紅蕓豆根腐病拮抗內(nèi)生細菌的篩選和鑒定

趙 杰 ，田瓊金 ，聶蔓茹 ，池吉平 ，馬福嶸 ，趙曉軍 ，郝曉娟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，山西 太谷 030801；2.忻州市農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，山西 忻州 034099）

紅蕓豆（Phaseolus vulgaris）為豆科菜豆屬植物，因其抗旱能力強、生育期短、具有較高的經(jīng)濟價值而成為山西省旱區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中一類重要的雜糧[1]。根腐病是影響山西省紅蕓豆生產(chǎn)的重要因素之一，該病在紅蕓豆整個生育期均可發(fā)生，發(fā)病初期，根部和莖基部產(chǎn)生褐色或磚紅色斑點，后期病斑連片，發(fā)病嚴重時，地上部枯死，嚴重影響紅蕓豆的產(chǎn)量及品質(zhì)[2]。目前，合理輪作和使用化學藥劑是防治紅蕓豆根腐病的主要措施。比如，播種前可使用50%多菌靈可濕性粉劑拌種或35%多·福·克懸浮種衣劑包衣處理；苗期可使用75%百菌清可濕性粉劑噴霧處理；開花結(jié)莢后使用70%甲基托布津可濕性粉劑配成毒土撒于根際表面[3-5]。但長期使用化學藥劑會影響土壤微生物多樣性，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留增加，引起環(huán)境污染[6]。隨著人們對生態(tài)環(huán)境和食品安全重視度的日益提升，生物防治成為應(yīng)對植物病害的重要措施之一[7]。

內(nèi)生細菌是指定殖于健康植物內(nèi)部，對植物沒有危害的細菌[8]。有些內(nèi)生細菌具有抗菌、促生、與病原菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等有益生物學作用[9-10]。從土壤中分離篩選到的生防細菌常易受到環(huán)境影響而導(dǎo)致防效不穩(wěn)定，內(nèi)生細菌由于受到植物組織的保護，對外部環(huán)境因素依賴較少，因此，在土傳病害生物防治方面倍受關(guān)注[11]。從菜豆中分離篩選到的內(nèi)生拮抗細菌木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）CTA8689 菌株通過生產(chǎn)抗真菌化合物和胞外酶，在離體條件下抑制腐皮鐮孢菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，在盆栽試驗中對菜豆根腐病的防治效果可達87.60%[12]。內(nèi)生細菌Herbaspirillum lusitanumP6-12 菌株對根腐病菌具有抑制作用，并且能成功定殖于菜豆體內(nèi)[13]。王媛媛等[14]從大豆根瘤分離出的內(nèi)生細菌Snb2 對尖鐮孢菌和茄腐鐮孢菌具有拮抗作用，對幼苗的生長也有明顯的促進作用。韓祥東等[15]從大豆根系分離篩選得到4 株內(nèi)生細菌，對引起大豆根腐病的疫霉菌菌絲生長具有抑制作用，最高抑制率可達87.10%。張淑梅等[16]從大豆的根、莖、葉和種子中篩選到31 株對大豆根腐病菌具有抑制作用的內(nèi)生細菌。內(nèi)生細菌在生物防治方面具有較大的應(yīng)用潛力。

蒼耳是一種傳統(tǒng)藥用植物，在我國分布廣泛。謝仰熹等[17]在蒼耳中分離出了8 株內(nèi)生真菌，對番茄早疫病菌具有良好的抑制效果。蒼耳內(nèi)生放線菌多樣性豐富，李凱琴[18]在蒼耳中分離出24 株對黑曲霉、稻梨孢菌等病原菌具有拮抗活性的內(nèi)生鏈霉菌。目前尚鮮有對蒼耳內(nèi)生細菌的研究報道。

本研究從蒼耳中分離篩選對紅蕓豆根腐病菌具有抑制作用的拮抗內(nèi)生細菌并對其進行鑒定，同時對篩選出的菌株進行了抑菌作用、抑菌譜和安全性測定，以期為紅蕓豆根腐病生物防治提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 2022 年7 月從山西農(nóng)業(yè)大學校園采集蒼耳植株備用。

1.1.2 供試病原菌 尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、禾谷鐮孢菌（F.graminearum）、厚垣鐮孢菌（F.chlamydosporum）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）、層出鐮孢菌（F.proliferatum）、木賊鐮孢菌（F.equiseti）、擬輪枝鐮孢菌（F.verticillioides）、芬芳鐮孢菌（F.redolens）、腐皮鐮孢菌（F.solani），由山西農(nóng)業(yè)大學植物保護學院雜糧病害課題組分離保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，pH 值7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL；NB 培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；PDA 培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 蒼耳內(nèi)生細菌的分離

選取新鮮的蒼耳植株，用水洗凈，分別稱取5 g根、莖、葉組織，置于75%乙醇中浸泡5 min，使用無菌水清洗1 次，再在2.5%次氯酸鈉中浸泡3 min，最后用無菌水漂洗3 次。吸取第3 次漂洗液涂布至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）上，用于檢測組織表面是否消毒徹底。加入10 mL 無菌水對消毒后的組織材料進行研磨并進行梯度稀釋，取100 μL 稀釋液涂布于NA 平板上，在28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。待長出單菌落后，挑取單菌落進行純化后轉(zhuǎn)入試管斜面保存。

1.3 紅蕓豆根腐病拮抗細菌的篩選

以尖鐮孢菌（F.oxysporum）為靶標菌，采用平板對峙法篩選拮抗細菌[19]。選取培養(yǎng)5 d 的病原菌平板，使用無菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中央。吸取4 μL 內(nèi)生細菌發(fā)酵液接種在距病原菌2 cm濾紙片（直徑6 mm）上，每個平板接種4 個點，空白對照為只接種病原菌，每個處理重復(fù)3 次，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，7 d 后測定菌落直徑并計算抑制率。

1.4 xj-1-2 的鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 觀察xj-1-2 菌株單菌落形態(tài)，進行革蘭氏染色。

1.4.2 分子鑒定 使用細菌DNA 基因組提取試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）進行xj-1-2 菌株基因組DNA 的提取。選擇gyrB序列簡并引物gyrB-F（TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT）和gyrB-R（TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC）進行PCR 擴增。PCR 擴增體系總體積為25 μL，包括上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×Taq Mix 12.5 μL，ddH2O 補足至25 μL。PCR 擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果后，將擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 比對，用Mega 6.0 軟件采用比鄰法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 xj-1-2 對尖鐮孢菌菌絲生長的影響

將尖鐮孢菌菌餅（6 mm）接種于PDA 培養(yǎng)基中央，在距離菌餅2 cm 處點接xj-1-2，在兩者中間，插入滅過菌的蓋玻片，以不接種xj-1-2 的尖鐮孢菌為對照。28 ℃培養(yǎng)7 d 后，用鑷子取出蓋玻片，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.6 xj-1-2 對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響

將尖鐮孢菌培養(yǎng)5 d 后，往培養(yǎng)皿中加入無菌水，用滅菌涂布器刮下分生孢子，經(jīng)4 層紗布過濾后得到孢子懸浮液。xj-1-2 于28 ℃，180 r/min NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后獲得發(fā)酵液。將等量尖鐮孢菌孢子懸浮液和xj-1-2 發(fā)酵液混勻后，28 ℃培養(yǎng)，用無菌水代替xj-1-2 發(fā)酵液作為對照，每個處理重復(fù)3 次。分別在4、6、8 h 鏡檢，統(tǒng)計孢子總數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，計算孢子萌發(fā)率和抑制率。

1.7 xj-1-2 抑菌譜測定

平板對峙法同1.3，將xj-1-2 菌株與1.1.2 中的8 種供試病原菌進行對峙，每處理設(shè)3 個重復(fù)，于7 d 時測量菌落直徑并計算抑制率。

1.8 xj-1-2 對紅蕓豆種子萌發(fā)的影響

xj-1-2 菌株發(fā)酵液制備方法同1.6。發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min 離心5 min，棄上清液，余下部分重懸與無菌水混勻制成菌懸液。將發(fā)酵液和菌懸液濃度均稀釋至1×107、1×108、1×109cfu/mL 備用。取顆粒飽滿均勻的紅蕓豆種子，自來水沖洗干凈，用2%次氯酸鈉對紅蕓豆進行表面消毒3 min，無菌水沖洗3 次，晾干后，分別將已表面消毒的紅蕓豆浸泡于各稀釋梯度的發(fā)酵液和菌懸液中5 min，以無菌水浸泡的種子為對照，每皿9 粒，每個處理重復(fù)3 次，放置在25 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)，3 d 后測定發(fā)芽率、芽長。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 和SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析，采用LSD 法進行差異性顯著檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生拮抗細菌分離篩選結(jié)果

從蒼耳根、莖、葉中共分離得到36 株內(nèi)生細菌，從中篩選出1 株對尖鐮孢菌有顯著抑制作用的菌株，該菌株編號為xj-1-2（圖1），對尖鐮孢菌抑制率為64.29%。

圖1 內(nèi)生拮抗細菌篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of endophytic antagonistic bacteria

2.2 xj-1-2 的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學鑒定結(jié)果 在NA 培養(yǎng)基上，xj-1-2菌落呈乳白色，不透明，近圓形，表面稍有皺褶，中間部分凹陷呈火山口狀，不產(chǎn)色素（圖2-A）；革蘭氏染色反應(yīng)為陽性，菌體形態(tài)為桿狀（圖2-B）。

圖2 菌株xj-1-2 菌落形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The colony morphology of strain xj-1-2 and result of Gram staining reaction

2.2.2 分子鑒定結(jié)果 對xj-1-2 的gyrB基因進行PCR 擴增后得到920 bp 大小的基因序列。同源性比對表明，xj-1-2 與貝萊斯芽孢桿菌（登錄號CP050462.1）的相似性為99.78%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，xj-1-2 與貝萊斯芽孢桿菌聚為一個分支（圖3）。結(jié)合形態(tài)學與分子鑒定結(jié)果，將xj-1-2 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.3 xj-1-2 對尖鐮孢菌菌絲生長的影響

對照菌絲呈線狀平滑生長，分枝較少（圖4-A），與xj-1-2 共培養(yǎng)后，尖鐮孢菌菌絲分枝增多（圖4-B），生長受到抑制，產(chǎn)孢量減少。

2.4 xj-1-2 對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響

xj-1-2 對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響如表1所示。

表1 xj-1-2 對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of xj-1-2 on spore germination ofFusarium oxysporum %

由表1 可知，4 h 對照組萌發(fā)率為59.34%，而與xj-1-2 共培養(yǎng)的處理組尖鐮孢菌孢子沒有萌發(fā)；8 h對照組萌發(fā)率達到97.80%，而處理組萌發(fā)率僅為25.87%。4、6、8 h 時對照萌發(fā)率均顯著高于處理。xj-1-2 對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)抑制率在4、6、8 h 分別為100%、79.45%、73.54%。

2.5 xj-1-2 抑菌譜測定結(jié)果

由表2 可知，xj-1-2 對8 種供試病原真菌均有拮抗作用，其中對厚垣鐮孢菌（F.chlamydosporum）的抑制作用顯著高于其他病原真菌，抑制率為75.59%；對木賊鐮孢菌（F.equiseti）的抑制作用相對較差，抑制率為45.13%；對其他6 種病原真菌抑制率均在58.00%以上，說明xj-1-2 抑菌譜較寬，具有開發(fā)為生防制劑的潛力。

表2 xj-1-2 抑菌譜測定結(jié)果Tab.2 Measurement results of antifungal spectrum of xj-1-2 %

2.6 xj-1-2 對紅蕓豆種子萌發(fā)的影響

由表3 可知，經(jīng)濃度分別為1×107、1×108、1×109cfu/mL xj-1-2 菌株發(fā)酵液和菌懸液處理后的種子與對照相比，發(fā)芽率和芽長均無顯著差異，即該菌株不影響紅蕓豆種子萌發(fā)和生長。

表3 xj-1-2 對紅蕓豆種子萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of xj-1-2 on seed germination of red kidney bean

3 結(jié)論與討論

本研究以紅蕓豆根腐病病原菌尖鐮孢菌為靶標菌，從蒼耳中分離篩選到具有拮抗作用的內(nèi)生細菌菌株xj-1-2，結(jié)合形態(tài)學以及gyrB基因序列分析，將xj-1-2 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis），xj-1-2 能導(dǎo)致尖鐮孢菌菌絲分枝變多，抑制菌絲生長，降低產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率，從而影響病原菌的生長和繁殖。xj-1-2 對8 種供試病原真菌均有抑制作用，且不影響紅蕓豆種子萌發(fā)，具有進一步開發(fā)為生防菌劑的潛力。

貝萊斯芽孢桿菌作為一種生防細菌，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病害生物防治中。謝海鵬等[20]分離出的貝萊斯芽孢桿菌SD13 菌株對豇豆枯萎病的防治效果達62.0%。張慶琛等[21]從薄荷中分離得到貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株，對番茄黃萎病的防效為67.16%。此外，貝萊斯芽孢桿菌對番茄灰霉病菌[22]、棉花黃萎病菌[23]、白菜黑斑病菌[24]、稻瘟病菌[25]、油茶炭疽病菌[26]等均有不同程度的拮抗作用。目前，已有有效成分為貝萊斯芽孢桿菌的制劑，例如，四川百事東旺生物科技公司生產(chǎn)的貝萊斯芽孢桿菌母藥和200 億cfu/g 的水分散粒劑，能夠防治黃瓜、煙草的白粉病[27]；華中農(nóng)業(yè)大學研制出的貝萊斯芽孢桿菌CanL-30 可濕性粉劑，能夠防治油菜菌核病、黑脛病[28]；加拿大生產(chǎn)的Ataplan 和Arolist 生物殺菌劑，以Bacillus velezensisRTI301 為主要活性成分，可用來防治由鐮孢菌引起的玉米、大豆和向日葵根腐病[29]。

貝萊斯芽孢桿菌對病原菌菌絲和孢子萌發(fā)均有抑制作用，如劉雪嬌等[30]分離出的貝萊斯芽孢桿菌3A3-15 菌株能導(dǎo)致尖鐮孢菌菌絲扭曲、膨大、畸形，對孢子萌發(fā)抑制率達93.2%。潘夢詩等[31]分離出的貝萊斯芽孢桿菌BS-1 可使花生白絹病菌菌絲分枝增多，頂端膨大，出現(xiàn)斷裂。貝萊斯芽孢桿菌GDND-2 發(fā)酵濾液可延遲尖鐮孢菌孢子萌發(fā)2 h 以上，并促使菌絲提早分枝，菌絲產(chǎn)生畸形、皺縮、穿孔、泡囊化等現(xiàn)象[32]。本研究中貝萊斯芽孢桿菌xj-1-2 對尖鐮孢菌菌落生長具有明顯的抑制作用，可使菌絲分枝變多，與潘夢詩等[31]的研究結(jié)果一致，對孢子萌發(fā)的抑制作用與多人研究結(jié)果[30,32]相同，但未觀察到菌絲膨大、畸形、斷裂等現(xiàn)象。

貝萊斯芽孢桿菌的生防機理主要包括拮抗作用、競爭作用、誘導(dǎo)植物抗性等[33]。陳爽等[34]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌HM3-3 不但可以誘導(dǎo)大豆體內(nèi)過氧化物酶、多酚氧化酶等防御酶的活性，還可以通過分泌溶解酶，破壞病原菌的細胞壁。歐婷等[35]對貝萊斯芽孢桿菌SWUJ1 發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)進行分離純化，發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)生表面活性素、豐原素和伊枯草菌素等脂肽類抗生素。曾欣等[36]分離到的內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌，能夠產(chǎn)生蛋白酶、β-葡聚糖酶、嗜鐵素、伊枯草素、泛革素和表面活性素等。本研究獲得的貝萊斯芽孢桿菌xj-1-2菌株具有廣譜抑菌活性，但對其抑菌機理尚缺乏了解，在后續(xù)研究中，將對xj-1-2 菌株的抑菌機理展開深入研究，并對其室內(nèi)和田間生防效果進行測定。