TLR4基因在綿羊不同生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜組織中的mRNA表達(dá)

孔維歡 熊燊源 代蓉

摘要：為了研究Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在綿羊胚胎附植期和發(fā)情周期子宮內(nèi)膜中mRNA的表達(dá)模式。采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別檢測(cè)妊娠21 d母羊全身組織和妊娠9、13、17、21、25 d 的母羊子宮內(nèi)膜組織TLR4基因的表達(dá)以及綿羊卵泡期與黃體期母羊子宮內(nèi)膜組織TLR4基因的表達(dá)。結(jié)果表明，TLR4基因在肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、肌肉及松果體等組織出現(xiàn)表達(dá)，其中在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中表達(dá)量較高，在肝臟、小腸、肌肉中表達(dá)較弱，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。從妊娠9 d開(kāi)始，綿羊胚胎TLR4基因表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì);至胚胎附植點(diǎn)17 d，TLR4基因表達(dá)量最低，之后又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到25 d達(dá)到峰值。不管是在細(xì)毛羊還是在湖羊子宮內(nèi)膜組織中檢測(cè)，TLR4基因黃體期的表達(dá)水平均顯著高于卵泡期（P<0.05）。說(shuō)明TLR4的mRNA表達(dá)具有組織特異性，在胚胎附植期綿羊子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)先低后高的趨勢(shì)，以及其在綿羊發(fā)情周期中表達(dá)出現(xiàn)黃體期顯著高于卵泡期現(xiàn)象，也初步說(shuō)明了TLR4可能在胚胎附植早期和發(fā)情周期中均發(fā)揮一定作用。

關(guān)鍵詞：TLR4基因;綿羊;胚胎附植期;發(fā)情周期;子宮內(nèi)膜

中圖分類號(hào)： S826.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0035-05

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR） 是一類典型的Ⅰ型模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRR）[1-3]。據(jù)調(diào)查，近些年來(lái)對(duì)動(dòng)物繁殖相關(guān)的疾?。鳟a(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎等）與天然免疫受體TLRs的關(guān)聯(lián)性分析研究逐年增多。而其中TLR4受體基因是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究最為廣泛的，隨著國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高、人均壽命的增長(zhǎng)，內(nèi)分泌性疾病發(fā)病率的不斷上升，子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢(shì)，子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病與體內(nèi)外多種因素有了密切的關(guān)聯(lián)[4]，其中長(zhǎng)期受到雌激素刺激和缺乏孕激素拮抗作用就是子宮內(nèi)膜發(fā)生癌變的主要外界因素。因而母-胎界面中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制也成了許多免疫學(xué)家一直的研究熱點(diǎn)，并證實(shí)了TLR4在生殖免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。比如，Romero等認(rèn)為早產(chǎn)主要就是因?yàn)樯车赖母腥具M(jìn)而引發(fā)了炎癥所導(dǎo)致的[5]。母-胎界面作為妊娠時(shí)聯(lián)系母體和胎兒的重要屏障保護(hù)組織，其上各類促炎癥因子的表達(dá)情況被證明是與正常的妊娠和分娩相關(guān)的[6]。而哺乳動(dòng)物妊娠建立的標(biāo)識(shí)則是胚胎的附植，它是胚胎與母體復(fù)雜的多基因雙向調(diào)控作用的結(jié)果。有研究表明，雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)有大量表達(dá)TLR1-6等免疫受體，在2004年，Pioli等的相關(guān)研究中，TLR4受體基因在人類的輸卵管、子宮內(nèi)膜、子宮頸等生殖器中呈現(xiàn)出差異性表達(dá)[7]。2007年，Nishimura等在人類的卵巢、輸卵管以及子宮中同樣檢測(cè)到了TLR1-10等受體基因的表達(dá)[8]。所以，推測(cè)TLR4與雌性動(dòng)物生殖免疫的關(guān)聯(lián)性可能表現(xiàn)為其在雌性動(dòng)物不同生理階段所發(fā)揮出的作用。

鑒于TLR4基因在綿羊胚胎附植期及發(fā)情周期對(duì)子宮和孕體分子調(diào)控模式的研究鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)選擇該受體作為綿羊不同生理階段表達(dá)調(diào)控的目的基因，試圖通過(guò)組織表達(dá)譜檢測(cè)分析、半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，探究其在胚胎附植期和發(fā)情周期的不同階段子宮內(nèi)膜中的差異表達(dá)，初步揭示TLR4受體在哺乳動(dòng)物繁殖免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，也為了解該受體的免疫功能機(jī)制提供了一定的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：來(lái)自新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧研究所的試驗(yàn)種羊場(chǎng)。其中中國(guó)美利奴細(xì)毛羊30只、湖羊10只。選擇的首要標(biāo)準(zhǔn)是3胎以內(nèi)的成年羊，體質(zhì)量為35～45 kg，個(gè)頭適中、體型良好、膘情中上、哺乳性好，無(wú)生殖免疫系統(tǒng)等方面的疾病。其次是飼養(yǎng)環(huán)境及各品種綿羊個(gè)體之間等無(wú)明顯差異。

試驗(yàn)藥劑：孕酮海綿栓（澳大利亞 Intervet Pty.Ltd.，500 mg/支），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（浙江寧波第二激素廠，1 000 IU/支），Trizol 試劑（Invitrogen公司），瓊脂糖（Biowest公司），三氯甲烷、異丙醇（北京化工廠），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ddH2O（北京全式金公司），dNTP、Taq 酶、10×Buffer、DNA Marker（TaKaRa公司），480 SYBR GreenⅠMaster（Roche公司）。

試驗(yàn)儀器：高速冷凍離心機(jī)、可調(diào)式微量移液槍、-80 ℃冰箱（Thermo公司），4 ℃冰箱、微波爐（美的公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），制冰機(jī)（Grant公司），電子分析天平（美國(guó)丹佛公司），超凈工作臺(tái)（上海博訊公司），電泳儀、紫外分光光度計(jì)（Bio-Rad公司），UV凝膠成像系統(tǒng)（Uvitec Cambridge公司），PCR擴(kuò)增儀（Heraeus 公司），圓周振蕩器（IKA公司），高壓滅菌鍋（Sanyo公司），LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche公司）。

1.2 試驗(yàn)方案

首先隨機(jī)把細(xì)毛羊分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5 組（每組3只），利用孕酮海綿栓與PMSG結(jié)合的方法將綿羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，發(fā)情母羊間隔12 h左右采用人工授精，重復(fù)2～3次。其次，再把細(xì)毛羊和湖羊2種綿羊各自隨機(jī)分為 A、B 2組，3只/組，同樣的方法經(jīng)過(guò)同期發(fā)情處理。

人工授精后9、13、17、21、25 d，采集細(xì)毛羊妊娠母羊的子宮內(nèi)膜組織以及細(xì)毛羊、湖羊卵泡期和黃體期的子宮內(nèi)膜組織，迅速置于液氮保存?zhèn)溆?并對(duì)妊娠21 d 的3只細(xì)毛羊進(jìn)行屠宰，采集其心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體以及肌肉、脂肪等12 種組織，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年5—7月在新疆農(nóng)墾科學(xué)院新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3.1 總RNA的提取和單鏈cDNA的轉(zhuǎn)錄合成 各組織樣品均取100 mg，放入液氮中進(jìn)行研磨處理，然后按照Trizol試劑說(shuō)明書的步驟分別提取所需綿羊組織的總RNA。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定出RNA的D值（D260 nm/D280 nm）和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。所提總RNA的D值在1.8～2.0之間，且沒(méi)有蛋白和基因組污染，符合試驗(yàn)要求。單鏈cDNA的轉(zhuǎn)錄合成按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書結(jié)合試驗(yàn)所需進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列（XM_012111214.1），應(yīng)用軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），引物跨內(nèi)含子并處在基因的高保守區(qū)域，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 TLR4基因克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)體系：10× buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，TLR4上下游引物F/R各 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 16.0 μL，cDNA模板3.0 μL。PCR 反應(yīng)優(yōu)化條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA測(cè)序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成，經(jīng)鑒定所得序列正確。

1.3.4 組織表達(dá)譜分析 按照上述方法分別提取妊娠 21 d 母羊心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體、肌肉、脂肪等12種組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA單鏈。再根據(jù)所設(shè)計(jì)的TLR4上下游引物F/R對(duì)其單鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以綿羊GAPDH基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)該持家基因指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物的灰度調(diào)整各組織初始模板的濃度，并與TLR4目的基因指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物的灰度進(jìn)行比值，進(jìn)而利用半定量法分析出TLR4基因在所選的12種組織中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè) 采集2種不同生理狀態(tài)下的細(xì)毛羊和湖羊的各個(gè)不同時(shí)期不同階段的子宮內(nèi)膜組織，分別提取它們的總RNA，同樣反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA單鏈，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)所設(shè)計(jì)的TLR4上下游引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣以綿羊GAPDH基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行同樣條件下的定量擴(kuò)增和檢測(cè)。反應(yīng)體系 20.0 μL，包括2×SYBR premix EX Taq TM 10.0 μL，上下游引物F/R各0.4 μL，ddH2O 7.2μL，模板cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃ 復(fù)性 15 s，72 ℃延伸20 s，共45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行熔解曲線的分析，并判斷擴(kuò)增過(guò)程及產(chǎn)物的特異性。每個(gè)檢測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，定量分析結(jié)果由LightCyeler 480分析軟件自動(dòng)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得目的基因和持家基因的CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算TLR4基因的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以柱狀圖顯示各時(shí)期不同階段的基因差異表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊TLR4基因的克隆

利用GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列（XM_012111214.1），以綿羊子宮內(nèi)膜組織cDNA 第一鏈為模板，經(jīng)擴(kuò)增和測(cè)序，獲得一條長(zhǎng)度為165 bp的目的片段（圖1）及長(zhǎng)度為149 bp的GAPDH內(nèi)參基因片段（圖2）。PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，是所設(shè)計(jì)的目的基因片段。

2.2 綿羊TLR4基因的組織表達(dá)譜分析

運(yùn)用半定量RT-PCR檢測(cè)方法，以綿羊GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)了TLR4目的基因在妊娠21 d母羊不同組織中的差異表達(dá)情況。由圖3、圖4可知，TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中出現(xiàn)高表達(dá)，在肝臟、小腸、肌肉中出現(xiàn)低表達(dá)，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。

2.3 綿羊TLR4目的基因和GAPDH內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析

由圖5、圖6可知，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的“S”形曲線都很清晰，檢測(cè)到的熒光信號(hào)峰值較高，TLR4目的基因和GAPDH內(nèi)參基因的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期也很明顯，線性范圍也很廣。TLR4基因從22～34個(gè)循環(huán)可檢測(cè)出，GAPDH從19～31個(gè)循環(huán)可檢測(cè)出，表現(xiàn)出較為完整的擴(kuò)增曲線。熔解曲線分析表明，熔解曲線呈現(xiàn)單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，其熒光強(qiáng)度均來(lái)源于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，而沒(méi)有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，結(jié)果具有很好的代表性。

2.4 綿羊TLR4基因在不同品種綿羊卵泡期和黃體期母羊子宮內(nèi)膜的表達(dá)分析

本試驗(yàn)旨在研究TLR4基因在綿羊胚胎附植期和發(fā)情周期子宮內(nèi)膜中mRNA表達(dá)情況，采用了實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 方法，以綿羊GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)ε咛ジ街财诤桶l(fā)情周期各不同階段的子宮內(nèi)膜TLR4基因表達(dá)水平進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)。由圖7可知，TLR4基因在附植期不同階段懷孕母羊子宮內(nèi)膜組織中，17 d表達(dá)水平最低，25 d表達(dá)水平最高;9～25 d TLR4基因表達(dá)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，胚胎附植期不同階段的表達(dá)水平差異顯著（P<0.05）。

由圖8、圖9可知，無(wú)論是細(xì)毛羊還是湖羊，TLR4基因在其子宮組織中的表達(dá)水平均是黃體期>卵泡期，且差異顯著（P<0.05），但不同品種綿羊之間的表達(dá)差異并不明顯。

3 討論

關(guān)于人和小鼠的TLR4的研究報(bào)道比較多，表明了其在免疫、疾病和感染等方面發(fā)揮著重要的作用[9-11]，但在有關(guān)綿羊繁殖方面的研究較少，而且對(duì)TLR4免疫分子機(jī)制研究也相對(duì)較少。

本試驗(yàn)首次采用半定量RT-PCR方法對(duì)妊娠21 d母羊全身組織進(jìn)行表達(dá)譜分析研究，結(jié)果顯示TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等與繁殖和免疫相關(guān)的組織器官中呈現(xiàn)高表達(dá)，在肝臟、小腸、肌肉中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。2011年聶奎等在文獻(xiàn)報(bào)道中稱在兔的胸腺、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟等組織中均檢測(cè)到TLR4 mRNA的表達(dá)[12]。周作勇等研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 mRNA在雛雞胸腺、腸道、肌肉和脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性的差異[13]。而2006年Higgs等在文章中報(bào)道，TLR4主要在雞的骨髓中表達(dá)，而在脾臟、肝臟、小腸、法氏囊和盲腸等組織中表達(dá)水平低或者不表達(dá)[14]。同樣，Alvarez等在豬的組織器官中研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 mRNA在其胸腺和淋巴結(jié)中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量較低[15]。Nishimura等針對(duì)胎兒和成人的組織以及細(xì)胞樣品進(jìn)行了采集研究，結(jié)果表明TLR4 mRNA在脾臟表達(dá)量最高[16]。綜上結(jié)果，不僅說(shuō)明了TLR4 mRNA表達(dá)具有組織特異性，而且在繁殖和免疫器官中TLR4的高表達(dá)也暗示了該受體可能與繁殖及免疫機(jī)制存在某種關(guān)聯(lián)。

胚胎和子宮內(nèi)膜在時(shí)空上互相辨認(rèn)、容受并產(chǎn)生黏附性關(guān)聯(lián)，是哺乳動(dòng)物胚胎附植成功與否的重要環(huán)節(jié)，在此過(guò)程當(dāng)中涉及到了相互之間的復(fù)雜分子調(diào)控進(jìn)程。在反芻動(dòng)物的胚胎附植過(guò)程當(dāng)中，囊胚在附植期會(huì)出現(xiàn)顯著性的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。通常情況下，綿羊囊胚在配種發(fā)育8 d后從透明帶中孵出，呈直徑約200 μm球形，11 d起由球形變成管形;發(fā)育14 d時(shí)變成纖絲狀，到17 d時(shí)達(dá)到25 cm以上[17]。同時(shí)，囊胚的伸長(zhǎng)也是附植開(kāi)始的顯著性標(biāo)志，滋養(yǎng)層細(xì)胞的快速伸長(zhǎng)對(duì)維持妊娠非常重要，它可以使孕體盡快與子宮內(nèi)膜產(chǎn)生黏附且抑制前列腺素的分泌。綿羊妊娠14 d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞開(kāi)始接觸，并在妊娠16～18 d產(chǎn)生黏附，絨毛不停伸長(zhǎng)而呈現(xiàn)出血管，妊娠30 d時(shí)與子宮阜的組織構(gòu)成“母包子型”胎盤[18]。

本試驗(yàn)針對(duì)細(xì)毛羊胚胎附植期5 個(gè)不同階段的母羊子宮內(nèi)膜進(jìn)行了熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠9～17 d母羊子宮內(nèi)膜TLR4基因的表達(dá)水平逐漸下降，且在17 d胚胎附植點(diǎn)的表達(dá)量最低。在此過(guò)程中，雌激素的致敏和孕激素的生理作用是子宮產(chǎn)生生理變化的主要因素。孕激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體的分泌;雌激素除促使子宮內(nèi)膜增生外，還促進(jìn)了子宮釋放蛋白水解酶，繼而促使透明帶溶解和滋養(yǎng)層細(xì)胞增生，滋養(yǎng)層漸漸浸入子宮上皮和基質(zhì)層，進(jìn)而引起胚胎的附植。TLR4信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子NF-κB被證實(shí)可調(diào)節(jié)妊娠相關(guān)組織中促炎癥因子（IL-1β、TNF-α等）以及前列腺素的產(chǎn)量，繼而通過(guò)IL-1β來(lái)促進(jìn)子宮頸的成熟與擴(kuò)張，通過(guò)前列腺素、E2來(lái)刺激分娩[19]。所以，TLR4受體mRNA表達(dá)在附植點(diǎn)17 d降低之后，至25 d mRNA的表達(dá)量又逐漸升高，且表現(xiàn)出顯著性差異。

在動(dòng)物發(fā)情周期中，隨著動(dòng)物生殖器官（如卵巢和子宮內(nèi)膜）的生理變化以及損傷再修復(fù)過(guò)程，TLR4的表達(dá)量會(huì)有顯著變化[20]。因?yàn)樾约に夭粌H可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，而且還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的匯集和分布。例如，人類子宮中發(fā)現(xiàn)大量的NK細(xì)胞，并且隨著發(fā)情周期變化NK細(xì)胞以不斷增加的趨勢(shì)分布于子宮內(nèi)膜[21-22]。已證實(shí)在發(fā)情周期TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9和TLR10基因在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)變化[23]。雌激素水平在生殖期相對(duì)于分泌期較高，同時(shí)孕酮水平在分泌期相對(duì)于生殖期要高。這表明，在雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)特別是在子宮內(nèi)膜中，雌激素對(duì)TLRs的表達(dá)起抑制作用，而孕酮對(duì)TLRs表達(dá)起促進(jìn)作用，Jorgenson等發(fā)現(xiàn)了TLR3在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)有周期依賴性[24]。

本試驗(yàn)對(duì)細(xì)毛羊和湖羊的卵泡期和黃體期研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因在其子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平均出現(xiàn)黃體期>卵泡期。這與Jorgenson等的研究結(jié)果[24]一致。在卵泡期雌激素水平逐漸升高至最大，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚，子宮頸上皮生長(zhǎng)、增高呈高柱狀，增強(qiáng)深層腺體分泌活動(dòng)，黏液分泌量也逐漸增多，子宮肌收縮活動(dòng)也逐漸增強(qiáng)，卵泡逐漸發(fā)育增大。而在黃體期，大量的孕激素分泌，作用于子宮，內(nèi)膜血管增生，子宮變粗，腺體分泌活動(dòng)性加強(qiáng)，子宮肌收縮受到抑制。所以，這一研究結(jié)果也得到了理論知識(shí)的支撐。

綜上試驗(yàn)，本研究得出TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等免疫組織器官中呈現(xiàn)出高表達(dá)水平，說(shuō)明了該受體基因在組織中的表達(dá)特異性。其mRNA在綿羊不同生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)時(shí)空特征，初步揭示TLR4受體在哺乳動(dòng)物繁殖免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

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