骨修復(fù)材料促成骨作用的分子機(jī)制

徐云容 ，唐梓聞 ，何 飛

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)附屬曲靖醫(yī)院骨科，云南 曲靖 655000）

創(chuàng)傷、感染、手術(shù)、先天性畸形和腫瘤切除造成的骨缺損[1-2]，會(huì)導(dǎo)致骨不愈合、延遲愈合、連接中斷或局部功能障礙[3]。而骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，為骨缺損的修復(fù)與再生提供了諸多可能[4-6]，使人們對(duì)模擬天然骨所需材料的種類、化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)和生物特性有了很好的了解[7-8]。并且研究所產(chǎn)生的多種具有良好機(jī)械性能與生物相容性的骨修復(fù)材料在骨形成、骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、骨整合、組織再生中表現(xiàn)出了巨大潛能[9-10]。但骨形成是一個(gè)復(fù)雜、多階段的生理過程，包含多種信號(hào)通路和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的相互交流[11]，關(guān)于骨修復(fù)材料是如何促進(jìn)成骨作用具體機(jī)制的發(fā)掘與研究仍然有待深入。對(duì)于骨修復(fù)材料的進(jìn)一步發(fā)展與臨床應(yīng)用，越來越需要詳細(xì)了解其促進(jìn)成骨作用的具體機(jī)制[12-13]。本文針對(duì)現(xiàn)今研究較多的多種信號(hào)通路機(jī)制進(jìn)行了一定的闡述，并進(jìn)一步總結(jié)了骨修復(fù)材料促進(jìn)成骨作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為骨修復(fù)材料促成骨作用分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)與新的思考。

1 成骨相關(guān)信號(hào)通路

1.1 RTK 信號(hào)通路

RTKs 是一類酶聯(lián)受體，其配體主要為各類生長(zhǎng)因子，每一類RTK 及其配體對(duì)應(yīng)的都是一個(gè)蛋白家族，如其配體對(duì)應(yīng)的VEGF 包括VEGF-A、VEGF-B、PGF 和RTK 作為受體對(duì)應(yīng)的包括HER1/2/3/4 的EGFR 蛋白家族等。RTK 與配體結(jié)合后形成RTK 二聚體發(fā)生自磷酸化，活化下游蛋白激活MAPK 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路從而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，見圖1，并最后影響成骨過程，其中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）介導(dǎo)的信號(hào)通路就在成骨過程中發(fā)揮著重要作用[14]。

圖1 RTK 通路、MAPK 通路、PI3K/AKT 通路、AMPK 通路、整合素通路并行示意圖Fig.1 Parallel diagram of RTK pathway，MAPK pathway，PI3K/AKT pathway，AMPK pathway and integrin pathway

1.2 MAPK 信號(hào)通路

MAPK 信號(hào)通路的基本組成是一種包括MAPKKK、MAPKK、MAPK 的3 級(jí)激酶模式，MAPK 分為ERK、p38、JNK 和ERK5 4 個(gè)亞族，其所構(gòu)成的ERK/MAPK、p38/MAPK、JNK/MAPK和ERK5/MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種生理或病理過程，見圖1。MAPK 信號(hào)通路是成骨分化的重要機(jī)制，增加ERK1/2、p38 和JNK 的表達(dá)可以有效促進(jìn)成骨分化基因的轉(zhuǎn)錄[15-18]。

1.3 PI3K/AKT 信號(hào)通路

PI3K 由一個(gè)催化亞基（主要為p110）和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基（p85）組成，既具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶活性，又具有磷脂酰肌醇激酶活性，可以將PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3 活化PDK1 從而激活參與細(xì)胞增殖與凋亡多種生理活動(dòng)的AKT，使AKT對(duì)下游的TSC1/2、FOXO、GSK-3 產(chǎn)生抑制作用和激活內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和ATP 檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄，其在正向調(diào)控成骨細(xì)胞分化中可能起著主要的作用[19-21]。

1.4 AMPK 信號(hào)通路

AMPK 是一個(gè)由α 亞基、β 亞基和γ 亞基組成的異源三聚體，主要被其上游的LKB1 和CaMKK2 激活，見圖1，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子[22]，并且在骨再生中也發(fā)揮著一定作用[23-24]。

1.5 TGF-β 超家族信號(hào)通路

TGF-β 超家族成員包括TGF-β、BMP、AMH、Activin、Nodal 及GDF 等配體，主要涉及TGF-β 信號(hào)通路、BMP 信號(hào)通路、Activin 信號(hào)通路，見圖2，傳導(dǎo)過程中配體與II 型受體結(jié)合，II 型受體招募并磷酸化I 型受體，I 型受體再使受體調(diào)節(jié)的Smad（R-Smad）磷酸化以后與共同介導(dǎo)的Smad（CoSmad）結(jié)合形成蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄，其對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、凋亡起著廣泛的調(diào)節(jié)作用。而在骨形成過程中TGF-β 信號(hào)通路對(duì)維持骨代謝平衡起著重要作用，可以促進(jìn)成骨分化、抑制破骨細(xì)胞形成[25]，同時(shí)BMP 信號(hào)通路對(duì)成骨分化的啟動(dòng)起著關(guān)鍵作用[26]。

圖2 TGF-β 超家族信號(hào)通路示意圖Fig.2 Schematic diagram of TGF-β superfamily signaling pathway

1.6 Wnt 信號(hào)通路

Wnt 信號(hào)通路包括19 種Wnt 配體蛋白，根據(jù)其受體不同，分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、非經(jīng)典的Wnt/平面細(xì)胞極性（planar cell polarity，PCP）、Wnt/Ca2+和調(diào)節(jié)紡錘體的方向及非對(duì)稱細(xì)胞分裂的胞內(nèi)信號(hào)通路[27]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有高度保守性，在組織發(fā)育與再生中起著核心作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子βcatenin 是否磷酸化參與成骨細(xì)胞分化，見圖3，激活經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路可以作為促進(jìn)骨再生或加速骨愈合的一種有效方法，具有促進(jìn)成骨和血管生成同時(shí)減少破骨形成的作用[28-30]，并且其下游的RhoA/ ROCK 信號(hào)通路也在介導(dǎo)材料的不同微觀形貌成骨中表現(xiàn)出了重要作用[31-32]。

圖3 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路示意圖Fig.3 Schematic diagram of Wnt/β-catenin signaling pathway

1.7 Hippo 信號(hào)通路

Hippo 信號(hào)通路是一條抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的通路，其下游效應(yīng)因子為 YAP/TAZ，是調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵因子[33]。目前已有研究證明YAP/TAZ 信號(hào)通路和Wnt 信號(hào)通路介導(dǎo)了材料微觀形貌對(duì)細(xì)胞黏附和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，并最終影響成骨基因的表達(dá)[34]，但Hippo 信號(hào)通路在是否有效促進(jìn)成骨方面仍存在爭(zhēng)議，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究[35]。

1.8 NF-κB 信號(hào)通路

NF-κB 家族成員包括NF-κB1（p50）、NFκB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel，其信號(hào)通路分為IκB 降解使NF-κB 二聚體（即P50/P65復(fù)合物）得到釋放轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核調(diào)控轉(zhuǎn)錄的經(jīng)典信號(hào)通路，見圖4A，P100 或P105 經(jīng)加工處理成p52/RelB 二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核調(diào)控轉(zhuǎn)錄的非經(jīng)典信號(hào)通路，見圖4B，以及NF-κB 介導(dǎo)的其他信號(hào)通路。NF-κB 是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、應(yīng)激反應(yīng)，并且通過其對(duì)炎癥環(huán)境的調(diào)節(jié)可以有效參與成骨分化過程[36-37]。

圖4 NF-κB 信號(hào)通路示意圖Fig.4 Schematic diagram of | NF-κB signaling pathway

1.9 Notch 信號(hào)通路

該信號(hào)通路的配體并不位于細(xì)胞外基質(zhì)，而是位于與受體非同一細(xì)胞的細(xì)胞膜上，為DSL 家族蛋白，目前為止包括JAG1、JAG2、DLL1、DLL3 和DLL4，受體為Notch 跨膜蛋白。Notch 受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過ADAM 剪切釋放胞外段與配體一同降解，經(jīng)γ-secretase 剪切釋放胞內(nèi)段繼續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)，激活Hes/Hey 基因的轉(zhuǎn)錄[26]。目前已有研究表明Notch 信號(hào)通路在成骨方面具有重要作用[38-40]。

1.10 JAK/STAT 信號(hào)通路

該信號(hào)通路的JAK（酪氨酸蛋白激酶）包括JAK1/2/3、TYK，STAT（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子）包括STAT1/2/3/4/6、STAT5A、STAT5B[41]，配體主要為ILs、INFs，與受體結(jié)合后使受體發(fā)生二聚化，同時(shí)與受體偶聯(lián)的JAK 發(fā)生自磷酸化而活化，招募并磷酸化STAT，使STAT 形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控轉(zhuǎn)錄，參與成骨細(xì)胞的分化[3]，同時(shí)也有研究表明其主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)在骨形成中發(fā)揮作用[42-43]。

1.11 Hedgehog 信號(hào)通路

Hedgehog（Hh）信號(hào)通路由3 個(gè)配體Shh、Dhh、Ihh 和2 個(gè)跨膜蛋白受體Ptc、Smo 及其下游Gli、Fu、SuFu、Cos2、PKA 等轉(zhuǎn)錄因子組成。沒有Hh 配體時(shí)，Ptc 抑制Smo 蛋白活性從而抑制下游通路，Gli 與SuFu 結(jié)合并被加工成GliR，GliR 抑制靶基因轉(zhuǎn)錄；當(dāng)Hh 配體與Ptc 結(jié)合時(shí)，解除對(duì)Smo 的抑制作用，Smo 使SuFu 與Gli 解離，Gli 轉(zhuǎn)變?yōu)镚liA，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。Hh 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、組織形成、干細(xì)胞維持和發(fā)育的控制中具有多種作用。研究證明，Hh 信號(hào)通路的激活參與了MSCs 向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化，可以通過上調(diào)Runx2 等成骨細(xì)胞因子來促進(jìn)骨量，在骨組織再生過程中起著關(guān)鍵作用[44-46]。

1.12 整合素信號(hào)通路

整合素是一個(gè)由α 鏈和β 鏈組成的異二聚體細(xì)胞跨膜蛋白家族[47]，包括22 個(gè)不同的異源二聚體復(fù)合物，作為結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)胞骨架之間信號(hào)的主要受體，允許間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到骨以及可以加強(qiáng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的聯(lián)系，可以與ECM 結(jié)合觸發(fā)整合素聚類，激活FAK 等胞內(nèi)信號(hào)蛋白，隨后導(dǎo)致ERK1/2、p38、PI3K、AKT 等磷酸化，從而參與成骨分化[48-51]。

1.13 其他信號(hào)通路

OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路在破骨細(xì)胞的分化、激活和凋亡中起著至關(guān)重要的作用，OPG可作為破骨細(xì)胞的負(fù)調(diào)控因子，競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL 結(jié)合，阻斷RANKL/RANK 信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞分化參與骨代謝過程，也可能是骨修復(fù)材料促成骨過程中的一種潛在調(diào)控機(jī)制[52-53]。也有文獻(xiàn)報(bào)道缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）信號(hào)通路也參與了血管生成和成骨調(diào)控[49,54]。

2 骨修復(fù)材料促成骨分子機(jī)制

骨修復(fù)材料主要分為金屬材料、非金屬材料和復(fù)合材料3 大類，其中非金屬材料又可以分為無機(jī)材料和有機(jī)高分子聚合材料[55]。近些年骨修復(fù)材料在骨組織工程中的研究與應(yīng)用越來越多，而針對(duì)其具體促成骨作用的分子機(jī)制研究還有待深入。

2.1 金屬材料

金屬生物材料因其出色的機(jī)械力學(xué)性能、良好生物相容性及生物安全性而被廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)[56]。如鍶在骨組織代謝中可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的活性[57]，Cui 等[58]采用RT-qPCR 研究Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)基因（β-catenin，DKK1，Wnt5A）和 Western blot檢測(cè)β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況，同時(shí)采用FH 535 阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào)通路以探究骨水泥中鍶促成骨的可能分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用含鍶骨水泥，可通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)骨再生。Zheng 等[20]將經(jīng)非熱大氣等離子體（non-thermal atmospheric plasma，NTAP）處理的鈦與MC3T3-E1 細(xì)胞共培養(yǎng)，通過qRT-PCR、Western blot 和免疫組化染色檢測(cè)，PI3K 和Akt蛋白表達(dá)顯著上升，與未經(jīng)處理的鈦相比，NTAP 處理顯著促進(jìn)了基質(zhì)礦化和鈣結(jié)節(jié)形成，而在加入PI3K 抑制劑LY294002 的組MC3T3-E1細(xì)胞在NTAP 處理鈦表面的黏附、增殖和成骨分化顯然被抑制，說明PI3K/AKT 信號(hào)通路在其中起著關(guān)鍵作用。He 等[59]采用陽極氧化制備了具有納米管結(jié)構(gòu)的多孔二氧化鈦材料，結(jié)合LCMS/MS 質(zhì)譜分析和富集分析利用Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) p-ERK1/2 的表達(dá)受到促進(jìn)，整合素β1、p-JNK、p-p38、CTSK 和TRAP 的表達(dá)受到抑制，RT-qPCR 檢測(cè)顯示OCN、OPN、ALP 和RUNX2顯著上調(diào)，且當(dāng)破骨細(xì)胞經(jīng)p-FAK 抑制劑處理后，p-FAK 的表達(dá)被抑制，同時(shí)破骨細(xì)胞標(biāo)記蛋白CTSK 和TRAP 的表達(dá)也相應(yīng)地再次降低，研究結(jié)果證實(shí)，該材料可以通過整合素介導(dǎo)的FAK 磷酸化及其下游MAPK 通路抑制破骨細(xì)胞的形成，改變細(xì)胞因子的分泌情況，使其更有利于成骨。

Zhang 等[60]研究了納米鉭的促成骨機(jī)制，發(fā)現(xiàn)納米鉭與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)和在SD 大鼠下頜骨缺損修復(fù)過程中，BMP-2、Smad4 和Runx2 的表達(dá)相比空白對(duì)照組增多，且添加Smad4 抑制劑后，ALP 表達(dá)、ECM 礦化和Smad4細(xì)胞免疫熒光顯著降低，表明BMP/Smad 是金屬鉭促成骨作用的可能機(jī)制。也有實(shí)驗(yàn)證明，與鈣離子具有相似離子半徑的稀土元素也可以誘導(dǎo)骨組織生長(zhǎng)，Ge 等[61]制備的含金屬鈰的復(fù)合材料中，釋放的鈰離子可以激活BMP-2/Smad 信號(hào)通路，提高BMP-2、OCN、Runx2 基因及成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平促進(jìn)骨組織再生。

2.2 無機(jī)材料

無機(jī)材料主要包括羥基磷灰石、磷酸鈣骨水泥、生物活性玻璃等。羥基磷灰石作為骨組織的主要無機(jī)成分常被用做骨修復(fù)材料[62]，Guo 等[7]結(jié)合RNA 測(cè)序和功能富集分析，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)所處的微環(huán)境中CDHs 和ITGA2 的表達(dá)增加，說明其成骨作用與Hippo 信號(hào)通路和PI3K/AKT 信號(hào)通路存在一定相關(guān)性，并且可能通過激活TGF-β 信號(hào)通路，協(xié)同激活A(yù)NXA10 依賴的PTHrP 信號(hào)通路和FGF信號(hào)通路，從而促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)TIMP1 和TIMP3，表明HIF 信號(hào)通路在其中也存在激活，而對(duì)于OPG 表達(dá)的持續(xù)監(jiān)測(cè)，揭示OPG/ RANKL 可能是羥基磷灰石成骨作用潛在調(diào)控途徑的一部分，此外SOX9、BMP 信號(hào)通路也存在激活，提示這一系列信號(hào)通路與羥基磷灰石促進(jìn)成骨存在著密切的聯(lián)系。Lu 等[63]通過數(shù)字光刻打印制備了圓柱型、回旋型、菱形孔3 種典型結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石材料，RNA 測(cè)序顯示RhoA/ROCK2 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)在各組間存在顯著差異，Western blot 和RT-qPCR 分析，DVL2、DAAM1、p-RhoA 和p-ROCK2 上調(diào)明顯，這些結(jié)果表明該材料通過增強(qiáng)RhoA/ROCK2 通路的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)了BMSCs 向成骨分化。

和成骨細(xì)胞一樣，來源于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞同樣是骨修復(fù)材料骨整合中的關(guān)鍵，Wang 等[64]通過改變磷酸四鈣和無水磷酸二鈣的比例制備不同鈣磷比的磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC），通過表面等離子體共振分析，與鈣磷比為1.4 和1.5 時(shí)相比，鈣磷比為1.67 時(shí)CPC 可以顯著增強(qiáng)RANKL 對(duì)RANK 的親和力從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，同時(shí)蛋白條帶可視化和定量分析顯示，鈣磷比為1.67 時(shí)RANKL 誘導(dǎo)的NF-κB（p65）磷酸化顯著上調(diào)，而IκBα表達(dá)顯著下調(diào)，意味著1.67 鈣磷比的CPC 可以促進(jìn)IκBα 的降解從而增強(qiáng)NF-κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，揭示了高鈣磷比CPC（即鈣磷比為1.67 時(shí)的CPC）可以通過增強(qiáng)破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)TGFβ1 分泌加速骨愈合。

生物活性玻璃屬于第3 代骨修復(fù)材料，十分有利于體外成骨細(xì)胞分化和礦化[65]，Yin 等[66]利用加入硼的生物活性玻璃（B-MBG）進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，B-MBG 均表現(xiàn)出理想的成骨效果，RNA 測(cè)序顯示W(wǎng)nt/β-catenin 信號(hào)通路被激活，經(jīng)Western blot 和免疫組化驗(yàn)證，β-catenin、p-GSK-3β 及靶蛋白setd7（組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7）表達(dá)增多，H3K4me3（組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的三甲基化）變多，而在敲除setd7 后，成骨相關(guān)標(biāo)志物ALP 和Runx2 顯著下降，表明BMBG 促成骨效應(yīng)是由Wnt/β-catenin 信號(hào)通路介導(dǎo)的，且Setd7 和H3K4me3 的表達(dá)可能受到Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)控從而參與成骨促進(jìn)。MEI 等[67]制備了具有納米結(jié)構(gòu)的硅酸鈣生物陶瓷，qRT-PCR 檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，Runx2、OPN、Col1-α1 顯著上調(diào)，Western blot檢測(cè)FAK、p-FAK 和MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白（ERK、JNK、p38）表達(dá)水平，p-FAK、ERK、JNK、p38 表達(dá)水平明顯上調(diào)，且在添加FAK 信號(hào)通路抑制劑PF573228 和p38 信號(hào)通路抑制劑SB203580 時(shí)結(jié)果相反，表明硅酸鈣生物陶瓷可以活化FAK 激活MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)成骨。

2.3 有機(jī)高分子材料

與金屬和無機(jī)材料相比，聚合物材料具有更多適應(yīng)臨床應(yīng)用的物理化學(xué)性質(zhì)，提供了更多的化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改變的可能性[68]，是極具前途的骨修復(fù)材料之一[69]。然而，有機(jī)高分子材料在大多數(shù)時(shí)候都是作為復(fù)合材料的基體[70]，使得缺少關(guān)于單一有機(jī)高分子材料促成骨作用相關(guān)分子機(jī)制方面的研究，未來可以優(yōu)先考慮這一方面的探索。

Li 等[71]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)載去鐵胺的明膠水凝膠可以激活HIF1-α 信號(hào)通路，上調(diào)eNOS、VEGF 和SDF1-α 的表達(dá)，耦合成骨與血管化促進(jìn)骨再生。ASPARUHOVA 等[72]利用qRTPCR 和Western blot，觀察到在透明質(zhì)酸處理的ST2 和MC3T3-E1 細(xì)胞中OPN、Col-1、Runx2、BSP、ALP 表達(dá)明顯增加，Smad1/5/8 顯著下調(diào)，TGF-β1 和FGF 顯著上調(diào)，Smad2 磷酸化和Erk1/2 磷酸化增多，揭示透明質(zhì)酸的促成骨作用是通過激活TGF-β/ Smad2 和Erk1/2 介導(dǎo)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，但晚期同時(shí)表現(xiàn)為抑制BMP/ Smad信號(hào)通路。Han 等[47]采用3D 打印技術(shù)制備了氧化鐵涂層的聚乳酸-羥基乙酸共聚物骨修復(fù)材料，通過對(duì)整合素亞基α1、α2、α5、β1、β3 以及FAK、ERK1/2 和成骨標(biāo)志基因（OCN、Col-I、OPN、BMP2、ALP）的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該材料可以激活整合素信號(hào)通路，活化FAK，上調(diào)ERK1//2 促進(jìn)成骨。

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）因其優(yōu)異的力學(xué)性能和物理化學(xué)耐受性已被廣泛用作骨修復(fù)材料[73]，Gao 等[42]采用O2 等離子體處理PEEK 后，利用分層自組裝技術(shù)制備了具有納米孔結(jié)構(gòu)的PEEK 材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行全基因組表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其促成骨作用與MAPK 和PI3K-Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)，為具有免疫調(diào)節(jié)能力新材料及其分子機(jī)制的研究提供了不同思路。Xue 等[74]研究了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）材料上的成骨分化能力及可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PCL 對(duì)3 種間充質(zhì)干細(xì)胞都具有成骨促進(jìn)作用，Western blot 檢測(cè)，βcatenin、p-Smad3 上調(diào)，且經(jīng)β-catenin 抑制劑DKK1、p-Smad3 抑制劑SIS3 反向?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制劑聯(lián)合使用比單一使用顯著降低間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，證明PCL 的促成骨作用是通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和smad3 相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行。Wang 等[18]研究表明，聚多巴胺作為一種涂層材料能有效促進(jìn)成骨，在成骨分化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光染色顯示聚多巴胺涂層組黏著斑蛋白（Vinculin）表達(dá)強(qiáng)度顯著高于空白組，Western bolt 檢測(cè)p-FAK、p-p38 表達(dá)增多，說明聚多巴胺涂層對(duì)BMSCs 成骨分化的增強(qiáng)涉及FAK/P38通路的激活。Sun 等[75]研究也表明聚多巴胺涂層可能通過激活Wnt 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路參與促骨生成。

2.4 復(fù)合材料

為獲得更佳的骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性和骨形成效果及具有良好的機(jī)械性能與生物相容性的骨修復(fù)材料，對(duì)材料進(jìn)行復(fù)合是一種研究新趨勢(shì)[76]，并且針對(duì)復(fù)合骨修復(fù)材料促進(jìn)成骨機(jī)制的研究成果卓著，見表1。

表1 復(fù)合材料成骨機(jī)制的研究Tab.1 Studies on osteogenic mechanism of composite materials

聚己內(nèi)酯的疏水性和殼聚糖較差的力學(xué)穩(wěn)定性，限制了他們?cè)诠切迯?fù)中的應(yīng)用，而Shi 等[77]將它們經(jīng)溶劑鑄造制成復(fù)合材料，結(jié)合前期IL-10 敲除小鼠會(huì)發(fā)生骨質(zhì)流失的研究成果，發(fā)現(xiàn)該材料通過增加外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（ectoblast mesenchyme stem cells，EMSCs）中的IL-10 水平激活p38/MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)促進(jìn)成骨，在進(jìn)一步使用shRNA 特異性沉默Hippo 信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子YAP 進(jìn)行功能喪失實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)EMSCs 中的礦化面積和堿性磷酸酶活性降低，該材料的機(jī)械性能可能使YAP 產(chǎn)生響應(yīng)進(jìn)而調(diào)控成骨作用。Zhang 等[78]以甲基丙烯酰殼聚糖和β-磷酸三鈣進(jìn)行光交聯(lián)形成的復(fù)合水凝膠經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明可以上調(diào)堿性磷酸酶、骨鈣素和骨橋蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證了Hippo 信號(hào)通路在該材料促成骨的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮作用。Wang 等[79]將還原性谷胱甘肽接枝甲基丙烯酸明膠所制備的抗氧化水凝膠（GelMA-g-GSH）與MC3T3-E1 細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)過RNA 測(cè)序與富集分析，PI3K-Akt 信號(hào)通路明顯上調(diào)，采用qRT-PCR 與Western blot 檢測(cè)βcatenin、GSK-3β 和PTEN 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)βcatenin 基因和蛋白水平上調(diào)，PTEN 和GSK-3β基因和蛋白水平下調(diào)，并且在GelMA-g-GSH 組中最明顯，而在使用了PI3K 特異性抑制劑LY294002 后，相關(guān)基因與蛋白表達(dá)水平與之前相反，表明PI3K/Akt 信號(hào)通路是GelMA-g-GSH促進(jìn)成骨的潛在機(jī)制之一。Xue 等[80]實(shí)驗(yàn)證明MC3T3-E1 細(xì)胞在殼聚糖季銨鹽/氧化石墨烯/聚多巴胺復(fù)合材料刺激36 h 后，經(jīng)Western blot 檢測(cè)BMP2、BMPR1B、BMPR2、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8和Runx2 蛋白的表達(dá)水平升高，表明BMP/Smads信號(hào)通路在MC3T3-E1 細(xì)胞中參與了該復(fù)合材料促進(jìn)成骨的過程。

而將金屬與金屬?gòu)?fù)合，同樣可以獲得更好的成骨效果，Huang 等[16]選擇金剛石和菱形十二面體作為單位細(xì)胞結(jié)構(gòu)，利用激光熔融技術(shù)制備了鉭/鈦合金復(fù)合材料，其具有與骨小梁結(jié)構(gòu)相似的優(yōu)點(diǎn)，研究證明當(dāng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附在材料表面時(shí)，ILK 被FAK 所募集并激活ERK1/2，磷酸化的ERK1/2 顯著上調(diào)Runx2 的表達(dá)水平，此外應(yīng)用U0126（ERK1/2 抑制劑）和OSU-T315（ILK 抑制劑）可明顯下調(diào)Runx2 表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)了ILK/ERK1/2 信號(hào)通路介導(dǎo)了該材料的促成骨作用，且通過分組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，具有金剛石單位細(xì)胞結(jié)構(gòu)的鉭/鈦合金具有更加優(yōu)異的生物性能和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度。同樣，Jia 等[81]合成的鋅/鍶合金材料，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出理想的成骨效果，經(jīng)RNA 測(cè)序和Western blot 表明，該合金可以通過激活Wnt/β-catenin、PI3K/AKT 和MAPK/ERK信號(hào)通路來促進(jìn)成骨。

Yang 等[82]不僅關(guān)注復(fù)合材料對(duì)成骨的影響，并且同時(shí)聚焦復(fù)合材料促血管化的作用，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，他們制備的骨膜模擬助骨劑復(fù)合材料可以實(shí)現(xiàn)L-精氨酸和Ca2+的持續(xù)釋放，激活NO（一氧化氮）/cGMP 通路，增強(qiáng)成骨與血管生成耦合效應(yīng)促進(jìn)骨組織再生，提示cGMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也潛在參與了骨形成的調(diào)控，可以深入研究。Cheng 等[83]所制備的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactide-co-glycolide），PLGA）和β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）復(fù)合材料在大鼠顱骨缺損模型免疫組化中顯示，VEGF 表達(dá)顯著增多，結(jié)合Western blot 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VEGF引發(fā)Src、AKT、FAK 和p38 下游磷酸化促進(jìn)血管再生與骨形成，表明MAPK 信號(hào)通路和PI3K/AKT 信號(hào)通路參與了該材料促成骨的作用，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在材料中添加葫蘆素B 后，VEGF 表達(dá)再一次上調(diào)，成骨和血管化效果增強(qiáng)。基于光學(xué)、電學(xué)、超聲和磁化等方法具有非侵入性和精確調(diào)節(jié)生物活性的優(yōu)點(diǎn)，F(xiàn)u 等[84]制備了硫化鉍/羥基磷灰石薄膜包裹的鈦復(fù)合材料，結(jié)合生信分析，該材料在近紅外照射下可以產(chǎn)生電子，使Wnt 和Frizzled 的表達(dá)發(fā)生改變，PLC、IPR3、IP3 和IP3R 顯著上調(diào)，激活Wnt/Ca2+信號(hào)通路參與材料促成骨作用，揭示物理因素在骨修復(fù)材料促進(jìn)成骨中依舊可以發(fā)揮正向作用。Zou 等[85]將甲狀旁腺激素（PTH）和納米羥基磷灰石（nHAP）加入具有多孔結(jié)構(gòu)帶電基團(tuán)相反的殼聚糖（chitosan，CS）/海藻酸鈉（sodium alginate，SA）水凝膠（Gel）中，蛋白質(zhì)免疫印跡和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)顯示，相比于對(duì)照組，Gel-nHAP-PTH 組和Gel-nHAP 組Notch1、Jagged1、NICD、Hes1、Hes5 水平顯著升高，且Gel-nHAP-pth 組的表達(dá)高于Gel-nHAP組，表明得益于PTH 和nHAP 的加入，GelnHAP-PTH 可以顯著誘導(dǎo)Notch 信號(hào)通路的激活促進(jìn)成骨蛋白和基因的表達(dá)，以改善成骨分化。

結(jié)合聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、改性后的氫氧化鎂（mMH）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）各自的優(yōu)點(diǎn)，Lee 等[86]制備的摻入了氧化鋅/阿侖膦酸鈉/BMP2 納米顆粒的仿生PLGA/mMH/ECM 復(fù)合材料在抗炎、促血管生成、抗破骨細(xì)胞生成和骨再生方面表現(xiàn)出了良好的多功能活性，結(jié)合RNA 測(cè)序技術(shù)，采用Western blot、PCR、ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，由于該材料引起NO 的持續(xù)釋放，誘導(dǎo)了可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）激活，使cGMP 和PKG 等信號(hào)分子上調(diào)，導(dǎo)致VEGF 和HIF-1α 的高表達(dá)，下調(diào)了DKK-1 的表達(dá)，激活了NO/cGMP 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路產(chǎn)生了有利于骨再生的一系列生理過程。

3 小結(jié)

現(xiàn)今的多種骨修復(fù)材料是繼自體骨、同種異體骨后，對(duì)骨缺損修復(fù)有效的植入替代物，通過對(duì)各種骨修復(fù)材料的改性與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，使其有望在臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)MAPK 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路、TGF-β 超家族信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、Hippo 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路、Hedgehog 信號(hào)通路、整合素信號(hào)通路等許多分子通路機(jī)制都參與了骨修復(fù)材料促骨再生過程，對(duì)骨修復(fù)材料如何促進(jìn)成骨分化起著主要調(diào)控作用。雖然骨修復(fù)材料促成骨作用具有復(fù)雜的分子機(jī)理，各種信號(hào)通路相互交錯(cuò)構(gòu)成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但信號(hào)通路與信號(hào)通路之間，分子與分子之間，可能存在共通點(diǎn)，這可以作為今后研究的突破點(diǎn)。并且目前骨修復(fù)材料促成骨機(jī)制方面的研究對(duì)象多集中于各種負(fù)載生物活性因子的復(fù)合材料，對(duì)單一材料具體促成骨作用信號(hào)通路的探索相對(duì)較少，且對(duì)于骨修復(fù)材料在促成骨過程中與免疫環(huán)境的改善、促血管化等方面的串?dāng)_機(jī)制所關(guān)注的較少，增加骨修復(fù)材料對(duì)體內(nèi)微環(huán)境影響的關(guān)注更有利于理解其促進(jìn)成骨作用的分子機(jī)制。

骨修復(fù)材料的靈活設(shè)計(jì)與體內(nèi)外促成骨研究在今后依然是熱門研究領(lǐng)域，但對(duì)于其促成骨作用具體機(jī)制的許多細(xì)節(jié)還有待進(jìn)一步深入研究與闡述。本文中所介紹的相關(guān)信號(hào)通路和骨修復(fù)材料促成骨機(jī)制的研究實(shí)例可以為今后的研究提供一些新的切入點(diǎn)與參考，有助于深入了解骨修復(fù)材料促成骨作用背后的分子機(jī)制，為其精準(zhǔn)設(shè)計(jì)與臨床應(yīng)用鋪平道路。未來進(jìn)一步闡明涉及各信號(hào)通路激活的詳細(xì)機(jī)制，并確定其在骨修復(fù)材料促進(jìn)成骨中的具體作用，可以為骨組織工程中生物材料的研究帶來新的突破，揭示骨修復(fù)材料在促進(jìn)成骨分化過程中的作用機(jī)制與規(guī)律將會(huì)是未來骨修復(fù)材料研究所關(guān)注的重點(diǎn)。