褪黑素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

鄭君毅，李曉鳳，郭緒昆

心肌梗死是臨床常見病，具有很高的發(fā)病率和病死率。盡早恢復缺血區(qū)域血流，減少心肌細胞死亡是最行之有效的方法，但血流恢復可引起缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion injury，IRI），這也是亟需解決的問題。褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一種主要由松果體產(chǎn)生的高度保守的分子，除了具有激素功能外，還參與機體多種系統(tǒng)的調(diào)控。褪黑素具有高度的親脂性，可以自由穿過細胞膜，在心肌細胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，保護心肌細胞［1-2］。叉頭盒O亞型（FOXO）是一個轉錄因子蛋白家族，在進化上高度保守，包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6［3］。FOXO4 是FOXO 家族重要的成員，廣泛參與多種生理過程，如細胞增殖、分化、氧化應激反應和凋亡等。已有研究表明，F(xiàn)OXO4是蛋白激酶B（Akt）通路的下游分子，參與缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展［4］。FOXO4可以特異性結合B細胞淋巴瘤2樣11蛋白（BIM）啟動子，促進其轉錄，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。但Akt/FOXO4/BIM 通路是否參與褪黑素對心肌細胞IR損傷的保護作用，目前少見報道。本實驗旨在建立大鼠心肌細胞IRI模型，基于Akt/FOXO4/BIM信號通路探討褪黑素對心肌細胞保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 凋亡試劑盒購自萬類公司，兔源FOXO4、p-FOXO4、p-Akt、Akt 和BIM 一抗均購自CST 公司，小鼠源GAPDH 一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔和羊抗小鼠二抗購自Proteinteck 公司，ECL 化學發(fā)光試劑盒購自Millipore 公司。Akt 抑制劑MK2206 購自Selleck 生物公司。細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、青/鏈霉素、無糖DMEM培養(yǎng)液、TRIzol試劑購自賽默飛公司。MTT細胞增殖檢測試劑盒和褪黑素購自Sigma-Aldrich 公司。LDH 檢測試劑盒、RIPA、5×loading buffer、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自索萊寶公司。SYBR Green 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自羅氏公司；IL-6、TNF-α、MCP-1和GAPDH 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。1～3 日齡的新生SPF 級C57L/6 小鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 缺血再灌注模型的制作和分組 C57BL/6 新生小鼠40只，無菌條件下開胸取出心臟，PBS 沖洗以完全去除血跡。將心肌充分剪碎，加入0.08%胰蛋白酶和0.05%Ⅰ型膠原酶溶液，采用酶消化法提取小鼠原代心肌細胞［5］。將細胞分為正常對照組（CTRL 組，細胞在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)，不進行任何處理）；IRI 組：在實驗前將細胞培養(yǎng)液換為不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)液，在缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中處理45 min后取出細胞，補充20%FBS后在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 h；褪黑素組（IRI+MEL 組）：在IRI 實驗前12 h 加入褪黑素溶液（終濃度5 μmol/L），37 ℃培養(yǎng)12 h 后進行IRI 實驗；Akt抑制劑組（IRI+MEL+MK2206 組）：在褪黑素溶液加入前2 h加入MK2206（終濃度10 μmol/L），37 ℃培養(yǎng)2 h 后加入褪黑素繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后進行IR實驗。

1.3 細胞存活率檢測 各組實驗結束后，每孔加入MTT 溶液（5 g/L，pH=7.4）20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫下置于水平搖床上至結晶完全溶解。用酶標儀測定溶解液在490 nm波長處的吸光度（A）值。以CTRL 組的細胞存活率為100%，實驗組細胞存活率（%）=實驗組A值/CTRL組A值×100%。

1.4 細胞上清液LDH 含量檢測 實驗結束后，將細胞培養(yǎng)板用離心機400×g離心5 min。分別取各孔上清液120 μL，加入到新的96 孔板中。根據(jù)LDH 檢測試劑盒說明書，各孔分別加入60 μL 新鮮配制的LDH 檢測工作液，充分混勻，用鋁箔包裹后置于水平搖床上緩慢搖動，室溫孵育30 min 后，用酶標儀測定混合液在490 nm波長處A值，并計算各組LDH釋放量。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 根據(jù)凋亡試劑盒說明書，在實驗結束后，收集各組細胞上清液，用PBS 清洗細胞并收集清洗液。胰蛋白酶消化各組細胞后，將收集到的細胞上清液、PBS清洗液和細胞消化液合并，以1 000 r/min離心10 min以獲得細胞沉淀。用PBS洗滌細胞2次，棄掉上清液，將細胞沉淀重懸于500 μL 結合緩沖液中，并與5 μL 膜聯(lián)蛋白VFITC和10 μL碘化丙啶（PI）在室溫下避光孵育15 min。通過流式細胞儀測定各組的細胞凋亡率。

1.6 qRT-PCR檢測炎性因子基因表達 實驗結束后棄掉細胞培養(yǎng)液，TRIzol 法提取細胞RNA。取2 μg 總RNA，逆轉錄成cDNA。采用qRT-PCR 法，取0.5 μL cDNA，使用SYBR Green qPCR 試劑盒擴增靶基因白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和GAPDH。所用引物見表1。PCR 反應條件：94 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火/延伸30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各個靶基因的相對表達水平。

Tab.1 The primer sequences used for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列表

1.7 Western blot 法檢測蛋白表達 各組細胞總蛋白用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取，使用5×loading buffer 變性總蛋白。取20 μg 變性總蛋白進行SDSPAGE，電泳后將凝膠在4 ℃、110 V 條件下轉膜90 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜2 h 后，切取包含p-Akt、Akt、p-FOXO4、FOXO4、BIM、GAPDH 蛋白條帶的PVDF 膜，分別加入抗p-Akt、Akt、p-FOXO4、FOXO4、BIM（1∶1 000）或GAPDH（1∶10 000）抗體4 ℃孵育過夜。第2 天用TBST 洗膜后，加入1∶10 000稀釋的HRP標記二抗，室溫孵育1 h。再次用TBST 洗膜，在含有靶蛋白的PVDF 膜上滴加1 mL ECL 化學發(fā)光液反應1 min 后，在凝膠成像儀上曝光并分析蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 11.5 軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率和LDH釋放量比較 與CTRL組比較，IRI 組細胞存活率降低，LDH 釋放量升高（P＜0.05）。與IRI 組比較，IRI+MEL 組細胞存活率升高，LDH 釋放量降低（P＜0.05）；與IRI+MEL 組比較，IRI+MEL+MK2206組細胞存活率降低，LDH釋放量升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表2 各組細胞存活率和LDH釋放量比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表2 各組細胞存活率和LDH釋放量比較（n=6，）

＊P＜0.05；a與CTRL 組比較，b與IRI 組比較，c與IRI+MEL 組比較，P＜0.05；表3—5同。

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2.2 各組細胞凋亡率比較 與CTRL組比較，IRI組細胞早期和總凋亡率升高（P＜0.05）。與IRI 組比較，IRI+MEL 組細胞早期和總凋亡率降低（P＜0.05）；與IRI+MEL 組比較，IRI+MEL+MK2206 組細胞早期和總凋亡率升高（P＜0.05）。各組細胞晚期凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1、表3。

Fig.1 Flow cytometry assay of cell apoptosis圖1 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

Tab.3 Comparison of cell apoptosis between the four groups表3 各組細胞凋亡率比較（n=3，%，）

Tab.3 Comparison of cell apoptosis between the four groups表3 各組細胞凋亡率比較（n=3，%，）

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2.3 各組細胞炎性因子基因表達水平比較 與CTRL 組比較，IRI 組IL-6、TNF-α 和MCP-1 基因相對表達水平升高（P＜0.05）。與IRI 組比較，IRI+MEL組IL-6、TNF-α和MCP-1基因相對表達水平降低（P＜0.05）；與IRI+MEL 組比較，IRI+MEL+MK2206 組IL-6、TNF-α 和MCP-1 基因相對表達水平升高（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine gene expression levels between the four groups表4 各組細胞炎性因子基因表達水平比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine gene expression levels between the four groups表4 各組細胞炎性因子基因表達水平比較（n=3，）

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2.4 各組蛋白表達水平比較 與CTRL組比較，IRI組p-AKT蛋白表達水平降低，p-FOXO4和BIM蛋白表達水平升高（P＜0.05），與IRI組比較，IRI+MEL組p-AKT蛋白表達水平升高，p-FOXO4和BIM蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與IRI+MEL 組比較，IRI+MEL+MK2206 組p-AKT 蛋白表達水平降低，p-FOXO4 和BIM 蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖2、表5。

Fig.2 Western blot assay of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins圖2 Western blot檢測各組細胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表達水平

Tab.5 Comparison of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins between four groups表5 各組細胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表達水平（n=3，）

Tab.5 Comparison of p-AKT,p-FOXO4 and BIM proteins between four groups表5 各組細胞p-AKT、p-FOXO4和BIM蛋白表達水平（n=3，）

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3 討論

研究表明，褪黑素對缺血再灌注損傷的心肌細胞具有保護作用［6］。褪黑素不僅可以通過激活沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT3）信號通路減輕老年雄性大鼠心肌細胞的氧化應激和凋亡，改善缺血再灌注后心臟收縮功能，減少梗死面積［6］；還可以膜受體依賴的方式調(diào)控Notch1/Hes1/Akt 信號通路，恢復硫氧還蛋白系統(tǒng)，保護大鼠急性高血糖狀態(tài)下缺血再灌注損傷時的心臟［7］。對接受心臟搭橋手術的患者使用褪黑素，可以減輕心肌細胞炎癥、氧化應激和凋亡的程度，增加射血分數(shù)和減慢心率［8］。Zhang 等［9］研究結果證實褪黑素可以減輕IRI 心肌細胞凋亡和炎癥反應，這與本研究結果一致。雖然本研究在體外心肌細胞的培養(yǎng)和IRI模型的制作上與Zhang等［9］并不完全相同，但是都證實了褪黑素在IRI心肌細胞中的抗凋亡和抗炎作用。在機制上，與Zhang等［9］通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路研究褪黑素心肌細胞保護作用不同，筆者研究了褪黑素對Akt/FOXO4/BIM信號通路的作用。

Akt信號通路在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和在生理和病理生理條件下的存活方面發(fā)揮著核心作用［10］。FOXO4 是Akt 通路重要的下游分子，主要通過調(diào)控轉錄及信號轉導途徑，影響機體生理調(diào)節(jié)、應激反應、代謝、細胞凋亡和自噬等方面［11-12］。研究表明，F(xiàn)OXO4 在缺血再灌注引起細胞損傷中具有重要的作用［13-14］。IRI 時，F(xiàn)OXO4 轉移到細胞核，發(fā)揮其轉錄因子功能，促進環(huán)磷酸腺苷（cAMP）轉錄，抑制缺氧誘導因子1α（HIF1α），激活纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）；FOXO4還可誘導腫瘤壞死因子凋亡相關誘導配體（TRAIL）、Fas 細胞表面死亡受體配體（FasL）和BIM 等促凋亡信號通路的激活［13］，參與IRI。FOXO4 與凋亡家族蛋白BIM、B 淋巴細胞瘤-6（Bcl-6）等促凋亡蛋白的啟動子特異性結合，促進其轉錄，從而抑制B 淋巴細胞瘤-XL（Bcl-XL）等抗凋亡蛋白的轉錄，負性調(diào)節(jié)細胞增殖。以上研究提示，F(xiàn)OXO4 參與IRI，但FOXO4 是否參與褪黑素對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用，目前尚少見報道。

Akt/FOXO4/BIM信號通路在細胞凋亡中具有重要作用［15］。BIM 是僅含一個BH3 結構域的Bcl-2 蛋白家族促凋亡成員，可以與Bcl-2 家族所有的促生存蛋白結合，是一種重要的促凋亡分子。FOXO4通過與BIM 啟動子特異性結合，調(diào)節(jié)BIM 轉錄水平。Wang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，過表達FOXO4 能通過上調(diào)BIM 的表達來促進腎臟透明細胞癌的細胞凋亡，敲低BIM 能夠阻斷FOXO4 的促凋亡作用。這種FOXO4 依賴的BIM 促凋亡活性受到Akt 活性的調(diào)控。Lv 等［16］在人的MCF7 乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)，當Akt活化時，可以抑制FOXO4的轉錄，進而抑制BIM的轉錄；而PI3K抑制劑能夠促進FOXO4和BIM的轉錄，BIM 通過與抗凋亡蛋白相互作用，釋放Bax 和Bak誘導細胞凋亡。雖然本研究與Lv等［16］的研究采用不同的疾病模型，但是與其研究結果相似的是，本研究也發(fā)現(xiàn)褪黑素調(diào)控的Akt磷酸化水平升高通過抑制p-FOXO4 和BIM 蛋白表達，進而減少IRI 引起的細胞凋亡。

本研究初步探索了缺血再灌注損傷中褪黑素的保護機制，但褪黑素是如何調(diào)控Akt的磷酸化水平，是通過何種受體激活Akt/FOXO4/BIM 信號通路，還有待后期進一步深入研究，以期為褪黑素治療心肌梗死提供新的治療靶點和理論依據(jù)。