藜麥內(nèi)生細(xì)菌LS3 發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑菌機(jī)制初探

秦 楠 ，任 璐 ，2，呂 紅 ，殷 輝 ，趙曉軍 ，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太原 030031；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省部共建），山西 太原 030031）

藜麥（Chenopodium quinoa）因其具有極高的營養(yǎng)價值在我國種植面積不斷擴(kuò)大，也伴隨著大量病蟲害的出現(xiàn)[1-2]。藜麥黑莖病是危害藜麥莖部的新病害，該病害的病原為Ascochyta caulina，為2017 年在山西忻州市靜樂縣首次發(fā)現(xiàn)，其病原為莖生殼二孢，典型癥狀是在莖上形成黑色壞死病斑，病斑可完全包裹莖，引起倒伏、籽?？瞻T和不育，最終造成藜麥損失巨大，甚至絕收[3]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是一類豐富的微生物資源，在作物保護(hù)方面發(fā)揮著重要的作用。其中，芽孢桿菌（Bacillusspp.）是對植物病害具有防治效果的有益微生物，其廣泛存在于自然界，具有繁殖速度快、能產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽孢以及抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)。芽孢桿菌可在植物根際土壤、植物組織體內(nèi)定殖，通過分泌抗菌物質(zhì)、與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)以及誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生相關(guān)防御酶等方式達(dá)到防治植物病害的目的[4-6]。生防細(xì)菌的發(fā)酵過程受多種因素的影響，例如培養(yǎng)基配方對該菌的菌體量、生長速度以及對靶標(biāo)菌的抑制效果等均有不同程度的影響，除此之外，相同屬、種生防細(xì)菌的最適發(fā)酵條件可能因?yàn)槠渖硖匦?、對環(huán)境的偏好性而不同，發(fā)酵條件的優(yōu)化有利于提高生防細(xì)菌的生防能力，為生防制劑的高效應(yīng)用提供理論支持[7-9]。

芽孢桿菌是生防制劑的重要資源之一，在生物防治中得到廣泛研究和應(yīng)用[10]，目前關(guān)于芽孢桿菌發(fā)酵條件的研究已有較多報(bào)道，黎燕珊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌HC-8 發(fā)酵條件經(jīng)過優(yōu)化以后，其最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為酵母蛋白胨培養(yǎng)基（YSP），最佳發(fā)酵條件為溫度37 ℃，初始pH 值6.0，轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量0.1%，裝液量20 mL/300 mL，發(fā)酵時間48 h，優(yōu)化后的方案可顯著提高HC-8 菌株的發(fā)酵產(chǎn)量；宋本超等[12]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌Z17-2 經(jīng)一系列發(fā)酵條件優(yōu)化后較優(yōu)化前發(fā)酵液菌體量提升了120%，抑菌活性提高43.8%；劉仕飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷絲核菌生防細(xì)菌XZ18-3 采用單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面法優(yōu)化以后，抑菌率為57.3%，比原發(fā)酵液提高了56.6%。

本研究以分離得到生防細(xì)菌LS3 發(fā)酵液的OD600值和對A.caulina的抑菌率為指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)方法對LS3 菌株發(fā)酵液培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為LS3 菌株后續(xù)作為生防菌制劑化商品的研究和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 藜麥黑莖病病原菌（Ascochytacaulina），從山西省靜樂縣娑婆鄉(xiāng)發(fā)病的藜麥植株上分離、純化獲得；拮抗細(xì)菌LS3，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果蔬病害課題組分離、純化并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 LS3 菌株的培養(yǎng)采用NA 培養(yǎng)基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 5.00 g、瓊脂粉20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值調(diào)至7.4～7.6）和NB 培養(yǎng)基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、氯化鈉5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

發(fā)酵條件優(yōu)化采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有BPY 培養(yǎng)基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、牛肉浸膏5.00 g、葡萄糖5.00 g、NaCl 5.00 g、蒸餾水1 000 mL），CM培養(yǎng)基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸膏5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），LB 培養(yǎng)基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、NaCl 10.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），NYBD 培養(yǎng)基（酵母浸膏5.00 g、牛肉浸膏8.00 g、葡萄糖10.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），YSP 培養(yǎng)基（蛋白胨10.00 g、蔗糖20.00 g、酵母浸膏5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。以上培養(yǎng)基pH 值均調(diào)至7.0。

LS3 菌株抑菌活性物質(zhì)檢測采用的鑒定培養(yǎng)基有酪蛋白培養(yǎng)基（瓊脂粉1.50 g、脫脂奶粉5.00 g分別溶于100 mL 蒸餾水中，兩液分開滅菌，待冷卻至45～55 ℃時將二者充分混勻），幾丁質(zhì)培養(yǎng)基（甲殼素15.00 g、酵母粉5.00 g、（NH4）2SO41.00 g、MgSO4·5H2O 0.30 g、KH2PO41.36 g、瓊脂15.00 g，蒸餾水定容至l 000 mL），茯苓粉培養(yǎng)基（K2HPO417.98 g、KH2PO46.80 g、茯苓粉4.00 g、酵母膏5.00 g、苯胺藍(lán)100 mg、瓊脂 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），羧甲基纖維素（CMC）培養(yǎng)基（CMCNa 5.00 g、K2HPO40.25 g、（NH4）2SO40.50 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、瓊脂20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃濕熱滅菌后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LS3 種子液及發(fā)酵濾液的制備

1.2.1.1 LS3 種子液的制備 將4 ℃條件保存的LS3 菌株劃線接種于NA 平板上，置于26 ℃培養(yǎng)箱活化24 h 后，挑取一環(huán)單菌落接種于NB 培養(yǎng)基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，得到LS3 種子液。

1.2.1.2 LS3 發(fā)酵濾液的制備 將LS3 的種子液按照1%（V/V）的接種量接入NB 培養(yǎng)基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束后，再于12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將離心上清液置于20 mL 規(guī)格的注射器中，在注射器出口處安裝0.22 μm 微孔濾膜，擠壓注射器，使液體從微孔濾膜中緩緩流出，得到生防細(xì)菌的發(fā)酵濾液，即生防細(xì)菌代謝物，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LS3 菌株發(fā)酵最佳培養(yǎng)基篩選 分別配制BPY、YSP、LB、NB、CM、NYBD 等6 種常用培養(yǎng)基，高壓滅菌處理，冷卻后將已搖好的LS3 種子液按1% 的接種量接入到上述6 種培養(yǎng)基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，以空白培養(yǎng)基作為對照，測定培養(yǎng)第24、48、72 小時的OD600值以及發(fā)酵終止后發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.3 LS3 菌株最佳碳源篩選 選取1.2.2 效果最佳的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，分別用等量的可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，保持其余成分不變配制對應(yīng)的培養(yǎng)基，高壓滅菌處理以后，將已發(fā)酵完成的LS3 發(fā)酵液按1%的接種量接入到上述7 種培養(yǎng)基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h。以不添加LS3 發(fā)酵液的培養(yǎng)基作為對照。測定培養(yǎng)第24、48、72 小時的OD600值以及發(fā)酵終止后發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳碳源。

1.2.4 LS3 菌株最佳氮源篩選 將篩選出的培養(yǎng)基作為最佳培養(yǎng)基，將篩選出的碳源最為最佳碳源進(jìn)行試驗(yàn)。分別用等量的蛋白胨、尿素、胰蛋白胨+牛肉膏、蛋白胨+牛肉膏、牛肉膏加酵母粉、蛋白胨+酵母粉、胰蛋白胨+酵母粉、牛肉膏+酵母粉+蛋白胨取代已篩出基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，保持其余成分不變配制對應(yīng)的培養(yǎng)基，高壓滅菌處理以后，將已發(fā)酵完成的LS3 發(fā)酵液按1%的接種量接入到上述8 種培養(yǎng)基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h。以不添加LS3 發(fā)酵液的培養(yǎng)基作為對照。測定培養(yǎng)第24、48、72 小時的OD600值以及發(fā)酵終止后發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳氮源。

1.2.5 LS3 菌株最佳發(fā)酵溫度篩選 將篩選出的培養(yǎng)基作為最佳培養(yǎng)基，將篩選出的碳源作為最佳碳源，將篩選出的氮源作為最佳氮源進(jìn)行試驗(yàn)。配制好培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌處理以后，將已發(fā)酵完成的LS3 發(fā)酵液按1%的接種量接入到上述培養(yǎng)基中，分別于35、30、28、26 ℃，轉(zhuǎn)速保持160 r/min 不變振蕩培養(yǎng)72 h。以不添加LS3 發(fā)酵液的培養(yǎng)基作為對照。測定培養(yǎng)第24、48、72 小時的OD600值以及發(fā)酵終止后發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.6 LS3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化 將1.2.2 中篩選出的培養(yǎng)基作為最佳培養(yǎng)基，將1.2.3 中篩選出的碳源作為最佳碳源，將1.2.4 中篩選出的氮源作為最佳氮源，將1.2.5 中篩選出的溫度作為最佳溫度進(jìn)行試驗(yàn)。使用正交試驗(yàn)L16（45）LS3 的發(fā)酵液轉(zhuǎn)速、裝液量、pH、發(fā)酵時間、接種量進(jìn)行優(yōu)化（表1）。每個不同處理重復(fù)2 次，測定培養(yǎng)第24、48、72 小時的OD600值以及發(fā)酵終止后發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳發(fā)酵條件。

表 1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experiment design of fermentation conditions

1.2.7 LS3 菌株抑菌相關(guān)酶活性測定

1.2.7.1 胞外蛋白酶活力 取5 g 脫脂奶粉制備蛋白培養(yǎng)基，將LS3 菌株點(diǎn)接于培養(yǎng)基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產(chǎn)生[14]。

1.2.7.2 幾丁質(zhì)酶活力 稱取2 g幾丁質(zhì)，加入10 mL丙酮研磨，研磨過程中緩慢加入適量丙酮，使用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，直至其成糊狀為止。? ℃條件下邊攪拌邊加入濃鹽酸30 mL，繼續(xù)用磁力攪拌器攪拌2 h，在4 ℃的冰箱靜置24 h。將混合物加入到預(yù)冷的95%乙醇中，于4 ℃、5 000 r/min 進(jìn)行離心，除去上清液，再加入預(yù)冷的無菌水離心，除去上清液，反復(fù)多次，直至上清液為中性為止。收集膠體幾丁質(zhì)沉淀，即制成膠體幾丁質(zhì)。將多余的膠體幾丁質(zhì)調(diào)整濃度為1%，避光保存于冰箱。只用膠體幾丁質(zhì)制成幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，將LS3 菌株點(diǎn)接于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產(chǎn)生[14]。

1.2.7.3 β-l，3-葡聚糖酶活力 取5 g 茯苓粉配制茯苓培養(yǎng)基，將LS3 菌株點(diǎn)接于培養(yǎng)基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產(chǎn)生[14]。

1.2.7.4 纖維素酶（β-1，4-葡聚糖酶）活性 配制羧甲基纖維素培養(yǎng)基，將LS3 菌株點(diǎn)接于培養(yǎng)基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養(yǎng)48 h，使用1 mg/mL 的剛果紅染色30 min，然后用1 mol/L 的NaCl 浸泡20 min，使用無菌水沖洗掉表面附著的剛果紅，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；采用Duncan 氏新復(fù)極差法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05 作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LS3 菌株發(fā)酵最佳培養(yǎng)基篩選

由圖1 可知，LS3 在不同培養(yǎng)基生長過程中表現(xiàn)出差異，在YSP 培養(yǎng)基中OD600值最大，在NB培養(yǎng)基中OD600值最小；在發(fā)酵72 h 后不同培養(yǎng)基中菌體生長量大小依次為YSP＞BPY＞NYBD＞LB＞CM＞NB。

圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵結(jié)束后對A.caulina的抑制效果也表現(xiàn)出差異，發(fā)酵濾液對A.caulina抑菌率最高的是YSP 培養(yǎng)基，抑菌率最低的是NB培養(yǎng)基；各培養(yǎng)基中發(fā)酵濾液對A.caulina的抑菌率大小依次為YSP（77.3%）＞NYBD（71.6%）＞BPY（70.7%）＞CM（69.6）＞LB（67.2%）＞NB（55.9%）。綜合分析，LS3 在YSP 培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物累積量最多，對A.caulina的抑菌率也最高。因此，將YSP 培養(yǎng)基作為LS3 的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 LS3 菌株最佳碳源篩選

圖2 為LS3 菌株在不同碳源培養(yǎng)基中發(fā)酵24、48、72 h 時的OD600以及發(fā)酵結(jié)束后對LS3 發(fā)酵濾液對A.caulina的抑制效果，其中，LS3 在不同碳源培養(yǎng)基生長過程中表現(xiàn)出差異，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中OD600值最大，在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中OD600值最?。辉诎l(fā)酵72 h 后不同碳源培養(yǎng)基中菌體生長量大小依次為葡萄糖＞蔗糖＞甘露糖＞麥芽糖＞甘露醇＞乳糖＞可溶性淀粉。

圖2 不同碳源培養(yǎng)基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different carbon source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同碳源培養(yǎng)基中發(fā)酵結(jié)束后對A.caulina的抑制效果也表現(xiàn)出差異，發(fā)酵濾液對A.caulina抑菌率最高的是以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，抑菌率最低的是以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基，不同碳源培養(yǎng)基中發(fā)酵濾液對A.caulina抑菌率大小依次為蔗糖＞葡萄糖（72.0%）＞麥芽糖（71.1%）＞甘露醇（70.2%）＞甘露糖（69.4%）＞乳糖（47.9%）＞可溶性淀粉（5.5%）。綜合分析，LS3 在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物累積量較多，對A.caulina的抑菌率也最高。因此，將蔗糖作為LS3 的最佳碳源。

2.3 LS3 菌株最佳氮源篩選

圖3 為LS3 菌株在不同氮源培養(yǎng)基中生長第24、48、72 h 下的菌體數(shù)量以及在72 h 下LS3 代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率，細(xì)菌隨著時間的生長在不同氮源培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯差異，其中，在以牛肉膏+酵母粉為氮源的培養(yǎng)基細(xì)菌數(shù)量最多，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量最少；不同氮源培養(yǎng)基中LS3 菌體數(shù)量大小依次為牛肉膏+酵母粉＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨＞牛肉膏+蛋白胨＞蛋白胨+酵母粉＞蛋白胨＞胰蛋白胨+酵母粉＞牛肉膏+胰蛋白胨＞尿素。

圖3 氮源培養(yǎng)基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同氮源培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h 以后，代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率也出現(xiàn)明顯差異，在以牛肉膏+酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑菌率最高，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物抑菌率最低；不同氮源培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率大小依次為牛肉膏+酵母粉（73.33%）＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨（73.1%）＞牛肉膏+蛋白胨（72.0%）＞蛋白胨+酵母粉（71.6%）＞胰蛋白胨+酵母粉（70.8%）＞牛肉膏+胰蛋白胨（68.7%）＞蛋白胨（66.8%）＞尿素（0.5%）。因此，選擇牛肉膏+酵母粉作為發(fā)酵LS3最佳氮源。

2.4 LS3 菌株最佳發(fā)酵溫度篩選

圖4 為LS3 菌株在不同生長溫度下第24、48、72 小時的細(xì)菌數(shù)量以及在第72 小時下LS3 代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑菌率，LS3 在不同發(fā)酵溫度下生長量表現(xiàn)出差異，同時間相比較，在28 ℃下進(jìn)行發(fā)酵時，菌體數(shù)量最多；不同溫度下培養(yǎng)LS3 72 h后培養(yǎng)基中菌體數(shù)量大小依次為28 ℃＞30 ℃＞26 ℃＞35 ℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different fermentation temperature on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同溫度下LS3 發(fā)酵72 h 后代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率也表現(xiàn)出差異，28 ℃下發(fā)酵代謝產(chǎn)物抑菌率最大，35 ℃下發(fā)酵代謝產(chǎn)物抑菌率最小；不同溫度下LS3 培養(yǎng)72 h 以后培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率大小依次為28 ℃（74.0%）＞30 ℃（71.5%）＞26 ℃（70.8%）＞35 ℃（68.8%）。因此，LS3 最佳發(fā)酵溫度選擇28 ℃。

2.5 LS3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

以轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、pH、發(fā)酵時間等5 個因素對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分別測定LS3 菌株在各個不同因素下生長72 h 后的細(xì)菌數(shù)量，結(jié)果如表2所示，第7 組水平組合為A2B3C1D3E4，LS3 發(fā)酵終止后菌體數(shù)量最多，OD600為2.281。通過分析極差可知，5 個試驗(yàn)因素對LS3 發(fā)酵菌體數(shù)量影響大小分別為pH（1.873）＞接種量（1.400）＞裝液量（0.566）＞發(fā)酵時間（0.472）＞轉(zhuǎn)速（0.409），優(yōu)化水平組合為A2B3C1D3E4，即轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量150 mL/300 mL，接種量1%，pH 值7.0，發(fā)酵時間96 h。

表2 LS3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)對菌體數(shù)量的分析Tab.2 Analysis of bacterial quantity by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

以轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、pH、發(fā)酵時間等5 個因素對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分別測定LS3 菌株在各個不同因素下生長72 h后細(xì)菌代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率（表3）。從表3 可以看出，第7 組水平組合A2B3C1D3E4 在LS3 發(fā)酵終止以后代謝產(chǎn)物對A.caulina的抑制率最大，為73.55%。通過分析方差可知，5 個試驗(yàn)因素對LS3 發(fā)酵代謝產(chǎn)物影響大小分別為pH（50.73）＞接種量（16.71）＞轉(zhuǎn)速（12.67）＞裝液量（8.08）＞發(fā)酵時間（3.91），優(yōu)化水平組合為A2B3C1D3E4，即轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量150 mL/300 mL，接種量1%，pH 值7.0，發(fā)酵時間96 h。

表3 LS3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)對抑菌率的分析Tab.3 Analysis of inhibition rate by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

結(jié)合分析不同水平條件發(fā)酵LS3 對菌體數(shù)量和抑菌率的影響，可知pH 對發(fā)酵過程影響最大。發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速130 r/min，最佳裝液量150 mL/300 mL，最佳接種量1%，最佳pH 值7.0，最佳發(fā)酵時間為96 h。

2.6 LS3 菌株抑菌相關(guān)酶活性測定

LS3 酶活性測定結(jié)果如圖5 所示。

圖5 LS3 酶活性測定Fig.5 Detection of LS3 enzyme activity

從圖5-A 可以看出，LS3 于酪蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，在該培養(yǎng)基表面出現(xiàn)明顯的透明圈，說明LS3可以分泌胞外蛋白酶。如圖5-B 所示，LS3 于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基生長48 h，在該培養(yǎng)基表面沒有產(chǎn)生較明顯的透明圈，說明LS3 無法分泌幾丁質(zhì)酶。如圖5-C 所示，LS3 于茯苓粉培養(yǎng)基生長48 h，在該培養(yǎng)基表面沒有出現(xiàn)較明顯的透明圈，說明LS3 無法分泌β-l，3-葡聚糖酶。如圖5-D 所示，LS3 于羧甲基纖維素培養(yǎng)基生長48 h，使用剛果紅染色結(jié)束，洗去培養(yǎng)基表面的剛果紅后出現(xiàn)明顯的透明圈，說明LS3 可以分泌β-1，4-葡聚糖酶。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，LS3 發(fā)酵所需最佳培養(yǎng)基為YSP 培養(yǎng)基，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏+酵母粉，發(fā)酵最佳溫度為28 ℃。正交優(yōu)化后，LS3 最佳發(fā)酵最佳條件為：轉(zhuǎn)速130 r/min、裝液量150 mL/300 mL、接種量1%、pH 值7.0、發(fā)酵時間96 h。

當(dāng)前在室內(nèi)條件下培養(yǎng)芽孢桿菌主要使用LB培養(yǎng)基[13]，但LB 培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌種類相對單一。黎燕珊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌HC-8的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為YSP；吳至美等[7]研究發(fā)現(xiàn)，成團(tuán)泛菌ZLSY20 菌株的最佳培養(yǎng)基為YSP，與本研究結(jié)果相似。

在細(xì)菌發(fā)酵的過程中，碳源、氮源、溫度、發(fā)酵時間、pH 等都是比較重要的條件，不同的細(xì)菌對以上不同的因子會出現(xiàn)不同的選擇差異性[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，LS3 菌株最佳碳源為蔗糖，但其對麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇等利用效果良好，說明LS3菌株對于碳源的選擇范圍較廣。在氮源篩選方面，LS3 菌株的最佳氮源為牛肉膏+酵母粉，對于蛋白胨、胰蛋白胨等其他氮源也可以利用，但是其在發(fā)酵過程中幾乎無法利用尿素。魏欣瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌ZKY01 在生長過程中利用尿素呈陽性；石玉星[19]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌MY1在發(fā)酵過程中，幾乎無法利用尿素，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似，因此，利用LS3 菌株在田間防治藜麥黑莖病時，應(yīng)當(dāng)控制或減少尿素的施用量。LS3 菌株在25～35 ℃范圍內(nèi)均能生長，表明該菌株對溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過正交試驗(yàn)對5 個因素進(jìn)行正交發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)LS3 菌株發(fā)酵過程中最適pH 值為7.0。劉冰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌GN232在pH 值為7.0 時獲得的發(fā)酵液對擠橙潰瘍病菌的抑制效果最強(qiáng)，與本研究結(jié)果相似。

對LS3 菌株的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，LS3 菌株可分泌β-1，4-葡聚糖酶及胞外蛋白酶，但不可以分泌幾丁質(zhì)酶和β-l，3-葡聚糖酶。蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，4-葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原菌的生長，是內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮拮抗作用的重要保障，LS3 菌株可通過胞外蛋白酶及β-1，4-葡聚糖酶分解真菌菌絲結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制菌絲生長。今后還可對LS3 菌株抑菌機(jī)制進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步探索其抗菌物質(zhì)成分。

近年來，芽孢桿菌作為安全、高效的生防菌株倍受人們關(guān)注，許多芽孢桿菌具有較廣譜的抑菌活性。陳照等[21]從檳榔樹根際土壤分離得到1 株貝萊斯芽胞桿菌HAB-9，研究發(fā)現(xiàn)，其對17 種常見的病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。高小寧等[22]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生枯草芽孢桿菌Em7 具有廣譜的抑菌活性，可以抑制10 多種常見的病原真菌，今后可以繼續(xù)挖掘LS3 菌株對其他病原菌的抑菌活性。