一種基于萘酰亞胺神經(jīng)介質(zhì)模擬物熒光增強(qiáng)型探針

趙磊 陳康 程探宇

摘 要： 神經(jīng)毒劑，如沙林、梭曼和塔崩等都是劇毒的有機(jī)磷化合物，可以用作化學(xué)武器，主要是抑制乙酰膽堿酶的活性，進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂，所以快速方便地檢測(cè)此類化合物具有重要的意義.設(shè)計(jì)并合成了一種以萘酰亞胺為熒光團(tuán)、肼基作為活性基團(tuán)的快速響應(yīng)熒光探針（PND），該探針可用于檢測(cè)神經(jīng)毒劑模擬物：氯磷酸二乙酯（DCP）和氰基磷酸二乙酯（DCNP），而且表現(xiàn)出了高選擇性和高靈敏度.

關(guān)鍵詞： 熒光探針; 萘酰亞胺; 水合肼; 神經(jīng)性毒劑

中圖分類號(hào)： O 657.34? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)： 1000-5137（2020）02-0184-07

A naphthalimide-based fluorescence-enhanced probe for nerve agent mimics

ZHAO Lei， CHEN Kang， CHENG Tanyu^*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract： Neurotoxic agents，such as sarin，soman and tauben，are highly toxic organophosphorus compounds，which can be used as chemical weapons.These compounds mainly inhibit the activity of acetylcholine enzymes，which in turn cause nervous system disorders.Thus，it is greatly important to quickly and conveniently detect such compounds.Herein，a fluorescent probe（PND） based on naphthalimide and hydrazine group was developed，which displayed high selectivity and sensitivity for nerve agent mimicsdiethyl chlorophosphate（DCP） and diethyl cyanophosphonate（DCNP）.

Key words： fluorescent probe; naphthalimide; hydrazine hydrate; nerve agent

0 引 言

神經(jīng)毒劑，沙林、梭曼、塔崩等是一類具有致命劇毒性的有機(jī)磷化合物，如圖1所示，可用作化學(xué)武器等，其毒性高、致命快的特點(diǎn)，對(duì)人體安全構(gòu)成了威脅^[1-2].神經(jīng)毒劑生產(chǎn)成本低，簡(jiǎn)單易得，且廣泛使用^[3-5].這些無(wú)色無(wú)味的毒劑形式多樣，主要有氣體、氣溶膠或液體等形式，很容易被動(dòng)物和人類吸入，或通過(guò)皮膚接觸吸收，導(dǎo)致死亡.雖然一些國(guó)際條約禁止發(fā)展、生產(chǎn)和儲(chǔ)存化學(xué)武器，但一些國(guó)家仍在對(duì)其進(jìn)行研究^[2，5-6].神經(jīng)毒劑進(jìn)入人體的作用機(jī)制主要是抑制蛋白酶的活性，尤其是乙酰膽堿酯酶的活性.乙酰膽堿酯酶是人體內(nèi)的中樞神經(jīng)酶，神經(jīng)毒劑與膽堿酯酶結(jié)合成穩(wěn)定的磷酰化膽堿酯酶，使膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)突觸連接處的過(guò)度積累，會(huì)造成肌肉松弛障礙、神經(jīng)紊亂甚至死亡.因此，對(duì)于神經(jīng)毒劑的檢測(cè)變得尤為重要^[7-10].2016年，KIM等^[11]報(bào)道了一種熒光探針o-OH檢測(cè)神經(jīng)毒劑模擬物氯磷酸二乙酯（DCP），如圖2所示，該熒光探針o-OH能夠檢測(cè)和定量固定在固體基質(zhì)上的溶液和氣相中的有機(jī)磷神經(jīng)毒劑模擬物，通過(guò)抑制反應(yīng)性酚醛酸磷酸化后的內(nèi)旋，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光“打開(kāi)”響應(yīng)，探針o-OH在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中熒光信號(hào)很弱，熒光量子產(chǎn)率（Φ_F）為0.002，與DCP作用以后，得到探針o-Ophos，探針o-Ophos在DMF中表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)，Φ_F為0.490，具有選擇性好、靈敏度高、熒光信號(hào)變化明顯等優(yōu)點(diǎn).

由于神經(jīng)毒劑的毒性大且生產(chǎn)方便，發(fā)展高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)方法已成為該領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn).目前，基于電位法、表面聲波光譜法、酶法、電化學(xué)、氣相色譜/質(zhì)譜法等方法，已經(jīng)發(fā)展出多種檢測(cè)神經(jīng)毒劑的方法^{[10，12-14]}.這些方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可移植性好等優(yōu)點(diǎn)^[11].迄今為止報(bào)道的用于檢測(cè)有機(jī)磷神經(jīng)毒劑的熒光探針大多采用了常見(jiàn)的傳感方案^[15-17]，探針的響應(yīng)主要取決于神經(jīng)毒劑的親電性，從而導(dǎo)致磷酸鹽酯中間體的形成，將磷酸基通過(guò)親核反應(yīng)轉(zhuǎn)移到含氮（N）或氧（O）的基團(tuán)上，如羥基、氨基、肟基、羰基等，能調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）^[18]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等能量/電子/電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程^{[4，15，19-20]}.最后，這些探針可以被不同波段的光激發(fā)表現(xiàn)出不同的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)毒劑的檢測(cè).在各種熒光基團(tuán)中，萘酰亞胺熒光團(tuán)顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，例如，高發(fā)光量子產(chǎn)率、強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，以及易于支架修飾等特點(diǎn)^[21-23].本文作者通過(guò)萘酰亞胺為母體和水合肼反應(yīng)形成探針PND，用于快速、靈敏地檢測(cè)神經(jīng)毒劑模擬物.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

主要儀器：核磁共振儀（400 MHz），DRX-400，Bruker;紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，UV-3900，Hitachi;熒光光譜儀，F(xiàn)-7000，Hitachi.

主要試劑：二氯甲烷（泰坦科技），無(wú)水乙純（泰坦科技），石油醚（泰坦科技），乙酸乙酯（泰坦科技），甲醇（泰坦科技），柱層析硅膠（200～300目，黃海），乙腈（安耐吉），N，N-二異丙基乙胺（分析純AR，麥克林），乙二醇單甲醚（分析純AR，麥克林），DCP，氰基磷酸二乙酯（DCNP），水合肼（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，安耐吉），N，N-二甲基甲酰胺（安耐吉），4-溴-1，8-萘二甲酸酐（安耐吉）.

1.2 實(shí)驗(yàn)合成

1.2.1 化合物2的合成^[24]

如圖3所示，首先將4-溴-1，8-萘二酸酐（831 mg，2.9 mmol）和正丁胺（279 mg，3 mmol）放入50 mL的燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇溶解，混合物加熱回流5 h.反應(yīng)完全后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，經(jīng)柱層析（V（石油醚）/V（二氯甲烷）=1∶2）純化粗殘?jiān)玫郊儍舻幕衔?為淡黃色固體（877 mg，74%產(chǎn)率）.¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）δ，8.57（dd，J=7.3，1.2 Hz，1H），8.47（dd，J=8.5，1.1 Hz，1H），8.33（d，J=7.8 Hz，1H），7.95（d，J=7.9 Hz，1H），7.76（dd，J=8.5，7.3 Hz，1H），4.15～4.02（m，2H），1.70～1.58（m，2H），1.43～1.30（m，2H），0.90（t，J=7.4 Hz，3H）.¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）δ，163.52，133.08，131.91，131.10，131.02，130.53，130.08，128.90，128.00，123.12，122.26，40.36，30.16，20.36，13.82.

1.2.2 化合物PND的合成^[25]

如圖3所示，稱取1.0 g化合物2加入到燒瓶中，用10 mL乙二醇單甲醚溶解后120 ℃回流，直到溶液變得澄清，之后向燒瓶中緩慢滴加1 mL，80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水合肼攪拌10 min，在氮?dú)猓∟₂）保護(hù)的條件下回流4 h，TLC點(diǎn)板監(jiān)控反應(yīng)，反應(yīng)完全冷卻至室溫后，晶體過(guò)濾分離，用乙醇洗滌多次后，得到淡黃色固體PND 0.81 g，產(chǎn)率為94%.¹H NMR（400 MHz，DMSO-d₆） δ，9.12（s，1H），8.89～8.16（m，3H），7.63（t，J=8.0 Hz，1H），7.24（d，J=8.6 Hz，1H），4.67（s，2H），4.25～3.87（m，2H），1.82～1.49（m，2H），1.45～1.16（m，2H），0.92（t，J=7.3 Hz，3H）.

2 熒光探針的性能測(cè)試

2.1 PND反應(yīng)體系隨時(shí)間變化的測(cè)試

1 cm的石英比色皿中加入2 mL PND溶液（10 μL，10 μmol·L^-1），隨后加入DCP或DCNP（20 μL，20 μmol·L^-1），混合均勻后，在DMF中測(cè)試探針PND隨反應(yīng)時(shí)間的光譜變化.

2.2 PND反應(yīng)體系的濃度滴定實(shí)驗(yàn)

1 cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 μL，10 μmol·L^-1），隨后逐漸滴加DCP或DCNP（2 μL，2 μmol·L^-1），混合均勻后，在DMF中測(cè)試體系的光譜變化，滴加到體系熒光強(qiáng)度不再變化為止.

2.3 PND對(duì)不同神經(jīng)毒劑模擬物的選擇性實(shí)驗(yàn)

1 cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 μL，10 μmol·L^-1），隨后分別加入3種不同種類的神經(jīng)毒劑模擬物：甲基膦酸二甲酯（DMMP）、磷酸三乙酯（TEP）和磷酸三丁酯（HBT）（20 μL，20 μmol·L^-1），混合均與后，在DMF中測(cè)試PND對(duì)不同神經(jīng)模擬物的熒光強(qiáng)度變化.

3 結(jié)果與討論

3.1 PND反應(yīng)體系隨反應(yīng)時(shí)間的光譜變化

由于DCP和DCNP容易水解，選定DMF作為測(cè)試體系，為了確定PND與毒劑模擬物DCP和DCNP的反應(yīng)時(shí)間，首先測(cè)定了PND對(duì)DCP的響應(yīng)時(shí)間曲線，如圖4所示，探針PND（10 μL）在體系中，在420 nm出現(xiàn)了特征吸收峰，在加入20 μmol的DCP之后，溶液的紫外吸收光譜發(fā)生了藍(lán)移，圖4（a）所示，在380 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，在395 nm處有一個(gè)等吸收點(diǎn)，這可能是因?yàn)檫B接萘酰亞胺的N上的孤對(duì)電子被磷束縛，由于誘導(dǎo)反應(yīng)從而降低了N的給電子能力，導(dǎo)致了吸收的藍(lán)移.同時(shí)，如圖4（b）所示，探針PND初始熒光信號(hào)很弱，在加入DCP后，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，最終熒光強(qiáng)度穩(wěn)定不變，通由圖4（b）的插圖可以看出，加入DCP 5 min后熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，這表明DCP與PND基本反應(yīng)完全.由于DCP和DCNP有著類似的化學(xué)性質(zhì)，在相同條件下也能表現(xiàn)出非常相似的光譜變化.DCP和DCNP都可以使探針PND的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于肼基與磷酸二乙酯的結(jié)合導(dǎo)致探針母體的PET過(guò)程受阻，其反應(yīng)機(jī)制如圖5所示.

3.2 PND反應(yīng)體系的濃度滴定實(shí)驗(yàn)

對(duì)PND反應(yīng)體系進(jìn)行了濃度滴定實(shí)驗(yàn)，如圖6所示，在沒(méi)有DCP的情況下，幾乎沒(méi)有觀察到PND在DMF中的熒光強(qiáng)度，當(dāng)加入0.2當(dāng)量（即2 μL，2 μmol·L^-1）DCP時(shí)，探針的紫外光譜強(qiáng)度明顯降低和藍(lán)移，如圖6（a）所示.而在520 nm處的熒光迅速增強(qiáng)，如圖6（b）所示，隨著DCP的逐步滴加，熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)DCP物質(zhì)的量濃度達(dá)到20 μmol·L^-1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且穩(wěn)定不變.此外，從圖6（a），6（b）的插圖可以看出熒光和紫外展現(xiàn)出相似的結(jié)果，與自由探針PND相比，探針復(fù)合DCP后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了100倍，這些變化可歸因于磷酰胺阻斷了孤對(duì)電子的給電子能力，進(jìn)而導(dǎo)致PET關(guān)閉，使熒光增強(qiáng).圖6（c），6（d）為PND對(duì)DCNP物質(zhì)的量濃度滴定的紫外光譜和熒光光譜圖，由于DCNP和DCP有著類似的性質(zhì)，所測(cè)得的光譜幾乎一致.另外，如圖7所示，在DMF測(cè)試體系中，探針PND隨DCP濃度增大，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng).

3.3 PND對(duì)不同毒劑模擬物的選擇性實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定探針PND的選擇性，采用了3種有機(jī)磷化合物DMMP，TEP和HBT作為潛在的干擾物，如圖8所示.當(dāng)存在DCP和DCNP時(shí)，PND在520 nm處產(chǎn)生熒光的明顯增強(qiáng)，并且其他干擾物的溶液熒光沒(méi)有明顯變化.由此可見(jiàn)，探針PND對(duì)毒劑模擬物DCP和DCNP有很好的選擇性.

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)并合成了基于萘酰亞胺的熒光傳感器，用于神經(jīng)毒劑模擬物DCP和DCNP的檢測(cè)，隨著DCP或DCNP的加入，體系的熒光明顯增強(qiáng)（開(kāi)關(guān)響應(yīng)），另外探針PND對(duì)其他模擬物無(wú)明顯響應(yīng).因此，PND對(duì)神經(jīng)毒劑的檢測(cè)具有很高的靈敏度和選擇性.從基礎(chǔ)科學(xué)的角度來(lái)看，PND作為神經(jīng)毒劑探針具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如涉及簡(jiǎn)單的合成程序和實(shí)時(shí)檢測(cè)，并且可以提供顏色和熒光變化，以幫助實(shí)現(xiàn)更好的選擇性模式.總之，本文作者開(kāi)發(fā)了一種熒光增強(qiáng)型探針PND，可以高選擇性檢測(cè)神經(jīng)毒劑模擬物DCP和DCNP，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

參考文獻(xiàn)：

[1]???? LIU G，LIN Y.Electrochemical sensor for organophosphate pesticides and nerve agents using zirconia nanoparticles as selective sorbents [J].Analytical Chemistry，2005，77（18）：5894-5901.

[2]???? LEE H，KIM H J.Novel fluorescent probe for the selective detection of organophosphorous nerve agents through a cascade reaction from oxime to nitrile via isoxazole [J].Tetrahedron，2014，70（18）：2966-2970.

[3]???? WANG J，TIMCHALK C，LIN Y.Carbon nanotube-based electrochemical sensor for assay of salivary cholinesterase enzyme activity：an exposure biomarker of organophosphate pesticides and nerve agents [J].Environmental Science & Technology，2008，42（7）：2688-2693.

[4]???? DE GRENB D，MORENO D，TORROBA T，et al.Fluorescent discrimination between traces of chemical warfare agents and their mimics [J]. Journal of the American Chemical Society，2014，136（11）：4125-4128.

[5]???? JANG Y J，MURALE D P，CHURCHILL D G.Novel reversible and selective nerve agent simulant detection in conjunction with superoxide “turn-on” probing [J].Analyst，2014，139（7）：1614-1617.

[6]???? JANG Y J，TSAY O G，MURALE D P，et al.Novel and selective detection of tabun mimics [J].Chemical Communications，2014，50（56）：7531-7534.

[7]???? DE SOUZA L G，RENN M N，F(xiàn)IGUEROA-VILLARJ D.Coumarins as cholinesterase inhibitors：a review [J].Chemico-Biological Interactions，2016，254：11-23.

[8]???? XIE S S，WANG X，JIANG N，et al.Multi-target tacrine-coumarin hybrids：cholinesterase and monoamine oxidase B inhibition properties against alzheimer's disease [J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2015，95：153-165.

[9]???? ATRI A，F(xiàn)R?LICH L，BALLARD C，et al.Effect of idalopirdine as adjunct to cholinesterase inhibitors on change in cognition in patients with alzheimer disease：three randomized clinical trials [J]. JAMA，2018，319（2）：130-142.

[10]???? WANG X，LI P，DING Q，et al.Observation of acetylcholinesterase in stress-induced depression phenotypes by two-photon fluorescence imaging in the mouse brain [J]. Journal of the American Chemical Society，2019，141（5）：2061-2068.

[11]???? KIM T I，MAITY S B，BOUFFARD J，et al.Molecular rotors for the detection of chemical warfare agent simulants [J].Analytical Chemistry，2016，88（18）：9259-9263.

[12]???? GOSWAMI S，DAS S，AICH K.Fluorescent chemodosimeter based on spirobenzopyran for organophosphorus nerve agent mimics（DCP） [J].RSC Advances，2015，5（37）：28996-29001.

[13]???? HU X X，SU Y T，MA Y W，et al.A near infrared colorimetric and fluorometric probe for organophosphorus nerve agent mimics by intramolecular amidation [J]. Chemical Communications，2015，51（82）：15118-15121.

[14]???? MAHAPATRA A K，MAITI K，MANNA S K，et al.A cyclization-induced emission enhancement（CIEE）-based ratiometric fluorogenic and chromogenic probe for the facile detection of a nerve agent simulant DCP [J].Chemical Communications，2015，51（47）：9729-9732.

[15]???? VAN HOUTEN K A，HEATH D C，PILATO R S.Rapid luminescent detection of phosphate esters in solution and the gas phase using（dppe）Pt{S2C2（2-pyridyl）（CH₂CH₂OH）} [J].Journal of the American Chemical Society，1998，120（47）：12359-12360.

[16]???? ZHANG S W，SWAGER T M.Fluorescent detection of chemical warfare agents：functional group specific ratiometric chemosensors [J]. Journal of the American Chemical Society，2003，125（12）：3420-3421.

[17]???? DALE T J，REBEK J.Fluorescent sensors for organophosphorus nerve agent mimics [J].Journal of the American Chemical Society，2006，128（14）：4500-4501.

[18]???? BARBA-BON A，COSTERO A M，GIL S，et al.Highly selective detection of nerve-agent simulants with BODIPY dyes [J].Chemistry：A European Journal，2014，20（21）：6339-6347.

[19]???? ZHOU X，ZENG Y Y，CHEN L Y，et al.A Fluorescent sensor for dual-channel discrimination between phosgene and a nerve-gas mimic [J].Angewandte Chemie International Edition，2016，55（15）：4729-4733.

[20]???? XUAN W，CAO Y，ZHOU J，et al.A FRET-based ratiometric fluorescent and colorimetric probe for the facile detection of organophosphonate nerve agent mimic DCP [J].Chemical Communications，2013，49（89）：10474-10476.

[21]???? YAKUBOVSKYI V P，SHANDURA M P，KOVTUN Y P.Boradipyrromethenecyanines derived from conformationally restricted nuclei [J].Dyes And Pigments，2010，87（1）：17-21.

[22]???? ADARSH N，KRISHNAN M S，RAMAIAH D.Sensitive naked eye detection of hydrogen sulfide and nitric oxide by Aza-BODIPY dyes in aqueous medium [J].Analytical Chemistry，2014，86（18）：9335-9342.

[23]???? IEDA N，HOTTA Y，MIYATA N，et al.Photomanipulation of vasodilation with a blue-llight-controllable nitric oxide releaser [J]. Journal of the American Chemical Society，2014，136（19）：7085-7091.

[24]???? UN H I，WU S，HUANG C B，et al.A naphthalimide-based fluorescent probe for highly selective detection of histidine in aqueous solution and its application in in vivo imaging [J].Chemical Communications，2015，51（15）：3143-3146.

[25]???? TANG Y，KONG X，XU A，et al.Development of a two-photon fluorescent probe for imaging of endogenous formaldehyde in living tissues [J].Angewandte Chemie International Edition，2016，128（10）：3417-3420.

（責(zé)任編輯：郁 慧，包震宇）

收稿日期： 2019-11-19

基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金（21872095）

作者簡(jiǎn)介： 趙 磊（1993—），男，碩士研究生，主要從事小分子熒光探針?lè)矫娴难芯?E-mail：zhaolei19930923@163.com

通信作者： 程探宇（1983—），男，副教授，主要從事不對(duì)稱催化方面的研究.E-mail：tycheng@shnu.edu.cn

引用格式： 趙磊，陳康，程探宇.一種基于萘酰亞胺神經(jīng)介質(zhì)模擬物熒光增強(qiáng)型探針 [J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，49（2）：184-190.

Citation format：?ZHAO L，CHEN K，CHENG T Y.A naphthalimide-based fluorescence-enhanced probe for nerve agent mimics [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2020，49（2）：184-190.

DOI： 10.3969/J.ISSN.1000-5137.2020.02.008