液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定雞蛋中的唾液酸

陽 曦 劉 瑋 張 林 江 麗 范鶯薷

（綿陽市食品藥品檢驗(yàn)所， 四川 綿陽 621000）

唾液酸是一類羧基化的單糖?；苌?， 其中在自然界中最為常見的存在形式為N-乙酰神經(jīng)氨酸[1]。 人體和動物的血漿、 乳汁、 腦部及神經(jīng)組織中也存在游離的唾液酸[2]。 研究表明， 唾液酸具有抗病毒、 抗癌等多種生物活性， 具有促進(jìn)大腦發(fā)育、 增強(qiáng)記憶力、 促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等作用[3～5]。 燕窩、 乳和禽蛋中具有豐富的唾液酸， 是人體攝入唾液酸的重要天然食物來源[6]。 已有研究成功分離雞蛋中唾液酸， 從而用于食品添加劑及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。 因此， 禽蛋中唾液酸含量的測定具有十分重要的意義[7]。

現(xiàn)有關(guān)于唾液酸測定的國家標(biāo)準(zhǔn)是GB/T30636-2014 《燕窩及其制品中唾液酸的測定 液相色譜法》， 但該方法適用范圍較窄， 且采用陽離子交換色譜柱， 為非常規(guī)液相色譜柱。 另有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3644-2013 《出口燕窩及其制品中唾液酸的測定方法》， 同樣適用基質(zhì)單一， 且前處理復(fù)雜。 目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的對食品中唾液酸的測定方法有分光光度法[8～9]、 氣相色譜法[10]、 高效液相色譜法[11～14]、離子色譜法[15]、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16～17]。 唾液酸沒有發(fā)色基團(tuán)， 屬于糖類化合物， 且很少以游離的形式存在， 采用分光光度法、 氣相色譜法和液相色譜法通常要進(jìn)行衍生化處理， 前處理復(fù)雜且衍生試劑干擾較大， 缺乏特異性， 易造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、 定性定量準(zhǔn)確、 分析快速等優(yōu)點(diǎn)， 但研究報(bào)道多用于燕窩、 乳及其制品的分析。 本研究擬通過對雞蛋中唾液酸進(jìn)行酸水解提取， 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定， 避免使用復(fù)雜的衍生化前處理操作， 建立對雞蛋中唾液酸含量的測定方法。

一、 材料與方法

（一） 儀器與試劑API 4000 質(zhì)譜儀 （美國愛博才思分析儀器公司）； U3000 液相色譜儀 （美國賽默飛世爾科技公司）； Direct-Q 超純水機(jī) （美國默克密理博公司）； 冷凍離心機(jī) （德國艾本德公司）； MS6035 電子天平、 XSE205 電子天平 （瑞士梅特勒-托利多有限公司）。 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （北京曼哈格公司）； 乙腈 （色譜純， 美國賽默飛世爾科技公司）； 甲酸銨 （分析純， 成都市科龍化工試劑廠）。 樣品： 市售雞蛋。

（二） 試驗(yàn)方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。 取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 精密稱取20 mg， 置于20 mL 容量瓶中， 加水適量超聲處理1 min， 充分溶解后用水定容至刻度， 搖勻，即得唾液酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液， 濃度為1 mg/ mL， 于4℃下避光保存。 臨用時(shí)， 取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.1 mL 置于10 mL 容量瓶中， 用80%乙腈水溶液稀釋至刻度， 搖勻， 即得唾液酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 濃度為10 μg/mL。 分別取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.05、 0.10、0.20、 0.30、 0.40、 0.50 mL 置于10 mL 容量瓶中，用80%乙腈水溶液稀釋至刻度， 搖勻， 即得唾液酸濃度分別為50、 100、 200、 300、 400、 500 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.樣品前處理。 取均質(zhì)試樣0.5 g， 置于100 mL具塞錐形瓶中， 加入2 mol/L 乙酸溶液10 mL， 振搖1 min， 置于90 ℃水浴中水解2 h， 冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至10 mL 比色管中， 用水定容至刻度， 搖勻。全部轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中， 以8 000 r/min 離心10 min， 取上清液0.1 mL 置于20 mL 容量瓶中，用80%乙腈水溶液稀釋至刻度， 搖勻， 以8 000 r/min離心5 min， 取上清液過0.22 μm 濾膜， 待測定。

3.液相色譜條件。 流動相乙腈-水 （10∶90，V∶V）， 等度洗脫； 液相色譜柱為Acclaim C18柱（3.0 mm×100 mm， 3 μm， 美國賽默飛世爾科技公司）； 柱溫35℃； 流速0.4mL/min； 進(jìn)樣體積2μL。

4.質(zhì)譜條件。 電噴霧電離源（Electric spray ion source， ESI）， 負(fù)離子模式； 掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測 （Multiple reaction monitoring， MRM）； 離子噴霧電壓-4 500 V； 離子源溫度500℃； 噴霧器壓力379.21 kPa； 輔助加熱器壓力344.74 kPa； 碰撞室入口電壓-10 V； 碰撞室出口電壓-14 V； 目標(biāo)化合物母離子、 子離子等詳細(xì)參數(shù)見表1。

5.方法學(xué)考察試驗(yàn)。 對唾液酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣測定， 以唾液酸濃度為橫坐標(biāo)、 峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制工作曲線， 以考察線性范圍及曲線方程。 不斷對唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋， 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰響應(yīng)信噪比 （S/N） ＝3 時(shí)， 確定此濃度為方法的檢出限； 當(dāng)S/N＝10 時(shí)， 確定此濃度為方法的定量限。 按本研究前處理方法和儀器條件對樣品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn) （n＝6）， 以考察回收率及重復(fù)性。 采用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程與溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程的斜率之比（A/B） 作為考察唾液酸基質(zhì)效應(yīng)的方法[18～19]。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)＞1.2 時(shí)， 表明基質(zhì)增強(qiáng)； 基質(zhì)效應(yīng)＜0.8時(shí)， 表明基質(zhì)抑制； 0.8≤基質(zhì)效應(yīng)≤1.2 時(shí)， 表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

二、 結(jié)果與分析

（一） 液相色譜和質(zhì)譜條件的確定

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化。 以蠕動針泵連續(xù)進(jìn)樣的形式對唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣， 比較了在正離子和負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)， 采用Q1 進(jìn)行[M+H]+和[MH]-的準(zhǔn)分子離子掃描， 結(jié)果表明， 在負(fù)離子模式下， 唾液酸的質(zhì)譜響應(yīng)更高， 因此， 確定了以[MH]-的準(zhǔn)分子為母離子。 在子離子掃描 （MS2） 模式下， 手動優(yōu)化碰撞電壓， 選擇兩個(gè)豐度高的碎片作為定性定量子離子， 確定以m/z87.0 為定量離子，m/z170.0 為定性離子。 進(jìn)一步在MRM 模式下， 優(yōu)化兩個(gè)定性離子對的質(zhì)譜參數(shù)（碰撞能量和去簇電壓）， 得到的質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。

2.色譜柱的選擇。 基于唾液酸的理化性質(zhì)和色譜行為， 選擇了使用較為廣泛的C18色譜柱和Poroshell 120 HILIC-Z （美國安捷倫公司） 進(jìn)行比較。 HILIC 色譜柱為親水作用柱， 對極性強(qiáng)的化合物保留效果較好， 可使色譜峰出峰時(shí)間延后。 通過比較發(fā)現(xiàn)唾液酸的保留行為在這兩種色譜柱上有較大的差異， 在C18色譜柱上唾液酸保留能力較差，出峰時(shí)間較早， 在1.4 min 左右， 但峰形好、 靈敏度高， 而在HILIC 色譜柱上2 min 左右出峰， 出峰時(shí)間相對延后， 但呈現(xiàn)出峰拖尾、 展寬、 分叉等現(xiàn)象， 且靈敏度差。 綜合考慮， 最終選用C18色譜柱。

3.流動相的優(yōu)化。 考察了甲醇-5 mmol/L 甲酸銨、 乙腈-5 mmol/L 甲酸銨、 甲醇-水、 乙腈-水作為流動相的色譜分離效果。 考慮到唾液酸在C18色譜柱的保留能力較差、 出峰時(shí)間早， 為了更好地避免溶劑共流出， 延長保留時(shí)間， 因此首先采用梯度程序進(jìn)行洗脫。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 在以上體系的流動相中， 梯度洗脫效果較差， 目標(biāo)組分保留時(shí)間不能被延長且不能形成峰形良好的色譜峰。 隨后比較了以上4 種體系的等度洗脫， 發(fā)現(xiàn)在乙腈-水 （10∶90，V∶V） 體系中， 唾液酸峰形良好， 且相比甲酸銨體系， 靈敏度提高了10 倍以上。 因此最終采用乙腈-水（10∶90，V∶V） 進(jìn)行等度洗脫。 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對的MRM 圖見圖1。

圖1 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對的MRM 圖

（二） 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.提取溶劑的選擇。 唾液酸在酶或者酸的作用下， 可使結(jié)合態(tài)鏈斷裂， 形成游離態(tài)唾液酸。 酶解對酶的種類、 活力及酶解條件要求較高， 研究表明， 酸水解作用強(qiáng)于酶解， 已有文獻(xiàn)將鹽酸、 硫酸、 磷酸、 乙酸、 三氯乙酸等試劑用于唾液酸的水解， 特別用鹽酸進(jìn)行水解的報(bào)道最多[20～22]。 考慮到質(zhì)譜的特性， 應(yīng)選擇易揮發(fā)的溶劑進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，因此本研究選擇用乙酸作為水解用酸。

參考趙非等[11]確立的試驗(yàn)條件， 比較了樣品分別用1 mol/L 和2 mol/L 乙酸溶液， 在90 ℃酸水解1 h 的水解情況。 結(jié)果表明， 在2 mol/L 乙酸溶液水解條件下， 唾液酸提取效率較高， 為1 mol/L 乙酸溶液條件下唾液酸測定值的1.21 倍。

2.水解時(shí)間和溫度的選擇。 考察了用2 mol/L乙酸溶液作為水解酸， 在90℃水解溫度下， 分別水解1、 2、 3 h 的水解情況。 結(jié)果顯示， 水解1 h 條件下唾液酸含量為0.070%， 水解2 h 時(shí)唾液酸含量為0.081%， 水解3 h 時(shí)唾液酸含量為0.059%。 由此可知， 水解時(shí)間為2 h 時(shí)， 唾液酸提取效果最好。

用2 mol/L 乙酸溶液作為水解酸， 在水解時(shí)間為2 h 的條件下， 進(jìn)一步比較水解溫度80、 90、100℃的提取效果。 結(jié)果顯示， 當(dāng)水解溫度為100℃時(shí)， 水解液體易揮發(fā)干涸， 需要不斷補(bǔ)充水解溶液， 不易操作； 當(dāng)水解溫度為90℃時(shí)， 唾液酸提取效果最好（唾液酸測定值為0.081%）， 高于80℃水解時(shí)唾液酸測定值 （0.075%）。 因此， 確定水解時(shí)間為2 h， 水解溫度為90℃。

3.稀釋溶液的選擇。 樣品經(jīng)酸水解提取后， 溶液中目標(biāo)物濃度較高， 且酸度較大， 因此， 需對提取溶液進(jìn)行一定比例的稀釋以適應(yīng)質(zhì)譜檢測器測定條件。 根據(jù)唾液酸在質(zhì)譜儀的響應(yīng)繪制濃度適宜的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 將提取溶液進(jìn)行200 倍稀釋， 比較了水、 不同體積比例乙腈-水、 乙腈作為稀釋溶液時(shí)唾液酸的響應(yīng)及峰形。 結(jié)果表明， 當(dāng)使用80%乙腈水作為稀釋溶液時(shí)， 唾液酸峰形及響應(yīng)良好。

（三） 方法學(xué)考察

1.基質(zhì)效應(yīng)。 基質(zhì)是指樣品中待測目標(biāo)組分以外的會干擾檢測結(jié)果的組分， 當(dāng)干擾較小時(shí)， 可認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。 較大的干擾分為離子抑制和離子增強(qiáng)兩種形式， 在液相色譜-質(zhì)譜儀中， 離子抑制現(xiàn)象更容易發(fā)生[23]。 消除或減小基質(zhì)效應(yīng)常用的方法有使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正、 用基質(zhì)空白做標(biāo)準(zhǔn)曲線、 優(yōu)化前處理方法、 優(yōu)化色譜及質(zhì)譜條件等。

本研究考察了基質(zhì)效應(yīng)， 結(jié)果見表2。 結(jié)果表明， 唾液酸基質(zhì)效應(yīng)不明顯， 可能是因?yàn)闃悠诽崛『煤笥诌M(jìn)行了200 倍的稀釋再進(jìn)入質(zhì)譜儀， 不斷稀釋樣品有助于削弱基質(zhì)效應(yīng)， 同時(shí)采用80%乙腈水溶液作為稀釋溶劑， 乙腈具有顯著的沉淀蛋白的作用， 也能減少部分基質(zhì)效應(yīng)。 因此， 本研究采用80%乙腈水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

2.線性關(guān)系、 檢出限及定量限。 經(jīng)考察， 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在50～500 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 回歸方程為y＝1.82×103x+2.84×105， 相關(guān)系數(shù)為0.998 1。 方法檢出限為0.046 mg/kg， 定量限為0.15 mg/kg。

3.回收率及重復(fù)性。 按本研究確定的前處理方法和儀器條件對樣品進(jìn)行3 個(gè)水平 （0.10、 0.25、0.50 mg/kg） 的加標(biāo)回收試驗(yàn) （n＝6）， 結(jié)果見表3。結(jié)果顯示， 唾液酸回收率為81.0%～91.5%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%， 表明該方法準(zhǔn)確度好、 重復(fù)性佳。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）

（四） 實(shí)際樣品的測定采用所建立的方法對市售20 批次雞蛋樣品中唾液酸含量進(jìn)行檢測， 結(jié)果表明， 唾液酸的含量在0.061%～0.084%范圍內(nèi)。

三、 結(jié)論

本研究應(yīng)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了雞蛋中唾液酸的檢測方法。 研究過程優(yōu)化了液相及質(zhì)譜參數(shù)， 考察了提取溶劑、 水解酸、 水解溫度、 水解時(shí)間、 稀釋溶劑、 基質(zhì)效應(yīng)對唾液酸定量測定結(jié)果的影響。 最終確定的方法提取過程簡便、 分析快速、 精密度良好、 靈敏度高， 可有效用于對雞蛋中唾液酸的定量測定。

本文引用格式： 陽曦， 劉瑋， 張林， 等.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定雞蛋中的唾液酸 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全， 2023 （5）： 70-73.

YANG Xi， LIU Wei， ZHANG Lin，et al.Determination of sialic acid in eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry ［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 70-73.