牛超數(shù)排卵技術(shù)研究進(jìn)展

趙振陽(yáng)，許曉玲，白佳樺，肖霖力，秦玉圣，劉 彥，楊 凌

（1.河北工程大學(xué)，河北邯鄲 056000；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

家畜胚胎移植技術(shù)（Embryo transfer，ET）是指將家畜的受精卵或早期胚胎取出移植到同種動(dòng)物的另一母體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為胎兒的技術(shù)。該技術(shù)有助于縮短世代間隔，可高速、有效地深挖與擴(kuò)散優(yōu)良個(gè)體的優(yōu)秀基因，從而促使優(yōu)秀個(gè)體被最大程度地?cái)U(kuò)繁和利用。牛胚胎移植技術(shù)經(jīng)過(guò)數(shù)十載的發(fā)展，日漸成熟，被廣泛的應(yīng)用在了實(shí)際的繁殖生產(chǎn)，成為新品種培育和良種快速擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段[1-4]。牛胎移植技術(shù)是一個(gè)從供體牛經(jīng)超排處理后收集胚胎，移植到相同生理狀態(tài)下受體牛子宮，最后到完成受孕產(chǎn)犢的過(guò)程，包含供體牛超排處理、人工授精、胚胎的回收和受體選擇、同期處理和胚胎移植。胚胎移植過(guò)程中最關(guān)鍵的問(wèn)題就是，供體牛體內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)成熟的卵泡，而不是正常的只去產(chǎn)生一個(gè)，體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎最終可以轉(zhuǎn)移到受體牛體內(nèi)進(jìn)行妊娠。為了獲得大量可轉(zhuǎn)移的胚胎，超數(shù)排卵的步驟則是至關(guān)重要的。

目前，在牛胚胎移植中，胚胎主要來(lái)自超數(shù)排卵后第7 天非手術(shù)法獲取的供體母牛[5]。盡管科研人員已對(duì)牛超排方案進(jìn)行了深入研究，但是自牛胚胎移植技術(shù)成功以來(lái)，每次超排處理后，回收的平均可用胚胎數(shù)并不高，約1/3 的供體母牛存在較差的超排反應(yīng)，并且相同的方案處理不同的個(gè)體效果差異顯著[6,7]。實(shí)際生產(chǎn)中，約64%的供體生產(chǎn)的可用胚數(shù)達(dá)不到平均水平[8]，甚至有15%左右的供體不能生產(chǎn)出可用胚胎[9]。超排反應(yīng)的不確定性提高了牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的成本，限制了該技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用效率。因此，本文就牛卵泡發(fā)育規(guī)律、超排所用激素種類(lèi)、經(jīng)典的超排處理方案和效果，以及影響因素等進(jìn)行簡(jiǎn)單敘述，以期為牛體內(nèi)胚胎高效生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 卵泡發(fā)育

1.1 發(fā)情周期卵泡發(fā)育

在下丘腦-垂體-卵巢軸相關(guān)聯(lián)的激素作用下，卵巢卵泡和黃體交替發(fā)育。促卵泡素（Follicle-stimulating hormon，F(xiàn)SH）會(huì)促進(jìn)小有腔卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，在促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）的刺激下，1～2 個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡會(huì)形成并排卵。此后，顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞等形成黃體，分泌孕酮（Progestational，P4）。牛是單胎動(dòng)物，所以通常情況下發(fā)情時(shí)只有一個(gè)卵泡發(fā)育可以形成優(yōu)勢(shì)卵泡。但事實(shí)上，大于95%的母牛在一個(gè)發(fā)情周期有2～3 個(gè)卵泡波[10]。自然狀態(tài)下，大概有70%的母牛在一個(gè)發(fā)情周期中有兩個(gè)卵泡波，分別從發(fā)情周期第2 天和第9～10 天開(kāi)始；大約有30%的母牛在一個(gè)發(fā)情周期有3 個(gè)卵泡波，分別從發(fā)情周期第2、8～9 和15～16 天開(kāi)始[11]。不過(guò)，無(wú)論母牛發(fā)情期中有幾個(gè)卵泡波，只有在母牛發(fā)情時(shí)的卵泡波才會(huì)形成優(yōu)勢(shì)卵泡并排卵，其他的都會(huì)在不同階段閉鎖、退化[12]。

1.2 卵泡發(fā)育的激素調(diào)節(jié)

原始卵泡庫(kù)中的腔前卵泡是通過(guò)自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)進(jìn)行募集和發(fā)育成有腔卵泡的，促性腺激素影響腔前卵泡的發(fā)育速度。進(jìn)入卵泡發(fā)育庫(kù)后在促性腺激素作用下發(fā)育成小的有腔卵泡[13]，當(dāng)卵泡大于4mm 以后，它就完全依賴(lài)促性腺激素進(jìn)行后期發(fā)育了。有腔卵泡在FSH 的作用下繼續(xù)發(fā)育形成優(yōu)勢(shì)卵泡，2～3d 后發(fā)育為排卵卵泡，并在LH 脈沖式分泌的條件下排卵。當(dāng)卵泡直徑發(fā)育到大于8mm 時(shí)，雌激素(Estrogen，E2）的合成與分泌激增，增強(qiáng)了該卵泡對(duì)促性腺激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取能力，從而抑制其他卵泡發(fā)育。

排卵后，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞受到LH 刺激發(fā)生黃體化，開(kāi)始泌P4。此時(shí)，P4負(fù)反饋機(jī)制阻礙了下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）和垂體FSH、LH 的合成與分泌。如果母牛發(fā)情后未進(jìn)行參配或者配種后沒(méi)有受孕，在情期的第16 天左右，子宮將會(huì)合成和分泌前列腺素（Prostaglandin，PG），溶解黃體細(xì)胞。此時(shí)，血液中P4水平下降，其對(duì)下丘腦GnRH 和垂體FSH、LH 的合成和分泌的抑制作用解除，下一波卵泡發(fā)育開(kāi)始，母牛進(jìn)入下一個(gè)發(fā)情周期[14]。

2 超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是指在雌性動(dòng)物正常的發(fā)情周期中，通過(guò)使用外源促性腺激素誘導(dǎo)卵巢內(nèi)較多的卵泡發(fā)育并排卵的技術(shù)。20 世紀(jì)50 年代后期至60 年代初期，美國(guó)農(nóng)業(yè)部、康奈爾大學(xué)和威斯康星大學(xué)等機(jī)構(gòu)就開(kāi)始了牛羊超數(shù)排卵的研究，當(dāng)時(shí)使用的激素是馬絨毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotropin，eCG），也就是妊娠母馬的血清促性腺激素（PMSG）[15]。隨后幾十年，研究人員開(kāi)始探尋超數(shù)排卵的激素方案。誘導(dǎo)超數(shù)排卵的激素種類(lèi)很多，最常用的是各種家畜的垂體提取物（FSH，LH），馬絨毛膜促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，HCG）。超數(shù)排卵的有效性取決于所使用的促性腺激素的類(lèi)型、給藥期、總劑量以及多次給藥時(shí)它的減少程度。

2.1 牛超排中常用的生殖激素

2.1.1 促卵泡素

促卵泡素是由動(dòng)物垂體前葉細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，其分子是由非共價(jià)鍵結(jié)合的α 和β 兩個(gè)亞基組成的異質(zhì)二聚體。FSH 的主要作用包括刺激卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，卵泡顆粒細(xì)胞E2合成和分泌以及LH 受體的表達(dá)，刺激卵泡膜細(xì)胞上LH 受體產(chǎn)生。研究表明，不同動(dòng)物體FSH 的半衰期并不相同[16]。FSH 超排處理供體牛的效果相對(duì)其他激素更加穩(wěn)定，因此，目前世界上牛胚胎移植的生產(chǎn)實(shí)踐中更多的使用FSH 去處理供體牛生產(chǎn)胚胎。由于FSH 在供體牛體內(nèi)的半衰期僅有5h 左右，所以，在超排程序中必須連續(xù)注射，每天2次，持續(xù)4d，以確保供體牛血液中FSH 濃度保持穩(wěn)定，維持正常的超數(shù)排卵所需的水平。

2.1.2 促黃體生成素

促黃體生成素是由動(dòng)物垂體前葉細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，在公畜體內(nèi)又稱(chēng)促間質(zhì)細(xì)胞素（ICSH），由α 和β 兩個(gè)亞基組成。LH 與FSH α 亞基的相對(duì)分子質(zhì)量相等，并且兩者可以相互交換，所以一般認(rèn)為L(zhǎng)H 和FSH 的作用與β 亞基有關(guān)。LH 與FSH 共同促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟，同時(shí)促進(jìn)卵泡內(nèi)膜雌激素分泌。在排卵過(guò)程中，LH 起主導(dǎo)作用，并促使卵泡破裂后，黃體的形成和孕酮分泌。除此之外，LH 還能促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的成熟和睪酮分泌，以及精子成熟。在現(xiàn)有的商品FSH 中，通常都會(huì)添加一定比例的LH，F(xiàn)SH 和LH 兩者配伍使用效果更好。

2.1.3 促性腺激素釋放激素

促性腺激素釋放激素是一種由下丘腦合成和分泌的激素，其主要作用是促進(jìn)垂體前葉LH 和FSH 的合成與分泌。有研究指出，GnRH 能夠誘導(dǎo)卵泡發(fā)育和排卵。處理1.5～2d 后，將會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的卵泡波。只有卵泡波存在時(shí)，GnRH 才會(huì)誘導(dǎo)排卵[17]。在發(fā)情周期的任意時(shí)間使用GnRH，可以使44%～55%的奶牛[18]和60%的肉母牛排卵[18]。

2.1.4 孕酮

孕酮是一種類(lèi)固醇激素，主要來(lái)源于卵巢的黃體細(xì)胞。此外，腎上腺、卵泡顆粒細(xì)胞和胎盤(pán)也分泌孕酮。睪丸也分泌少量的孕酮，主要是雄激素合成過(guò)程的中間產(chǎn)物。在妊娠期間，P4扮演著非常重要的角色。它作用于子宮黏膜，促進(jìn)并維持其增長(zhǎng)以及刺激子宮腺的增長(zhǎng)和分泌功能，這為后期胚胎的著床和發(fā)育創(chuàng)造了必要的條件。此外，P4還可以促進(jìn)子宮頸收縮、削弱子宮肌肉的蠕動(dòng)和降低孕期子宮的興奮性，從而維持妊娠。在實(shí)際應(yīng)用中，P4主要被制成孕激素陰道海綿栓或孕激素陰道Y 型栓這兩種產(chǎn)品。這些產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，以幫助維持妊娠和促進(jìn)動(dòng)物的繁殖。

2.1.5 前列腺素

前列腺素是一類(lèi)存在于動(dòng)物和人體中的不飽和脂肪酸組成的、具有多種生理作用的活性物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)的種類(lèi)有幾十種。精囊腺是PG產(chǎn)生最多的一個(gè)部位，其次是腎髓質(zhì)、肺和胃腸道。此外，腦、腎上腺、脂肪組織等也合成比較多的PG。PG 還存在于卵巢、子宮內(nèi)膜、胎盤(pán)以及精液、睪丸等。PG 的作用廣泛，在不同組織中即使是同種PG 也有不同功能。PGF 對(duì)黃體有明顯的溶解作用，PGE1可以抑制排卵，PGE2α則可以使血液中的LH 水平上升從而促進(jìn)排卵；PGE1和PGE2都可以促進(jìn)垂體LH 和FSH 的釋放，但是PGE2的作用更大。除此之外，某些PG還能刺激子宮平滑肌收縮、促進(jìn)胎盤(pán)和惡露排出的作用。

2.1.6 馬屬動(dòng)物絨毛膜促性腺激素

馬屬動(dòng)物絨毛膜促性腺激素，最早是從妊娠母馬血液中獲得的一種糖蛋白質(zhì)激素，因此也叫孕馬血清促性腺激素。eCG 是由妊娠40～150d的馬屬動(dòng)物子宮內(nèi)膜杯組織細(xì)胞合成并分泌，它由α 和β 亞基組成，兼?zhèn)淞薋SH 和LH 共同的生理功能。研究者們將eCG 應(yīng)用到了牛超數(shù)排卵上，通過(guò)注射eCG，可以增加牛體內(nèi)FSH 和LH的水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟，同時(shí)也增加黃體體積和孕酮的分泌，為妊娠創(chuàng)造了更好的環(huán)境。除了對(duì)牛的繁殖有幫助外，eCG 還被廣泛應(yīng)用于其他動(dòng)物的繁殖中，例如羊、豬、驢、兔等。

2.2 經(jīng)典的牛超排方案

2.2.1 CIDR+FSH+PG

⑴對(duì)和牛的處理情況和效果

在89 頭供體和牛發(fā)情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第5 天開(kāi)始FSH（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL 生理鹽水稀釋?zhuān)┨幚怼SH 連續(xù)處理4d，分為每天早上8:00，晚上20:00 2 次，每天遞減（2、1.5、1、0.5mL）肌肉注射的方法。第7 天打FSH 同時(shí)肌注0.6mg PG，在第二次打完P(guān)G 后撤栓。第9 天觀察發(fā)情，發(fā)情12h 后輸精，間隔12h 再次輸精。每次輸1 支凍精，輸?shù)阶訉m體前端，最后一次輸精后第7 天采用非手術(shù)法沖胚。結(jié)果顯示：該處理超排有效率為85.4%，平均回收胚胎數(shù)12.0 枚，平均可用胚胎數(shù)8.7 枚[19]。

⑵對(duì)雷瓊牛的處理情況和效果

在10 頭雷瓊牛供體牛發(fā)情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第9 天開(kāi)始FSH 處理。采用4 天8 次(早上7:00，晚上19:00)遞減肌肉注射FSH（4、3、2 和1 AU）的方法處理。在第11 天上午注射FSH 同時(shí)肌肉注射0.6mg PG，第12 天上午注射FSH 同時(shí)撤去CIDR。第13 天早晚觀察母牛發(fā)情，觀察到發(fā)情后的12h 進(jìn)行輸精，隔10～12h 再次輸精，連續(xù)輸精2～3 次。埋植CIDR 和配種時(shí)注射維生素A、維生素D、維生素E 注射液5mL，配種時(shí)注射2 支促排3號(hào)。結(jié)果顯示：該方案處理雷瓊牛，每頭平均回收卵數(shù)為8.9 枚，平均有效胚數(shù)為4.1 枚[20]。

2.2.2 PG+FSH+PG

（1）對(duì)比利時(shí)牛的處理情況和效果

在10 頭比利時(shí)牛供體牛發(fā)情周期中的任意一天肌注PGF2α5mL，11d 后重復(fù)注射PGF2α5mL，第二次打完P(guān)GF2α后觀察發(fā)情（發(fā)情當(dāng)天計(jì)為第0 天），第9 天進(jìn)行超排處理。按4 天8次遞減法注射FSH，第11 天注射FSH 每頭牛同時(shí)注射5mL PGF2α。第13 天早晚觀察發(fā)情，發(fā)情后的10h 給予第一次輸精，6h 后重復(fù)輸精，每頭牛輸精2～3 次，每次輸2 支凍精。結(jié)果顯示：該處理超排有效率為90.00%，平均回收胚胎數(shù)5.33 枚，平均可用胚胎數(shù)3.44 枚[21]。

（2）對(duì)和牛的處理情況和效果

對(duì)7 頭和牛供體牛肌肉注射0.4mg PG，10d后再次肌注0.4mg PG。第11d 開(kāi)始連續(xù)4d 8 次（早上7:00，晚上19:00）遞減肌注FSH（3、2.5、2、1mL）（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL生理鹽水稀釋?zhuān)?，在?3 天晚上和第14 天早上肌注FSH 同時(shí)，每頭牛肌注0.4mg PG。第15 天晚上給予第1 次輸精，第16 天中午給予第2 次輸精，輸精同時(shí)每頭牛注射25μg 促排3 號(hào)，第二次輸精后第7 天沖胚。結(jié)果顯示：該處理和牛超排有效率為100.00%，平均回收胚胎數(shù)11.29枚，平均可用胚胎數(shù)5.89 枚[22]。

2.2.3 CIDR+GnRH+FSH+PG

（1）對(duì)和牛的處理情況和效果

在10 頭和牛供體牛確認(rèn)自然發(fā)情排卵后陰道內(nèi)放置CIDR（第0 天），第7 天肌肉注射GnRH 100mg；間隔3d 后（第10 天）應(yīng)用FSH 20U 用生理鹽水稀釋后，分3d 減量注射，在第12 天最后一次注射FSH 的同時(shí)，取出CIDR，注射PG 誘發(fā)排卵；2d 后出現(xiàn)發(fā)情（第14 天），并輸精一支精液，第21 天沖胚。結(jié)果顯示：該處理直檢黃體數(shù)共115 個(gè)，回收胚胎88 枚，平均每頭8.8 枚，回收率77%，其中受精卵62 枚，受精率70.45%[23]。

（2）對(duì)荷斯坦奶牛的處理情況和效果

對(duì)18 頭荷斯坦奶牛供體牛進(jìn)行B 超檢查，在發(fā)情周期第8 天確認(rèn)供體牛卵巢黃體存在時(shí)注射2mL GnRH，同時(shí)陰道內(nèi)放置1.38g 孕酮CIDR。從第11～14 天開(kāi)始，給予總量400mg FSH，連續(xù)4d 早晚間隔12h 8 次遞減處理（70、60、40 和30mg）。第13 天早晚注射2mL 前列腺素2 次，第14 天撤去CIDR，第15 天，給 藥2mLGnRH。在確認(rèn)發(fā)情后，對(duì)發(fā)情的奶牛使用牛性控精液輸精2 次（間隔12 小時(shí)）。在第22 天（人工授精后第7 天）通過(guò)非手術(shù)沖洗收集胚胎。結(jié)果顯示：該處理平均回收胚胎數(shù)11.50 枚，平均可用胚胎數(shù)6.86[24]。

3 影響超排效果的因素

超排效果是指供體對(duì)外源促性腺激素的反應(yīng)能力，卵巢卵泡發(fā)育情況、卵泡數(shù)量、卵泡大小、排卵情況、排卵后黃體的數(shù)量、回收胚胎數(shù)量和可用胚數(shù)量是影響超排效果的主要客觀表現(xiàn)。影響牛超排效果的因素眾多且復(fù)雜，這包括了供體牛的自身因素和外部因素。

供體牛自身因素主要與超排時(shí)牛年齡與胎次、生產(chǎn)性能、發(fā)情狀態(tài)和卵巢機(jī)能、體況和健康狀況等；外部因素主要有供體牛飼糧水平與管理方式、激素類(lèi)別與來(lái)源和注射方式與劑量、環(huán)境與季節(jié)、超排處理程序、精液品質(zhì)、沖胚方法和沖胚人員技術(shù)等。

日常飼養(yǎng)管理中，牛易受到驚嚇、頂架以及飼糧變化等外界刺激的影響，因此，供體牛應(yīng)分群管理，飼喂?fàn)I養(yǎng)均衡的全混合日糧，同時(shí)補(bǔ)充足夠的清潔飲水，注重圈舍衛(wèi)生，以減少飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)超排效果帶來(lái)的負(fù)面影響，保證超排工作順利完成。

4 小結(jié)

目前我國(guó)主要畜種的生產(chǎn)水平與發(fā)達(dá)國(guó)家相比差距明顯。增加良種覆蓋率、提高單產(chǎn)水平是縮小差距的必要手段。利用胚胎工程技術(shù)充分挖掘種質(zhì)資源和繁殖潛力，是大幅加速特色畜種繁育進(jìn)度的一把利劍。超數(shù)排卵技術(shù)是家畜胚胎移植技術(shù)體系中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了牛的繁殖生產(chǎn)中，超排可以一次獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)卵子，使得優(yōu)良后代數(shù)幾倍的增加甚至幾十倍的增加，大大加快優(yōu)良品種的擴(kuò)繁速度。供體牛超排效果不穩(wěn)定性和不可預(yù)測(cè)性仍然是制約牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的重要因素。在體內(nèi)胚生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)超排技術(shù)優(yōu)化，提高可用胚胎的數(shù)量是一個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程。因此，如何篩選、優(yōu)化不同激素超排方案來(lái)有效降低生產(chǎn)成本、提高胚胎移植效率，乃至提升優(yōu)良畜種利用率是目前研究的主要問(wèn)題，也是今后努力的方向。