HS-SPME結(jié)合GC-MS法測定松露中的揮發(fā)性成分研究

黃文芊,李雨龍,李 勇,侯 英*

（1.云南曾味食品有限公司，云南 昆明 650000；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000;3.云南華衡檢測技術(shù)有限公司，云南 昆明 650000）

松露是松露屬（Tuber）產(chǎn)量在商業(yè)貿(mào)易中的統(tǒng)稱，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、松露科（Tuberaceae），子實(shí)體生于地下，俗稱豬拱菌、黑菌和塊菇［1］。常與殼斗科、松科、樺木科、楊柳科等植物形成地下共生關(guān)系，其生長依賴于植物提供的有機(jī)物，同時(shí)能促進(jìn)宿主植物根系土壤養(yǎng)分、水分的吸收，在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要功能［2-3］。目前世界上發(fā)現(xiàn)的松露種類近100 種，其中法國的黑松露（Tuber Melanosporum）、意大利的白松露（Tuber Magnatum）以及中國的印度松露（Tuber Indicum）和中華夏松露（Tuber Aestivum）都極具商業(yè)價(jià)值，受到眾多食客的追捧。松露被冠以“餐桌上的黑鉆石”之稱，其獨(dú)特馥郁的香氣除受到眾多食客的追捧，更是吸引相關(guān)學(xué)者們對其開展各方面研究［4-6］。目前為止，從松露中已鑒定出約200多種香氣成分［7-8］，相關(guān)研究主要考察的是不同品種、地區(qū)對香氣成分的影響［9-12］。由于云南產(chǎn)松露種類繁多，其受云南特殊低緯高海拔及立體氣候等多因素的影響，云南產(chǎn)的松露種間差異較大。云南成熟松露采收通常在每年的11月至次年3月，但受利益驅(qū)使，通常每年7月就會(huì)上市大量不成熟的子實(shí)體，不但產(chǎn)品質(zhì)量和價(jià)值不高，且造成松露年產(chǎn)量逐漸下降。因此，亟待開發(fā)較為靈敏的測定方法對不同采收期松露的有效成分進(jìn)行識別，并為松露的資源保護(hù)提供基礎(chǔ)依據(jù)［13］。

松露中香氣成分的傳統(tǒng)提取方法有液-液萃取法、蒸餾法、靜態(tài)頂空法、動(dòng)態(tài)頂空法等。自20世紀(jì)90年代以來，固相微萃?。⊿PME）以其樣品用量少、操作簡單、快速且最大程度避免非揮發(fā)性組分污染的優(yōu)勢成為眾多學(xué)者研究微量揮發(fā)性成分的首選樣品處理方法［14-20］。試驗(yàn)采用頂空-固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對云南不同區(qū)域產(chǎn)地的印度松露香氣成分進(jìn)行檢測，同時(shí)對比不同印度松露的香氣成分特征，旨在了解不同產(chǎn)地印度松露中香氣成分的差異，為印度松露品質(zhì)判斷和松露香料產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

印度松露：采集云南不同產(chǎn)地的7個(gè)印度松露，每個(gè)樣品用錫箔紙包好后，存放于冷藏箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即于－18℃冰柜中冷凍保存，備用。樣品信息見表1。

表1 印度松露樣品信息

儀器與設(shè)備：7890B-5975B 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國安捷倫（Agilent）科技有限公司；HP-5MS 毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫（Agilent）科技有限公司；AB-204 電子分析天平，美國梅特勒（Mettler）公司；固相微萃取手柄，美國Supelco 公司；75 μm Carboxen- PDMS 固相萃取頭（黑頭）、85 μm PDMS/DVB 固相萃取頭（白頭）、100 μm PDMS 固相萃取頭（紅頭）、65 μm PDMS/DVB 固相萃取頭（藍(lán)頭）和30 μm PDMS/DVB 固相萃取頭（黃頭），美國Supelco 公司；22 mL 頂空瓶，美國安捷倫（Agilent）科技有限公司；LIDA 加熱攪拌臺，廣東科力達(dá)儀器有限公司；萘，99%，美國百靈威科技有限公司；乙醇，色譜純，美國迪馬公司。

1.2 方法

1.2.1 GC/MS 條件 氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為He，流速為1 mL/min，升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min，以2 ℃/min 升溫至100 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；離子源：EI 源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍40～350 amu。

1.2.2 數(shù)據(jù)檢索和計(jì)算 采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)NIST 15 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索和鑒定，以萘為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算松露樣品中揮發(fā)性成分的相對含量。

1.2.3 檢測方法 試驗(yàn)開始前，將萃取頭插入GC 進(jìn)樣口于300 ℃老化1 h，直至無雜峰出現(xiàn)。

配制萘溶液（內(nèi)標(biāo)）：取0.100 g 萘，用乙醇配制成濃度為100 μg/ mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。將松露在室溫下解凍，切成約2 mm×2 mm的碎片。準(zhǔn)確稱取制備好的樣品0.2 g 置于22 mL 頂空瓶中，同時(shí)在頂空瓶中加入1 μL濃度為100 μg/mL 的萘溶液作為內(nèi)標(biāo)，及時(shí)封好瓶蓋后，將頂空瓶放置于加熱攪拌臺上加熱，將固相萃取手柄插入頂空瓶內(nèi)并伸出萃取頭后進(jìn)行頂空萃取。

萃取條件的優(yōu)化包括：1）固定萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間70 min，解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間3 min，優(yōu)化萃取頭種類（白頭、黑頭、紅頭、黃頭和藍(lán)頭）；2）固定萃取頭黑頭，萃取時(shí)間70 min，解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間3 min，優(yōu)化萃取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃）；3）固定萃取頭黑頭，萃取溫度70 ℃，解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間3 min，優(yōu)化萃取時(shí)間（50 min、60 min、70 min 和80 min）；4）固定萃取頭黑頭，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min，解吸時(shí)間3 min，優(yōu)化解吸溫度（240 ℃、250 ℃、260 ℃和270 ℃）；5）固定萃取頭黑頭，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min，解吸溫度250 ℃，優(yōu)化解吸時(shí)間（1.0 min、2.0 min、3.0 min和4.0 min）。萃取完成后，將萃取頭插入GC 進(jìn)樣口上進(jìn)行解吸附，揮發(fā)性成分進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）在1.2.1 所述條件下進(jìn)行分離與鑒定，采用NIST 15 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索，以萘內(nèi)標(biāo)作為參考，對揮發(fā)性化合物進(jìn)行相對定量，以出峰數(shù)目和峰面積總量作為試驗(yàn)條件優(yōu)化的依據(jù)。

1.2.4 精密度檢測 為考察測定該方法的精密度，進(jìn)行6 次平行測定，并計(jì)算各成分6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5 松露香氣成分測定 采用試驗(yàn)所得的最優(yōu)萃取條件對來自不同產(chǎn)地的7 個(gè)印度松露樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分分析測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 松露的SPME優(yōu)化結(jié)果

從圖1可知，松露樣品中的揮發(fā)性成分均在50 min 內(nèi)完成出峰。出峰數(shù)為67 個(gè)，含量較高的物質(zhì)為己醛、乙酸、1-辛烯-3-醇等。

圖1 樣品的總離子流量圖（TIC）

2.2 最佳萃取條件

2.2.1 萃取頭 由圖2 可知，黑色萃取頭吸附松露的總峰數(shù)量為68 個(gè)，同時(shí)總峰面積達(dá)83.52%，為所有萃取頭中最優(yōu)，因此選擇黑色的萃取頭作為測定松露揮發(fā)性成分的萃取頭。

圖2 不同萃取頭對松露揮發(fā)性成分的萃取效果

2.2.3 萃取時(shí)間 由圖4 可知，在30～50 min，總峰面積變化不明顯?？偝龇鍞?shù)隨萃取時(shí)間增加而略有增加，在50 min 時(shí)總峰面積及總峰數(shù)均達(dá)到最高值，分別為77.65%與68 個(gè)。進(jìn)一步增加萃取時(shí)間到60 min，總峰面積和總峰數(shù)均下降，因此選擇50 min 作為萃取松露揮發(fā)性成分的最佳時(shí)間。

圖4 不同萃取時(shí)間對松露揮發(fā)性成分的萃取效果

2.2.2 萃取溫度 由圖3 可知，在一定溫度范圍內(nèi)松露揮發(fā)性成分總量隨溫度的升高而升高。當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，揮發(fā)性成分的總峰面積最高，達(dá)74.7%。同時(shí)，總峰數(shù)量也達(dá)67 個(gè)。但隨著溫度升高到80 ℃，總峰面積和總峰數(shù)均開始下降。綜上，選擇70 ℃為萃取松露揮發(fā)性成分的最佳溫度。

圖3 不同萃取溫度對松露揮發(fā)性成分的萃取效果

2.2.4 解吸溫度 從圖5 可知，在不同解吸溫度下松露揮發(fā)性成分總峰面積的總量分別為81.61%、82.37%、77.82%和80.94%。但根據(jù)總峰數(shù)情況來看，隨解吸溫度的升高，總峰數(shù)先升高，250 ℃時(shí)解吸得到物質(zhì)總量最多，為49個(gè)。但進(jìn)一步升溫，總峰數(shù)開始迅速減少。綜合總峰面積和總峰數(shù)的情況，最佳解吸溫度為250 ℃。

圖5 不同解吸溫度對松露揮發(fā)性成分的萃取效果

2.2.5 解吸時(shí)間 從圖6 可知，解吸時(shí)間為4 min 時(shí)揮發(fā)性成分的總峰面積達(dá)到最大，為82.18%，但總峰數(shù)僅35 個(gè)，明顯少于2 min解吸時(shí)間下的總峰數(shù)（40 個(gè)）。解吸時(shí)間為2 min時(shí)總峰面積（76.35%）雖略低于解吸時(shí)間為4 min 時(shí)的揮發(fā)性成分總峰面積，但總峰數(shù)比解吸時(shí)間為4 min 時(shí)多，即萃取的有效松露揮發(fā)種類更多，對萃取松露的特征揮發(fā)性香氣更為有利，因此，綜合選擇2 min 作為萃取松露揮發(fā)性成分的最佳解吸時(shí)間。

圖6 不同解吸時(shí)間對松露揮發(fā)性成分的萃取效果

2.3 測定方法的精密度

6 次測定的各揮發(fā)性組分的RSD值為2.58%～26.83%，其中萘（內(nèi)標(biāo)）的RSD值為11.48%，大部分揮發(fā)性成分的RSD值均小于20%，方法的精密度可滿足松露中揮發(fā)性成分的測定。

2.4 松露的香氣成分測定

試驗(yàn)通過樣品揮發(fā)性成分化學(xué)性質(zhì)的初步分類，可對云南省松露樣品香氣的復(fù)雜程度及香氣濃郁度進(jìn)行初步判定。由表2可知，不同產(chǎn)地來源的印度松露的主要揮發(fā)性成分有醇類、酯類、醛類和酮類等物質(zhì)，其中含量較多的是酯類和醛類，平均占比為31.89%和23.90%，而酮類物質(zhì)含量最少，為8.34%。

表2 不同產(chǎn)地印度松露的揮發(fā)性成分個(gè)數(shù)及其總量

各地印度松露的揮發(fā)性成分種類最多的是4#和5#，共鑒定出揮發(fā)性成分91 個(gè)，7#樣品中的揮發(fā)性成分個(gè)數(shù)最少，僅60 個(gè)。由此可推測，4#和5#的香氣豐富度比測定的其他松露樣品更高。不同產(chǎn)地印度松露的揮發(fā)性成分總量最多的是4#樣品，其揮發(fā)性成分總量為83.6%，香氣濃郁度最高。6#樣品鑒定出的成分總量最少，為66.7%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用頂空固相微萃取并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定松露中的揮發(fā)性成分，采用單因素對固相微萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的萃取優(yōu)化條件為采用黑萃取頭在萃取溫度為70 ℃，萃取時(shí)間為50 min 的條件下，將萃取完成后的萃取頭立即插入GC-MS 進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，解吸溫度為250 ℃，解吸時(shí)間2 min。同時(shí)，對方法的精密度進(jìn)行了評價(jià)，6 次測定的各揮發(fā)性組分的RSD值為2.58%～26.83%，大部分揮發(fā)性成分的RSD值均小于20%，表明該方法的精密度可滿足松露中揮發(fā)性成分的測定要求。優(yōu)化方法靈敏度強(qiáng)，分離效率高，分析速度快，且所需樣品量少。該方法合適于后期對松露類樣品中揮發(fā)性成分的測定。

通過所建立的方法對7 個(gè)不同產(chǎn)地來源印度松露的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，結(jié)果表明松露中主要揮發(fā)性成分含量較多的是酯類和醛類，平均占比為31.89%和23.90%。不同產(chǎn)地印度松露的揮發(fā)性成分個(gè)數(shù)及揮發(fā)性成分總量最高的是產(chǎn)自云南省富民縣的印度松露，含有91個(gè)揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分總量為83.6%。