菌肽在體外都具有抗菌作用。然而，在宿主體內(nèi)，許多陽離子抗菌肽的直接抗菌活性往往被一定濃度的肽抑制和/或被生理濃度的單價和二價陽離子、血清和陰離子大分子如糖胺聚糖所拮抗[8]。因此，陽離子抗菌肽在體內(nèi)實際上可能并不是通過直接殺死微生物來增強宿主的防御作用，而是通過選擇性地增強或調(diào)節(jié)宿主自身免疫機制，以促進宿主對微生物感染的保護[9]。AMPs 在體內(nèi)的抗菌作用也不能完全被忽略，如：AMPs 通常與中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）相關(guān)，并有助于其形成。NETs 是中性粒細胞活化后在炎癥部位釋放的由DNA 和蛋白質(zhì)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其主要功能是捕獲和殺死病原體[10-11]。

截止到目前，AMPs 已經(jīng)被報道具有多種免疫調(diào)節(jié)活性。如首次報道的AMPs 免疫調(diào)節(jié)活性與其可以趨化白細胞的能力有關(guān)[12]。自此之后，AMPs 的許多其他免疫調(diào)節(jié)活性陸續(xù)被報道，包括增加趨化因子的表達，調(diào)節(jié)抗炎細胞因子、促炎細胞因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的產(chǎn)生，促進傷口愈合，誘導(dǎo)血管生成，促進白細胞的激活和分化，抗原呈遞和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)等[13-16]。此外，一些AMPs 還可以通過結(jié)合蛋白質(zhì)分子以及靶向固有免疫受體來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性[2，17]。因此，了解AMPs 如何通過免疫調(diào)節(jié)活性來治療細菌感染，平衡炎癥以及促進免疫穩(wěn)態(tài)，對AMPs 的開發(fā)具有重要意義。

1 抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)活性

1.1 白細胞的免疫趨化

AMPs 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的重要機制之一是對免疫細胞表現(xiàn)出直接的趨化活性，以及通過誘導(dǎo)趨化因子釋放來增強免疫細胞的募集[18]。接下來筆者將對AMPs 的直接趨化活性，以及間接趨化活性進行概述。

1.1.1 直接趨化活性來自不同物種的大量AMPs 已被證明可作為固有免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞的趨化劑[19]。人cathelicidin LL-37 被認為是具有多種免疫調(diào)節(jié)活性的AMPs。LL-37 可以通過甲酰肽受體1（recombinant formyl peptide receptor，F(xiàn)PRL1）吸引中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，單核細胞，CD4+T 細胞到微生物入侵的部位，從而激活先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[20-21]。此外，LL-37 還可以通過G 蛋白偶聯(lián)受體吸引肥大細胞到細菌感染部位[22]。然而LL-37 不會吸引單核細胞來源的未成熟樹突狀細胞，因為它們在分化過程中下調(diào)了FPRL1[23]。此外，在耐藥菌感染的小鼠模型中，合成肽IDR-1 通過FPRL1 化學(xué)吸引中性粒細胞來起到預(yù)防和治療小鼠耐藥菌感染的目的[24-25]。

1.1.2 間接趨化活性AMPs 可以通過刺激趨化因子和趨化因子受體的表達來發(fā)揮間接趨化功能。如：LL37 可以通過調(diào)節(jié)趨化因子的分泌來發(fā)揮其間接趨化活性。LL37 能夠單獨誘導(dǎo)CXCL8/ IL8的轉(zhuǎn)錄，并且可以與TNF-ɑ協(xié)同介導(dǎo)CXCL8/IL8 的表達[26]，而CXCL8/ IL8 可以刺激中性粒細胞的遷移。LL37 還可以通過誘導(dǎo)CXCL10/IP10的表達來募集巨噬細胞、T 細胞、NK 細胞和樹突狀細胞[27]。MCP-1/CCL-2 也可以被LL37 刺激后以劑量依賴的方式分泌，并且MCP-1 可以吸引單核細胞，T 細胞和樹突狀細胞到達細菌感染部位[25]。CCL5 可以被LL37 上調(diào)來增強嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T 細胞的趨化性[28]。除此之外，CXCL1/KC、CCL7/ MCP-3、CCL4、CCL20/MIP3a的表達都可以被 LL-37 上調(diào)[29]。LL37 還可以通過刺激趨化因子受體來發(fā)揮趨化功能，50 μg/mL LL-37 可以上調(diào)小鼠巨噬細胞趨化因子受體的表達，如IL-8 受體、CXCR4、CCR2 和LFA-1[30]。

1.2 抗原呈遞和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)

除了具有調(diào)節(jié)固有免疫效應(yīng)功能外，AMPs還可以作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，因為其可以將抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APCs）如樹突狀細胞和單核細胞/巨噬細胞募集到感染部位。樹突狀細胞是獨特有效的前哨白細胞，可以捕獲周圍組織中的抗原，然后啟動和協(xié)調(diào)原代Th 細胞反應(yīng)[31]。這一過程對于成功防御非自身有害微生物是至關(guān)重要的，并且取決于樹突狀細胞對抗原捕獲和呈遞能力[32]。LL-37可促進循環(huán)造血前體細胞和前體樹突細胞向樹突狀細胞分化，并通過與未成熟樹狀細胞相互作用影響適應(yīng)性免疫。LL-37 是樹突狀細胞分化和激活過程的調(diào)節(jié)劑，可以上調(diào)未成熟樹狀細胞的吞噬能力，調(diào)節(jié)吞噬受體的表達，上調(diào)共刺激分子的表達，促進Th1 誘導(dǎo)因子的分泌，并增強Th1反應(yīng)[33]。除此之外，LL37 可以通過活化濾泡樹突細胞來增強B 細胞的激活/增殖[34]。

1.3 脫顆粒

AMPs 可以刺激免疫細胞脫顆粒，然后釋放大量促炎和抗菌物質(zhì)，包括更多AMPs。LL-37通過G 蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)肥大細胞持續(xù)的鈣動員以及大量的脫顆粒[35-36]，這會導(dǎo)致組胺和前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）的釋放[37]。PGD2在炎癥后期，可以通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子與抗炎細胞因子的平衡來調(diào)節(jié)炎癥[38]。同時，TLR2 配體可以修飾被LL-37 激活的肥大細胞，并且肥大細胞的功能由過敏反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楣逃忻庖叻磻?yīng)[39]。這可能暗示了在感染的情況下LL37 會抑制肥大細胞的過敏反應(yīng)。

1.4 活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產(chǎn)生的調(diào)節(jié)

一氧化氮（nitric oxide，NO）和ROS 具有消除入侵病原體的能力，并且在固有免疫中發(fā)揮重要作用[40]。在吞噬細胞內(nèi)，AMPs 可以增強中性粒細胞的呼吸爆發(fā)并增加ROS 的釋放，該過程由黃素酶介導(dǎo)，并通過細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加來實現(xiàn)[41]。除此之外，AMPs 能以劑量依賴性的方式中和被內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細胞中NO 和TNF-α的釋放[14]。

1.5 炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)

如前所述，AMPs 具有激活免疫系統(tǒng)的多種功能，可以將其歸類為有助于清除病原體的促炎反應(yīng)。現(xiàn)在有相當(dāng)多的證據(jù)表明，AMPs 可以改變炎癥反應(yīng)的性質(zhì)，增強了傳統(tǒng)上被認為是促炎的某些活性，同時抑制了微生物的特異性分子對促炎細胞因子的有效誘導(dǎo)[42-43]。AMPs 的主要特征可能是細菌特異性誘導(dǎo)炎癥后調(diào)節(jié)炎癥，并有助于過渡到更平衡的炎癥反應(yīng)中[44]。因此，將它們描述為促炎或抗炎分子，不如將AMPs 定義為可以促進免疫穩(wěn)態(tài)的分子[45]。AMPs 還可以抑制內(nèi)毒素和其他TLR 激動劑誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)[46]，如：LL-37 可以通過以下方式抑制LPS 誘導(dǎo)的人巨噬細胞中的促炎反應(yīng)：（1）直接與LPS 相互作用以減少其與LPS 結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide bindingprotein，LBP），淋巴細胞抗原96（lymphocyte antigen 96，LY96）或TLR-4 受體復(fù)合物的結(jié)合，從而減少下游途徑的激活；（2）抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 中p65、p50 的活化，并通過MyD88 減少LPS 誘導(dǎo)的TREM-1 上調(diào)[47]；（3）通過抑制某些促炎基因，包括NF-κB1（P105/P50）和TNFα 誘導(dǎo)蛋白2（recombinant tumor necrosis factor alpha induced protein 2，TNFαIP2），同時上調(diào)抗炎細胞因子，例如：IL-10 和TNF-α 誘導(dǎo)的蛋白3（recombinant tumor necrosis factor alpha induced protein 3，TNFαIP3）來選擇性地調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；（4）激活MAPK 和PI3K 途徑來影響促炎途徑；（5）可能直接或間接影響TNF-α 蛋白的翻譯，穩(wěn)定或加工。然而，在特定情況下，LPS 和LL37 之間的相互作用可以導(dǎo)致細胞激活，如：LL37-LPS復(fù)合物在體外被人支氣管上皮細胞更有效地識別，隨后導(dǎo)致細胞內(nèi)TLR4 活化增強和IL-6 產(chǎn)生增加[48]；同樣，與LPS 本身相比，人類腺癌結(jié)腸上皮細胞系也對LL37-LPS 復(fù)合物的炎癥反應(yīng)增強[49]。LL37 還可以抑制IL-32 誘導(dǎo)的炎性單核細胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α、IL-6[50]。除巨噬細胞外，LL37 可以降低LPS 導(dǎo)致的人中性粒細胞[51]，樹突狀細胞[52]和B 淋巴細胞[53]的促炎細胞因子水平，并且其還可以抑制LTA 誘導(dǎo)的外周血單個核細胞[27]和樹突狀細胞[52]中促炎細胞因子TNF、IL-6 的釋放。

綜上所述，AMPs 的免疫調(diào)節(jié)活性，見圖1。

圖1 抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.1 Immunomodulatory activity of AMPs

2 臨床治療的應(yīng)用和挑戰(zhàn)

隨著細菌對常規(guī)抗生素耐藥性的增加，以及缺乏針對耐藥菌感染的新療法[54-55]。人們越來越關(guān)注利用AMPs 的免疫調(diào)節(jié)活性來靶向治療多重耐藥菌。許多具有抗菌和/或免疫調(diào)節(jié)特性的肽已在臨床上研究了對多重耐藥菌的療效。然而，到目前為止，只有少數(shù)AMPs 衍生的化合物進入了臨床，并且大多數(shù)臨床試驗側(cè)重于局部而不是系統(tǒng)應(yīng)用[56]。除此之外，AMPs 的臨床應(yīng)用還與很多因素相關(guān)，例如給藥途徑、穩(wěn)定性、生物利用度、毒性、免疫原性，還與它們昂貴的生產(chǎn)成本有關(guān)[57-58]。同時，已有報道顯示AMPs 可以對細菌產(chǎn)生耐藥性[59]。然而，對于具有免疫調(diào)節(jié)活性的AMPs，其針對的是免疫系統(tǒng)而不是病原體，所以免疫調(diào)節(jié)肽可以避免細菌耐藥性的問題[54]。

為了使AMPs 在臨床上有更好的應(yīng)用，有以下幾種方法可以克服AMPs 的蛋白水解敏感性，并改善其穩(wěn)定性。在化學(xué)修飾方面，異構(gòu)化即用D-氨基酸替換一種或多種L-氨基酸[60]；環(huán)化即通過引入二硫鍵或連接N 和C 末端來實現(xiàn)[61]；脂化即將一個或多個脂肪酸鏈連接到AMPs 的N 末端或賴氨酸殘基的氨基上[62]。除此之外，已經(jīng)開發(fā)了多種遞送系統(tǒng)或納米載體，以提高AMPs 的穩(wěn)定性和生物利用度，并且可以將其遞送到臨床關(guān)注的特定部位，以可控的方式釋放它們[63]。研究最多的AMPs 遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體制劑，聚合物納米結(jié)構(gòu)，透明質(zhì)酸納米凝膠，DNA“籠子”，聚乳酸羥基乙酸共聚物和介孔二氧化硅納米微球等[64-68]。AMPs 還可以與生物聚合物（例如殼聚糖和透明質(zhì)酸）結(jié)合，這些生物聚合物具有多個用于連接肽的官能團，來增加其生物相容性以及抗菌活性[69]。

3 小結(jié)

抗生素耐藥性的增加以及缺乏新的治療耐藥菌感染的方法，這使得耐藥菌感染嚴重威脅著人類的生命健康安全。而抗菌肽是一種獨特的分子，有望成為治療多重耐藥菌感染的生物候選者。現(xiàn)在AMPs 已經(jīng)被證明在機體免疫調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，如：固有免疫的激活，抗原呈遞和吞噬作用的增強，影響適應(yīng)性免疫以及強大的抗炎功能。因此，利用AMPs 的免疫調(diào)節(jié)活性來治療耐藥菌感染被認為是一種新的抗感染治療方法。此外，正在開發(fā)許多新方法來改善AMPs 的生物相容性、穩(wěn)定性以及毒性等。使用這些新方法可以改善AMPs 的局限性，并考慮到現(xiàn)在有大量可用的肽序列，所以可以合理的預(yù)測AMPs 將成為未來治療多重耐藥病原體感染的有效藥物。