改良抗酸染色和結(jié)核與非結(jié)核基因檢測在結(jié)核病病理診斷中的應(yīng)用比較

彭海英　曾江　張潤蘭　陳芮　賴小菊

【摘要】? 目的? ? 比較分析改良抗酸染色和結(jié)核與非結(jié)核基因檢測在結(jié)核病病理診斷中的差異。方法? ? 收集贛州市第五人民醫(yī)院2020年1—12月確診肺結(jié)核患者96例，組織經(jīng)病理常規(guī)取材、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，之后進(jìn)行改良抗酸染色與結(jié)核與非結(jié)核基因檢測。結(jié)果? ? 96例肺結(jié)核患者病理中，抗酸染色陽性例數(shù)48例，陽性率50%；結(jié)核與非結(jié)核基因檢測結(jié)核陽性例數(shù)70例，陽性率73%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩種方法聯(lián)合檢測陽性例數(shù)75例，陽性率78%，與基因檢測相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與改良抗酸染色相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? ? 在結(jié)核病病理診斷中，結(jié)核與非結(jié)核基因檢測陽性率顯著高于改良抗酸染色法，兩種方法聯(lián)合檢測更有利于提高確診率。

【關(guān)鍵詞】? 結(jié)核； 病理診斷； 改良抗酸染色； 結(jié)核與非結(jié)核基因檢測

Application comparison of modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosisPeng Haiying，Zeng Jiang，Zhang Runlan，Chen Rui，Lai Xiaoju.The Fifth People's Hospital of Ganzhou City，Ganzhou，Jiangxi? 341000

【Abstract】? Objective? ? To compare and analyze the differences between modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosis.Methods? ? A total of 96 cases of patients with pulmonary tuberculosis diagnosed in Ganzhou Fifth People's Hospital from January 2020 to December 2020 were collected. The tissues were routinely collected by pathology， embedded in paraffin， sectioned， and stained with HE， and then subjected to improved acid-fast staining and comparison of tuberculosis and non-tuberculosis genetic testing.Results? ? Among the 96 cases of pulmonary tuberculosis patients， 48 were positive for acid-fast staining， with a positive rate of 50%. Tuberculosis and non-tuberculous genetic testing were 70 positive for tuberculosis， with a positive rate of 73%. Compared with the two methods， The positive rate of tuberculosis and non-tuberculosis gene detection was significantly higher than that of the modified acid-fast staining method， and the difference was statistically significant； the number of positive cases detected by the two methods was 75， and the positive rate was 78%. Compared with the genetic test， the difference was not statistically significant. Compared with staining， the difference is statistically significant.Conclusion? ? Among the two detection methods for pathological diagnosis of tuberculosis， the positive rate of tuberculosis and non-tuberculous gene detection is significantly higher than that of the modified acid-fast staining method. The combined detection of the two methods is more conducive to clinical diagnosis，worthy of clinical promotion.

【Key Words】? Tuberculosis； Pathological diagnosis； Modified acid fast staining； Tuberculosis and non-tuberculous gene detection

中圖分類號：R378.91? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）20-0075-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.20.025

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染性疾病，是全球單一病原體感染導(dǎo)致死亡的第九大原因，嚴(yán)重危害人類健康，是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。尤其是近年來由于人類免疫缺陷病毒（HIV） 感染、空氣污染等因素影響，發(fā)病率逐年增高。因此，結(jié)核病患者的早期診斷和治療，已成為我國傳染病防治的重要工作[1]。病理診斷方面，典型的結(jié)核病變?yōu)橛筛衫覙訅乃?、類上皮樣?xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞形成的結(jié)核樣壞死性肉芽腫，顯微鏡下容易識別，但由于抗生素濫用、HIV感染、環(huán)境污染等因素引起結(jié)核桿菌變異，使結(jié)核病變組織形態(tài)學(xué)不典型[2]。因此，對于結(jié)核病的診斷，尤其是病理形態(tài)不典型的結(jié)核診斷來說，在石蠟組織切片中找到結(jié)核桿菌具有重要意義。而結(jié)核與非結(jié)核基因檢測能從分子水平檢測出組織中的結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌，技術(shù)上十分先進(jìn)和成熟。本文旨在分析改良抗酸染色和結(jié)核與非結(jié)核基因檢測在結(jié)核病病理診斷中的差異，從而為臨床結(jié)核病的有效診斷提供參考。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 研究對象? ? 收集贛州市第五人民醫(yī)院2020年1—12月確診為肺結(jié)核患者96例，所有病理組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定5～6 h，病理常規(guī)取材、脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，之后進(jìn)行改良抗酸染色和結(jié)核與非結(jié)核基因檢測。

1.2? ? 方法

1.2.1? ? 改良抗酸染色? ? 染色試劑為珠海貝索的抗酸染色試劑套盒，組織切片經(jīng)脫蠟后不經(jīng)酒精入流水稍沖洗；用吸水紙抹去切片周圍液體至切片稍濕潤；流水沖洗2 min；0.3% TritonX-100 液處理10 min，流水沖洗2 min；石炭酸復(fù)紅溶液室溫下染色20～30 min；流水洗去多余染液；滴加酸性酒精溶液分化3～4次，至切片呈無色為止；流水沖洗2 min，加亞甲基藍(lán)溶液染20～30 s，流水沖洗2 min，晾干、封片。于顯微鏡下進(jìn)行結(jié)果判讀： 抗酸染色陽性分枝桿菌鏡下一般呈紅色、兩端鈍圓稍彎曲的桿狀，有時(shí)呈串珠狀，長1～4μm，可散在或呈片狀分布，細(xì)胞核及背景呈淡藍(lán)色。見封三圖1—圖2。

1.2.2? ? 結(jié)核與非結(jié)核基因檢測? ? 檢測試劑盒為成都博奧晶芯生物有限公司的分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。（1）組織連續(xù)切片15～20片后，置于離心管中。（2）溶蠟處理后，加入4倍體積4% NaOH液化。（3）30 min后吸取液化后的樣本1 mL置EP管內(nèi)，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。（4）加入1 mL洗液于EP管中，充分渦旋震蕩后12 000 r/min離心5 min，棄上清液。（5）加入50 μL核酸提取液，充分渦旋震蕩后，將液體與沉淀轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，置入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速震蕩10 min。（6）將核酸提取管轉(zhuǎn)至95 ℃水浴鍋中放置加熱5 min，12 000 r/min離心1 min，取上清液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。樣本檢測時(shí)均設(shè)陽性對照和陰性對照。同時(shí)選擇FAM通道和HEX通道，熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃ 30 s。擴(kuò)增過程中儀器實(shí)時(shí)檢測熒光信號并分析增長曲線。結(jié)果分析：試劑盒的參考值為40，樣本擴(kuò)增曲線呈S形，且Ct值小于40的樣本，判定為陽性；擴(kuò)增曲線不呈S形或Ct值為40（或無任何數(shù)值）判定為陰性。

1.3? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，行χ²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 臨床病理學(xué)特征? ? 96例肺結(jié)核患者中男性57例，女性39例，年齡為15～84歲，其中肺內(nèi)結(jié)核患者58例（60%），胸膜結(jié)核患者18例（19%），肺及胸膜外結(jié)核患者20例（21%）；鏡下表現(xiàn)為壞死性炎改變者38例，肉芽腫性炎改變者58例。

2.2? ? 改良抗酸染色與結(jié)核與非結(jié)核基因檢測結(jié)果比較? ? 96例肺結(jié)核患者病理中，抗酸染色陽性例數(shù)48例，陽性率為50%；結(jié)核與非結(jié)核基因檢測結(jié)核陽性例數(shù)70例，陽性率為73%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ²=10.642，P=0.001）。兩種方法聯(lián)合檢測陽性例數(shù)75例，陽性率78%，與基因檢測法相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ²=0.704，P=0.401），與抗酸染色法相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ²=16.492，P<0.001），見表1。

3? ? 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的一種世界范圍內(nèi)流行的傳染性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。2021年10月14日世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布了《2021年全球結(jié)核病報(bào)告》[3]，報(bào)告中指出，全球結(jié)核潛伏感染人群近20億，2020年，全球新發(fā)結(jié)核病患者987萬，發(fā)病率為127/10萬。2020年我國估算的結(jié)核病新發(fā)病例數(shù)為84.2萬，結(jié)核病發(fā)病率為59/10萬，我國估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中排第2位，僅次于印度（259萬），結(jié)核病死亡率為2.1/10萬。雖然近年來我國結(jié)核病發(fā)病率和死亡率有所下降，但因感染人群基數(shù)大、醫(yī)療設(shè)施缺乏以及其他社會因素的限制，中國結(jié)核病的防控工作仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，早期、快速、準(zhǔn)確診斷是結(jié)核防治的關(guān)鍵。近年來，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)經(jīng)過不斷創(chuàng)新取得了較大的進(jìn)展，尤其是分子檢測技術(shù)的應(yīng)用更是帶來了革新。

結(jié)核感染可累及全身多個(gè)臟器，其中以肺最為常見。結(jié)核病常見的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括抗酸染色涂片鏡檢法、結(jié)核菌素試驗(yàn)、干擾素釋放試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)以及結(jié)核分子檢測等[4]。而病理學(xué)作為一種診斷結(jié)核病的重要途徑，尤其在菌陰肺結(jié)核及肺外結(jié)核等疑難病例診斷中起到了重要作用。結(jié)核分枝桿菌引起的慢性炎癥為一種特異性感染，可引起Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，表現(xiàn)為炎癥的3種基本病理變化：滲出、壞死和增生，可以同時(shí)存在，或以某一種改變?yōu)橹鳎医?jīng)常相互轉(zhuǎn)化[5]。結(jié)核病的組織學(xué)鏡下特點(diǎn)為上皮樣肉芽腫性炎，在顯微鏡下表現(xiàn)為大小不等和數(shù)量不同的結(jié)節(jié)性肉芽腫。典型的結(jié)核結(jié)節(jié)中央見干酪樣壞死，壞死周圍可見上皮樣細(xì)胞和（或）朗格漢斯巨細(xì)胞，外周有增生的纖維結(jié)締組織和慢性炎細(xì)胞浸潤，有時(shí)亦可見缺少肉芽腫病變的干酪樣壞死結(jié)節(jié)[5-6]。在本次研究的96例樣本中，表現(xiàn)為肉芽腫性炎的病例為58例（60.4%），而僅表現(xiàn)為干酪樣壞死的病例38例（39.6%）。然而，除結(jié)核感染外，肉芽腫性病變也可出現(xiàn)在其他一些感染性疾病或非感染性疾病，如非結(jié)核分枝桿菌感染、真菌病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫性血管炎等，需通過其他方法進(jìn)行鑒別[6-7]。

抗酸染色法作為結(jié)核分枝桿菌的主要檢測方法，其快速、簡易、價(jià)廉，深得各實(shí)驗(yàn)室的推崇。本實(shí)驗(yàn)室所采用的改良抗酸染色，石蠟切片厚度為6μm，既可以增加切片中菌體的含量，又能清晰觀察抗酸桿菌的形態(tài)；染色之前采用TritonX-100進(jìn)行打孔處理，增加了細(xì)胞壁對染色劑的通透性，提高染液的滲透率，使胞內(nèi)菌更好地進(jìn)行著色，提高了敏感性和檢出率[8]。本研究抗酸染色陽性例數(shù)為48例，抗酸陽性桿菌主要存在于組織的壞死區(qū)域或壞死與上皮樣肉芽腫的交界處。然而，除結(jié)核分枝桿菌外，還有非結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、部分努卡菌和軍團(tuán)菌屬也可顯示抗酸染色陽性[6]，仍需進(jìn)一步進(jìn)行鑒別。

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，建立在核酸擴(kuò)增基礎(chǔ)上的分子病理檢測技術(shù)已經(jīng)獲得WHO的認(rèn)可，結(jié)核分枝桿菌的分子檢測技術(shù)也日益先進(jìn)，結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌檢測由此而生。相對于其他方法而言，分子檢測具有簡單、快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高組織樣本中結(jié)核分枝桿菌檢出率[9]。利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測技術(shù)對石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌DNA進(jìn)行檢測，并通過與其他抗酸桿菌的鑒別，特別是在一些陳舊性病變，其結(jié)核病理形態(tài)學(xué)不典型，僅表現(xiàn)為凝固性壞死或纖維增生性病變，抗酸染色難以查找到抗酸桿菌。采用PCR檢測方法對結(jié)核桿菌進(jìn)行檢測，鑒別診斷出結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌，實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的精準(zhǔn)診斷[5]。當(dāng)然，由于部分標(biāo)本含菌量較低，活檢組織前期處理不當(dāng)導(dǎo)致DNA降解、分子檢測操作時(shí)NaOH消化時(shí)間過長發(fā)生RNA降解，以及組織經(jīng)常規(guī)HE和其他檢測損失較多等，均會影響結(jié)核分枝桿菌的基因檢測結(jié)果，因此需要專業(yè)人員進(jìn)行操作，以減少組織損耗，提高陽性率[3，10]。

值得指出的是，作為結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測的補(bǔ)充——基因芯片法，提供了利福平和異煙肼的耐藥性檢測以及非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定?；蛐酒夹g(shù)于20世紀(jì)90年代開始應(yīng)用于結(jié)核病的診斷。其將大量探針固定于特殊載體上，之后與待測樣本的核酸進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號強(qiáng)度而獲取樣本分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片法具有高通量、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以進(jìn)行非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定以及結(jié)核分枝桿菌的耐利福平基因 rpoB和耐異煙肼 kat G、inhA 基因常見突變位點(diǎn)檢測，為臨床快速診斷分枝桿菌感染、指導(dǎo)臨床用藥提供可靠依據(jù)[11-12]。

綜上所述，改良抗酸染色法操作簡單、快速、價(jià)廉，一直為結(jié)核病診斷最常規(guī)的檢測方法；而結(jié)核與非結(jié)核基因檢測重復(fù)性好、結(jié)果可靠，敏感度高，能鑒別出結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌感染，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)核耐藥性檢測以及非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定。因此，基于顯微鏡鏡下形態(tài)學(xué)的典型結(jié)核改變，借助于抗酸染色法和結(jié)核與非結(jié)核基因檢測病原學(xué)證據(jù)的應(yīng)用，可能是結(jié)核病病理診斷的模式之一，為臨床結(jié)核病的診斷和指導(dǎo)用藥提供重要參考依據(jù)。

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（收稿日期：2023-04-14）