新型稀土熒光探針對ClO^-的識別及其性能研究

代麗娜 張馨 張文月 張欣冉 崔希艷 張戈 張曼

摘 要：由于稀土離子具有優(yōu)良的熒光特性，因此把稀土離子作為制備熒光探針的理想材料。論文制備的稀土熒光探針是以水合肼、熒光素鈉、鄰甲氧基苯甲醛、硝酸銪為原料，采用水熱法進行合成。通過紅外光譜儀、核磁共振、紫外等手段對稀土熒光探針進行表征，再通過熒光光譜測試稀土熒光探針形成稀土熒光配合物后作為熒光分子探針對ClO-的識別檢測能力。結(jié)果表明，隨著ClO-濃度增加，熒光值也隨之增加，而探針本身不具有熒光，是與ClO-形成配合物后增強了其熒光值，可見稀土熒光探針對ClO-的識別能力很顯著。通過與CO32-、CH3COO-、Cl-、SO42-、NO2-、NO3-進行比較可得出，合成的稀土熒光探針對次氯酸根表現(xiàn)出良好的專一選擇性。

關(guān)鍵詞：稀土熒光探針；水合肼；硝酸銪；次氯酸根

中圖分類號：O614? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）09-0043-04

1 前言

次氯酸是含氧弱酸，多數(shù)情況下以次氯酸根離子形式存在，是重要的活性氧。在生物機體中，由于過氧化物酶的催化作用，次氯酸由氯離子和過氧化氫發(fā)生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生。在生物免疫系統(tǒng)中，HClO會凸顯出強氧化性，而次氯酸鹽含量的異常會引發(fā)心血管類疾病。因此大量學(xué)者展開了對次氯酸檢測的研究[1]。

吳綿園以7-（4-甲氧基苯基）乙炔基香豆素為熒光基團，設(shè)計并合成了一種香豆素酰腙類熒光探針L，向該探針溶液（pH=7.4）中加入Cu2+，觀察到顏色由黃色向淺棕色轉(zhuǎn)變和明顯的熒光猝滅效應(yīng)[2]。該探針不受其他金屬離子和陰離子的干擾，具有良好的抗干擾性、選擇性以及較高的靈敏度。胡敏通過浸漬法將Eu3+封裝在MOF-5孔道結(jié)構(gòu)中，制備出一種新型Eu3+功能化MOF-5（Eu3+MOF-5）發(fā)光金屬有機框架材料[3]。Eu3+MOF-5在394nm波長激發(fā)下表現(xiàn)出Eu3+特征熒光峰，在有機溶劑及水中具有良好的熒光穩(wěn)定性，且顯現(xiàn)對Fe3+的選擇性和抗干擾能力良好。盧玉偉將4-溴-1，8-萘二甲酸酐作為原料，通過氨解、肼解等反應(yīng)步驟合成了受體化合物L(fēng)[4]。采用熒光滴定法研究了受體L與甲醛間的相互作用情況，結(jié)果表明，受體L表現(xiàn)出對甲醛較好的識別作用。通過核磁滴定實驗驗證了受體L與甲醛之間的作用機制，即L中的肼基（-NHNH2）與甲醛縮合形成腙，導(dǎo)致體系熒光增強[5]。劉艷玲以2，7-二溴-9-芬酮為原料，合成了一種新型的turn-on型ClO-熒光探針[6]。在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，逐漸滴加ClO-，使其濃度不斷地增大，探針在511 nm位置的峰值也越來越大，呈綠色熒光發(fā)射。探針與ClO-反應(yīng)迅速，10s內(nèi)反應(yīng)完成。細胞實驗表明探針可以在細胞水平檢測內(nèi)源性和外源性的ClO-。姜亞男以活性氧（ROS）和活性氮（RNS）為原料，合成了一種含有喹唑啉酮骨架的腙型熒光探針（HEMQ），并通對其結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明，探針在pH值8～10范圍內(nèi)對ClO-具有良好的選擇性和較好的靈敏度，并且響應(yīng)十分快速。加入ClO-后，HEMQ溶液的顏色呈現(xiàn)從黃色到無色的變化，因而可以作為ClO-的裸眼探針[7]。

探針實現(xiàn)了裸眼識別目標離子。曹小燕以丹皮酚和糠醛為原料，識別基團作為丙烯酸酯，熒光團為黃酮醇，設(shè)計并合成了探針，采用核磁共振和高分辨質(zhì)譜的方法證明其結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，探針HFAC對半胱氨酸（Cys）具有高效的檢測識別能力。同時，證實了探針是一種開關(guān)型熒光探針，熒光強度在525nm處與濃度在20-300μmol/L半胱氨酸范圍內(nèi)的呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系[8]。劉文芳用二乙基三胺五乙酸、釤稀土鹽和殺草強為原材料[9]，設(shè)計并合成了新型稀土熒光探針SmⅢ-dtpaa-bis，該探針用于檢測amitrole通過紅外光譜對該熒光探針結(jié)構(gòu)進行表征，再用熒光光譜及紫外可見光譜對該熒光探針光學(xué)性質(zhì)進行分析研究，探究了反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、溶液的酸堿度及殺草強濃度對該稀土熒光探針熒光光譜的影響[10]。姚飛以水溶態(tài)納米Eu3+和TiO2為原料用液相法制備熒光探針，采用紫外吸收和熒光光譜研究了其發(fā)光性質(zhì)和它與氯氰菊酯的相互作用，發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯對熒光探針有猝滅作用。氯氰菊酯濃度與熒光探針熒光強度正相關(guān)，稀土銪熒光探針對氯氰菊酯檢出限為2.5×10－11mol/L。用稀土銪熒光探針進行數(shù)據(jù)檢測具有重現(xiàn)性和靈敏性好等特點[11]。黃蕊基于靶向線粒體的熒光HClO/ClO-探針繼續(xù)開發(fā)具有遠紅外至近紅外發(fā)射的HClO/ClO-探針。HClO/ClO-在線粒體中的分泌影響著細胞生理活動及病理活動。本文將探針檢測根據(jù)不同類型的氧化反應(yīng)進行歸類總結(jié)，為開發(fā)更高效、更精準的HClO/ClO-探針提供幫助[12]。本文以水合肼、熒光素鈉、鄰甲氧基苯甲醛、硝酸銪為原料，采用滴定加入法合成了一種對次氯酸具有獨特識別功能的新型熒光探針。

2 新型稀土熒光探針對ClO-的識別實驗

2.1 實驗試劑

熒光素；水合肼；乙腈；乙醚；液相色譜淋洗液；無水乙醇；鄰甲氧基苯甲醛；硝酸銪；乙酸鎂；次氯酸鈣；碳酸鎂；氯化亞鐵；硝酸鋇；硫酸鎂。

2.2 實驗儀器

超聲波清洗機器（15-1729型），寧波新枝生物科技股份公司出品；臺式高速離心機（DZF-6020AF），北京普析通用儀器公司出品；磁力加熱攪拌器（Feb-78型），上海萃瑞生物科技有限公司出品；電熱鼓風(fēng)干燥箱（WRS-1B）鄭州鑫涵儀器設(shè)備有限公司出品；循環(huán)水式真空泵（SHD-111），沈陽海普瑞儀器公司出品；傅里葉譜變換紅外光譜儀Nicolet iS5型，北京普析通用儀器公司出品。

2.3 實驗步驟

2.3.1 實驗原理

稀土銪離子由于其體積小，易鉆入探針內(nèi)部，與氧離子結(jié)合形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。如圖1和圖2所示。

2.3.2 合成中間體熒光素肼

確保反應(yīng)過程保持干燥狀態(tài)，用分析天平稱取7.8024g的熒光素鈉，將熒光素鈉與乙醇加入圓底燒瓶中混合均勻，攪拌并回流24h，并在回流過程中滴加水合肼10mL。反應(yīng)結(jié)束，將圓底燒瓶冷卻到室溫，再進行減壓抽濾，抽濾過程中要用少量的無水乙醇和乙醚分別洗滌產(chǎn)物兩次。最后，將產(chǎn)物放置在真空干燥箱中，在80℃的溫度下干燥產(chǎn)物約3h，得到熒光素肼白色中間體，計算產(chǎn)率約為62.81%。

2.3.3 制備稀土熒光探針

稱取0.0756g熒光素肼，用50mL無水乙醇將其溶解，之后稱取0.1662g的鄰甲氧基苯甲醛，用10mL無水乙醇溶解，之后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，配成10mol/L的鄰甲氧基苯甲醛乙醇溶液。將上述溶液滴加到蒸餾燒瓶中，控制滴加的速率，在10min之內(nèi)滴加完畢。稱取0.872g硝酸銪加入燒杯中，上述實驗操作需要恒溫回流13h，回流結(jié)束，進行減壓抽濾，期間使用少量的無水乙醇進行淋洗，所得產(chǎn)物在干燥箱中干燥8h后得到淺黃色的稀土熒光探針1.286g。

2.3.4 稀土熒光探針標準溶液的配制

稱取稀土熒光探針0.1250g，用乙腈15mL把稀土熒光探針溶解后，再配制成濃度為5mmol/L的溶液，進行冷藏避光儲存。測試使用時根據(jù)配比進行稀釋配制成相應(yīng)的溶液。

2.3.5 配制CO32-、SO42-、NO2-、NO3-、Cl-、CH3COO-的標準溶液

取含有CO32-、Cl-、NO3-、NO2-、SO42-、CH3COO-陰離子的鹽，按照0.01mol對應(yīng)的質(zhì)量進行稱量，將上述稱量好的陰離子鹽轉(zhuǎn)移至100mL的小燒杯，加入蒸餾水配制相應(yīng)濃度的溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 對稀土熒光探針的紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，進行傅里葉變換紅外光譜儀測試，對稀土熒光探針進行紅外表征。

如圖3所示，通過對熒光探針及稀土熒光探針進行紅外光譜分析可知，從紅外光譜圖中可以看到合成的探針配合物在3430cm-1有峰，可以將此峰歸屬為酚羥基O-H單鍵，與純熒光探針的酚羥基O-H單鍵相比較，發(fā)現(xiàn)稀土熒光探針的酚羥基O-H單鍵向高頻進行了移動，即發(fā)生了紅移。稀土熒光探針在1460cm-1處的峰是飽和甲基C-H單鍵峰，與純熒光探針的飽和甲基C-H單鍵相比較，形成稀土熒光探針后，酰胺和飽和甲基都受到稀土銪離子的影響，因此合成的稀土熒光探針的飽和甲基C-H單鍵發(fā)生藍移。同時也表明稀土熒光探針成功與銪發(fā)生配位，銪以離子的形式與探針1：3的配位形式存在。

3.2 熒光光譜法的研究結(jié)果

熒光光譜測試，隨著加入的ClO-的濃度增加，熒光強度的相應(yīng)變化線性關(guān)系是否明顯。

由圖4可以得出，向所制得的稀土熒光探針--Eu3+配合物中分別加入配制好的相同濃度的干擾陰離子CO32-、Cl-、CH3COO-、SO42-、NO3-、NO2-的標準溶液，其中，熒光探針固定濃度為2μmol/L。觀察此表可以得知只有ClO-的加入使得稀土熒光探針--Eu3+配合物的熒光強度明顯增強，而其他的陰離子熒光強度基本沒有影響。這說明稀土熒光探針--Eu3+對ClO-具有良好的選擇性。

3.3 熒光探針的紫外光譜分析

固定熒光探針溶液濃度為4μmol/L，分別配制濃度分別為1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L的次氯酸鈣溶液。將光譜掃描范圍坐標調(diào)為350～650nm，用紫外分光光度計分別測定以上6種不同濃度的溶液的吸光度，由此可以得出結(jié)論探針本身幾乎無熒光，隨著次氯酸根濃度的逐漸增加，吸光度逐漸增強，峰值逐漸增加。

3.4 探究不同pH值下稀土熒光探針的活性

結(jié)合圖5得出，在強堿條件下，稀土熒光探針的表面增加了缺陷，使探針表面附著著較少部分摻雜離子，因此表面的發(fā)光離子易發(fā)生非輻射的能量損失，使得稀土熒光探針的發(fā)光效率大大降低。當(dāng)溶液的pH值在5.00-8.00時，稀土熒光探針的熒光強度隨著pH值的增加逐漸趨向于穩(wěn)定：當(dāng)溶液的pH>5.00時，稀土熒光探針的熒光強度逐漸增強，在溶液的pH=6.00時，稀土熒光探針識別ClO- 的熒光強度達到峰值。隨后，隨著pH值增大，稀土熒光探針的熒光強度會下降。由此得出結(jié)論，稀土熒光探針的最佳適用范圍是pH=5.00-8.00。

4 討論

本文用熒光素、鄰甲氧基苯甲醛、水合肼、乙腈、硝酸銪為原料合成了稀土熒光探針。為使稀土熒光探針的高靈敏度呈現(xiàn)出分析價值，應(yīng)用時間分辨熒光分析技術(shù)消除背景熒光的影響，從而合成具有選擇性識別ClO-以及熒光響應(yīng)功能的稀土熒光探針。對稀土熒光探針以及添加了不同濃度次氯酸根的稀土熒光探針用紫外—可見分光光度計與熒光分光光度計進行測定，可以得知，隨著ClO-濃度增加，紫外吸收峰值也在增加，而探針本身不具有熒光，是與ClO-形成配合物后增強了熒光強度，可見稀土熒光探針對ClO-的識別能力很顯著。為了檢驗稀土熒光探針對ClO-的識別性和選擇性，分別加入NO3-、CH3COO-、Cl-、CO32-、NO2-、SO42-等干擾陰離子進行檢驗。結(jié)果表明，加入干擾陰離子后的稀土熒光探針熒光強度發(fā)生了微弱的變化，而加入ClO-的探針熒光強度明顯增強，得出的結(jié)論是稀土熒光探針對ClO-的識別不受干擾陰離子的影響，稀土熒光探針對識別ClO-具有良好選擇性與專一性。探究生物體與環(huán)境的酸堿性對該熒光探針應(yīng)用的影響，探究pH對加入ClO-前后溶液的影響，熒光強度在pH=5-8的溶液中達到峰值。說明稀土熒光探針對ClO-的檢測識別具有選擇性、高靈敏度特點。

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