7 種殺菌劑對(duì)藜麥葉斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定及其分生孢子萌發(fā)形態(tài)的影響

呂 紅，秦 楠，田 淼，彭玉飛，任 璐，殷 輝，趙曉軍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太原 030031）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是莧科藜屬1 年生雙子葉草本植物，原產(chǎn)于安第斯山脈，在玻利維亞和秘魯已有5 000～7 000 a 的栽培歷史，是印第安人的傳統(tǒng)食物，因其具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被印第安人稱為“糧食之母”[1-3]。近年來(lái)，藜麥已發(fā)展成為雜糧“新寵”[4]。

我國(guó)藜麥種植與產(chǎn)業(yè)發(fā)展開(kāi)始于20 世紀(jì)90 年代，目前我國(guó)藜麥產(chǎn)區(qū)分布在內(nèi)蒙古、西藏、青海、河北、甘肅、山西、吉林、四川、北京等20 余省，2020 年我國(guó)藜麥種植面積約20 000 hm2，總產(chǎn)量約2.88 萬(wàn)t，種植面積和產(chǎn)量已躍居世界第3 位[5-6]。2008 年藜麥在山西省靜樂(lè)縣引種成功，自試種成功以來(lái)，藜麥種植面積逐年擴(kuò)大，當(dāng)前山西省藜麥種植面積超過(guò)4 000 hm2[7]，主要集中在忻州市靜樂(lè)縣、五臺(tái)縣、原平縣、繁峙縣、岢嵐縣等。靜樂(lè)縣是山西省主要藜麥產(chǎn)區(qū)，2022 年靜樂(lè)縣藜麥種植面積約3 300 hm2。目前藜麥產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)廣闊、發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁[8]。

鏈格孢葉斑病菌（Alternaria alternata）引起的鏈格孢葉斑病是藜麥常見(jiàn)的一種病害，在我國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)、西藏自治區(qū)和山西省藜麥種植區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響藜麥種植的經(jīng)濟(jì)效益[9-11]。該病害于6 月至8 月上旬發(fā)病，在葉片上形成黃綠或黃棕色近圓形病斑，表面附著黃綠色霉層，且多個(gè)病斑易連接成片，導(dǎo)致葉片枯裂易脫落。目前，主要通過(guò)化學(xué)藥劑來(lái)防治鏈格孢引起的植物病害，如陶航等[12]研究表明，嘧菌酯和吡唑醚菌酯乳油對(duì)芍藥黑斑病菌（A.alternata）的抑制作用較強(qiáng)；劉俏等[13]對(duì)櫻桃葉斑病菌（A.alternata）進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，250 g/L 嘧菌酯懸浮劑抑菌效果最好，其EC50值為1.26 μg/mL。目前仍未見(jiàn)使用登記的農(nóng)藥來(lái)防治藜麥病害，因此，對(duì)鏈格孢葉斑病的防治存在一定的盲目性。

本研究測(cè)定了7 種殺菌劑對(duì)藜麥鏈格孢葉斑病菌（A.alternata）的室內(nèi)毒力，以期為該病害的防治藥劑篩選奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 于山西省忻州市藜麥種植區(qū)（38.466 9°N，112.725 1°E）采集藜麥葉斑病葉片，經(jīng)前期分離鑒定確定該致病菌為鏈格孢葉斑病菌（Alternaria alternata）[11]。

1.1.2 供試藥劑 97.2% 咪鮮胺（Prochloraz）原藥，山東濰坊潤(rùn)豐化工有限公司；96.8%苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）原藥，杭州大陽(yáng)化工有限公司；98.4% 甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）原藥，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；95%腈菌唑（Myclobutanil）原藥，浙江禾本科技股份有限公司；95%丙環(huán)唑（Propiconazole）原藥，青島恒寧生物科技有限公司；97%啶酰菌胺（Boscalid）原藥，陜西美邦藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；92%吡唑萘菌胺（Isopyrazam）原藥，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司。以上原藥均用丙酮配制成10 000 μg/mL 的母液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基、儀器和設(shè)備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基1 000 mL：馬鈴薯浸粉6.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g（上述試劑為索萊寶公司，北京）。121 ℃高壓蒸氣滅菌20～30 min。試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備為超凈工作臺(tái)、滅菌鍋和恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 7 種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力[14]。將A.alternata置于PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，取菌餅（5 mm）備用；將滅菌后的PDA 培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右備用。用無(wú)菌水將7種殺菌劑母液分別稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，以藥劑∶PDA 體積比為1∶9 制備成含藥平板，含藥平板最終藥劑質(zhì)量濃度如表1 所示，在PDA 中加入相同體積的丙酮作為對(duì)照。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，重復(fù)3 次。培養(yǎng)7 d 后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。將菌餅接種到含有不同質(zhì)量濃度殺菌劑的PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算各個(gè)質(zhì)量濃度藥劑對(duì)代表性菌株的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

表1 7 種殺菌劑的藥劑質(zhì)量濃度Tab.1 Concentrations of the seven fungicides μg/mL

1.2.2 7 種殺菌劑對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用孢子萌發(fā)法測(cè)定殺菌劑對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力[15]。收集A.alternata在PDA上培養(yǎng)7 d 的分生孢子于1.5 mL 無(wú)菌離心管中，加入無(wú)菌水配成孢懸液（1.0×105個(gè)/mL）。采用涂片法，將含藥PDA均勻涂布于無(wú)菌載玻片（大小約2.5 cm×4.0 cm，厚度約1 mm）上，滴加孢懸液至上述涂片，并將涂片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行保濕，含藥涂片最終藥劑質(zhì)量濃度如表1所示。最后將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱，重復(fù)3 次；6 h 后鏡檢500 個(gè)分生孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算分生孢子萌發(fā)抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以各處理殺菌劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為自變量（x），相對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)抑制率的概率值為因變量（y），作毒力回歸直線得到回歸方程，求出有效抑制中濃度EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種殺菌劑在不同質(zhì)量濃度下A. alternata 菌絲生長(zhǎng)的抑制率

7 種殺菌劑在不同質(zhì)量濃度下對(duì)A.alternata菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響如表2所示。

表2 7 種殺菌劑在不同質(zhì)量濃度下對(duì)A. alternata 菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Tab.2 Effects of 7 fungicides on inhibition rates of mycelial growth of A. alternata at different mass concentrations

研究結(jié)果表明，7 種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用，且抑制率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（表2）。7 種供試藥劑中抑制作用最差的是甲基硫菌靈，最高質(zhì)量濃度下抑制率僅為45.5%；其余6 種殺菌劑對(duì)病原菌均有較好的抑制效果，其中腈菌唑抑菌效果最好，最高質(zhì)量濃度下抑制率達(dá)82.2%，其次依次為啶酰菌胺和苯醚甲環(huán)唑，最高質(zhì)量濃度下抑制率分別為81.6%和81.4%。

2.2 7 種殺菌劑對(duì)A. alternata 菌絲生長(zhǎng)室內(nèi)毒力的影響

研究結(jié)果表明，7 種供試殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果存在差異（表3），EC50值為0.1～1.0 μg/mL 的殺菌劑有5 種，分別為咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、啶酰菌胺、腈菌唑，其對(duì)應(yīng)的EC50值分別為0.19、0.26、0.47、0.67、0.68 μg/mL；EC50值為1～10 μg/mL 的殺菌劑有1 種，為吡唑萘菌胺，其EC50值為1.08 μg/mL；EC50值在100 μg/mL 以上的殺菌劑有1種，為甲基硫菌靈，其EC50值為245.45 μg/mL。結(jié)果表明，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡z的毒力最強(qiáng)；甲基硫菌靈對(duì)菌絲的毒力最弱。

表3 7 種殺菌劑對(duì)A. alternata 菌絲生長(zhǎng)室內(nèi)毒力的影響Tab.3 Effects of 7 fungicides on toxicity of mycelial growth of A. alternata

2.3 7 種殺菌劑在不同質(zhì)量濃度下A. alternata 分生孢子萌發(fā)的抑制率

研究結(jié)果表明，7 種殺菌劑對(duì)病原菌分生孢子的萌發(fā)都有不同程度的抑制作用，且抑制率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（表4）。7 種供試藥劑中抑制作用最差的是甲基硫菌靈，當(dāng)抑制率為72.3%時(shí)，質(zhì)量濃度已達(dá)800 μg/mL；其余6 種殺菌劑對(duì)病原菌均有較好的抑制效果，其中吡唑萘菌胺的抑菌效果最好，質(zhì)量濃度為1 μg/mL 時(shí)，抑制率可達(dá)76.9%。

表4 7 種殺菌劑在不同質(zhì)量濃度下對(duì)A. alternata 分生孢子萌發(fā)抑制率的影響Tab.4 Effects of 7 fungicides on inhibition rates of conidial germination of A. alternate at different mass concentrations

2.4 7 種殺菌劑對(duì)A. alternata 分生孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力及其萌發(fā)形態(tài)的影響

在供試藥劑質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，分生孢子的萌發(fā)率隨不同殺菌劑質(zhì)量濃度的升高而降低（表5），其中，EC50值為0.1～1.0 μg/mL 的殺菌劑有吡唑萘菌胺和啶酰菌胺，其EC50值分別為0.21、0.29 μg/mL；EC50值為10～100 μg/mL 的殺菌劑有丙環(huán)唑和腈菌唑，其EC50值分別為36.63、75.46 μg/mL；EC50值為100～500 μg/mL 的殺菌劑有咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑2種；其EC50值分別115.03、207.75 μg/mL；EC50值在500 μg/mL 以上的殺菌劑有甲基硫菌靈1 種，其EC50值為524.69 μg/mL。結(jié)果表明，吡唑萘菌胺和啶酰菌胺對(duì)病原菌分生孢子的毒力最強(qiáng)，甲基硫菌靈對(duì)病原菌分生孢子的毒力最弱。

表5 7 種殺菌劑對(duì)A. alternata 分生孢子萌發(fā)室內(nèi)毒力的影響Tab.5 Effects of 7 fungicides on toxicity of conidial germination of A. alternate

不同藥劑對(duì)病原菌分生孢子的萌發(fā)具有不同影響。在對(duì)照培養(yǎng)基上分生孢子從兩端或中間萌發(fā)，芽管形態(tài)正常，極少產(chǎn)生分枝（圖1-A）。在含咪鮮胺、啶酰菌胺和吡唑萘菌胺3 種藥劑培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 h，發(fā)現(xiàn)病原菌的分生孢子萌發(fā)后芽管頂端膨大且分枝增多（圖1-B、G、H）；在苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈、腈菌唑和丙環(huán)唑4 種含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 h，發(fā)現(xiàn)分生孢子芽管稍粗大、分枝稍增多（圖1-C～F）。

圖1 7 種不同質(zhì)量濃度殺菌劑處理病原菌6 h 后分生孢子和芽管的形態(tài)Fig.1 Morphology of conidia and germ tubes of the pathogen treated with different mass concentrations of seven fungicides for 6 h

3 結(jié)論與討論

多項(xiàng)研究表明，植物病原真菌直接或間接侵入寄主并在寄主內(nèi)定殖生長(zhǎng)是病害發(fā)生和擴(kuò)展的先決條件[16]。菌絲是病原菌侵染的關(guān)鍵，DAI 等[17]觀察粉紅單端孢Trichothecium roseum在蘋(píng)果上的侵染特性，發(fā)現(xiàn)其菌絲通過(guò)蘋(píng)果花柱縫隙侵入，最終引起果肉中心發(fā)病；同樣，分生孢子在病原菌的侵染與傳播過(guò)程中也扮演著重要的角色；丁正[18]研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果樹(shù)輪紋病病原Botryosphaeria dothidea最先通過(guò)分生孢子在蘋(píng)果枝條表面萌發(fā)進(jìn)行侵入。因此，研究藥劑對(duì)病原菌菌絲和分生孢子的室內(nèi)毒力能為田間化學(xué)藥劑的合理使用提供參考，且對(duì)病害的防治具有重要意義。咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑和丙環(huán)唑是一類對(duì)子囊菌具有較高活性的具有保護(hù)和鏟除效果的殺菌劑[19-20]；啶酰菌胺和吡唑萘菌胺是一類抑制真菌孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的保護(hù)治療性殺菌劑[21]。

本研究藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)與分生孢子萌發(fā)的抑制效果不同。7 種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲的毒力大小依次為咪鮮胺＞苯醚甲環(huán)唑＞丙環(huán)唑＞啶酰菌胺＞腈菌唑＞吡唑萘菌胺＞甲基硫菌靈，研究表明，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑?qū)见滄湼矜呷~斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，EC50值均在0.50 μg/mL 以下。段慧[9]對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)藜麥葉片上的A.alternata進(jìn)行室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，10%的苯醚甲環(huán)唑的EC50為0.27 μg/mL，本研究測(cè)得苯醚甲環(huán)唑的EC50為0.26 μg/mL，表明不同地區(qū)鏈格孢葉斑病菌A.alternata對(duì)苯醚甲環(huán)唑的室內(nèi)毒力差異不明顯。

7 種殺菌劑對(duì)鏈格孢葉斑病菌分生孢子的毒力大小依次為吡唑萘菌胺＞啶酰菌胺＞丙環(huán)唑＞腈菌唑＞咪鮮胺＞苯醚甲環(huán)唑＞甲基硫菌靈，研究表明，吡唑萘菌胺和啶酰菌胺對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制效果最好，EC50值均在0.50 μg/mL 以下，顯著高于其他殺菌劑，此外，這2 種藥劑可以導(dǎo)致病原菌分生孢子畸形萌發(fā)。對(duì)病原菌菌絲與分生孢子的毒力研究發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈在抑制病原生長(zhǎng)方面效果最差。

藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定表明，不同藥劑對(duì)病原菌的作用機(jī)理不同[22]，如吡唑萘菌胺、啶酰菌胺對(duì)病原菌的分生孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用，苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對(duì)病原菌的菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。因此，在田間防治過(guò)程中不同發(fā)病階段要針對(duì)性用藥。但藥劑毒力測(cè)定是藥劑與病原菌直接接觸而產(chǎn)生的效果，而藥劑在田間的防治效果還受到寄主植物、病原菌和所處環(huán)境條件的綜合影響，因此，需要衡量其實(shí)際防治效果，還需開(kāi)展進(jìn)一步田間試驗(yàn)。