灘羊發(fā)情周期內(nèi)4 種生殖激素動態(tài)變化規(guī)律研究

吳艷芳，仲長勝，陳玉林，寇啟芳，馬保華*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；3.紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司，寧夏吳忠 751999）

灘羊是由蒙古羊適應寧夏周邊地區(qū)的環(huán)境條件生存、繁殖衍化而來的地方裘皮綿羊品種，具有晚熟晚育、發(fā)情表現(xiàn)不明顯以及季節(jié)性發(fā)情等繁殖特性。灘羊裘皮潔白美觀，灘羊肉富有營養(yǎng)、味道鮮美、無膻味，灘羊產(chǎn)品受到廣大消費者的青睞。然而傳統(tǒng)灘羊存在大脂尾影響自然交配、繁殖性能低、生長發(fā)育緩慢等缺點，影響了灘羊養(yǎng)殖場（戶）的養(yǎng)殖經(jīng)濟效益和灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，建立灘羊高效繁殖技術體系，在灘羊繁殖、品種選育過程中利用外源激素來調控灘羊的同期發(fā)情、超數(shù)排卵、以便更加準確的進行人工授精、胚胎移植、基因編輯等研究和應用工作。但在實際操作過程中，即使采用相同的激素制劑和處理程序也不能取得很好的效果。本研究在1 個發(fā)情周期內(nèi)檢測灘羊血清促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、雌二醇（E）、孕酮（P）濃度，監(jiān)測灘羊發(fā)情周期外周血生殖激素動態(tài)變化，從而分析灘羊卵泡波動態(tài)發(fā)育情況，為改進灘羊繁殖控制方法、建立灘羊高效繁殖技術體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2020 年10 月于寧夏吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司灘羊養(yǎng)殖場，通過試情的方法選擇發(fā)情周期正常、年齡在1.5～6 歲的繁殖母羊14只，其中1.5 歲、3 歲、5 歲和6 歲的母羊分別為4、4、4 只和5 只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 耗材、試劑盒與儀器設備 一次性真空采血管，1.5 mL離心管，離心機（CT15RE，日立工機式會社）；FSH、LH、EELISA 試劑盒（批號202011）和PELISA 試劑盒（批號202012）為上海邦奕生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法 對選擇的14 只母羊，繼續(xù)用公羊試情1個發(fā)情周期，再次確認發(fā)情期正常，從第2 個發(fā)情周期發(fā)情當天（記為周期的第0 天）開始到下次發(fā)情開始當天、每天10:00 左右頸靜脈采血5 mL，3 000 r/min 離心15 min，將血清吸入1.5 mL 離心管中，做好標記并保存于-20℃，干冰保存條件下寄往上海邦奕生物科技有限責任公司檢測。

1.4 統(tǒng)計分析 采用Excel、GraphPad Prism 6 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖，采用ANOVA 單因素方差分析作差異分析，數(shù)據(jù)以平均值± 標準差表示，<0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 灘羊發(fā)情周期 在14 只試驗羊中，2 只母羊發(fā)情周期為16 d，5 只母羊發(fā)情周期為17 d，4 只母羊發(fā)情周期為18 d，2 只母羊發(fā)情周期為19 d，1 只母羊發(fā)情周期為21 d。發(fā)情母羊表現(xiàn)為接受公羊爬跨，眼觀母羊外陰稍腫大、顏色潮紅、觸感柔軟松弛，探查可見母羊陰黏膜充血伴隨透明粘液流出。

2.2 灘羊發(fā)情周期內(nèi)血清FSH、LH 濃度變化 在發(fā)情周期內(nèi)，灘羊血清樣本FSH 和LH 濃度呈波動性變化。FSH 濃度在發(fā)情前期逐漸升高，在發(fā)情當天出現(xiàn)峰值，濃度為（12.85±0.51）IU/L，在發(fā)情后期呈下降趨勢。FSH 在發(fā)情周期內(nèi)出現(xiàn)2～4 個峰值，F(xiàn)SH 峰值的個數(shù)和出現(xiàn)的時間依發(fā)情周期天數(shù)而有所不同。

發(fā)情周期為16 d 的2 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有2個FSH 峰值分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、7（8）天（圖1-A）。發(fā)情周期為17 d 的5 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，4只母羊有3 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、5（6、7）、12（13、14）天（圖2-A）；1 只母羊有4 個FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、4、7、11 天（圖2）。發(fā)情周期為18 d 的4 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有4 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、5（6）、8（9）、13（14）天（圖3-A）。發(fā)情周期為19 d 的2 只灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，1 只母羊有3 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、8、14 天（圖4-A）；1 只母羊有4 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、7、11、15 天（圖4）。發(fā)情周期為21 d的灘羊在發(fā)情周期內(nèi)，有5 個明顯FSH 峰值，分別出現(xiàn)在發(fā)情周期的第0、6、11、13、17 天（圖5-A）。

圖2 發(fā)情周期為17 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖3 發(fā)情周期為18 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖4 發(fā)情周期為19 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

圖5 發(fā)情周期為21 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

在發(fā)情周期內(nèi)，LH 濃度隨著FSH 濃度變化而相應出現(xiàn)2～4 個峰值（圖1～5 B），LH 濃度在發(fā)情前期逐漸升高，在發(fā)情當天出現(xiàn)峰值，濃度為（21.48±0.68）IU/L，高于發(fā)情周期的其他時期（<0.05），在發(fā)情后期下降。

2.3 灘羊發(fā)情周期內(nèi)血清E、P濃度變化 由圖1-5可知，灘羊發(fā)情周期E、P也呈現(xiàn)波動式變化。E濃度隨著FSH 濃度變化出現(xiàn)2～4 個峰值，表現(xiàn)為在發(fā)情前1～3 d 迅速升高，在發(fā)情當天出現(xiàn)峰值，濃度最大為（21.09 ±0.81）ng/L，高于發(fā)情周期其他時期（<0.05），在發(fā)情后逐漸降低。P濃度在發(fā)情期最低，為（916.29±33.20）pmol/L，發(fā)情后5 d 內(nèi)緩慢上升，在發(fā)情周期6～13 d 處于較高水平，隨后逐漸緩慢降低。

圖1 發(fā)情周期為16 天母羊的4 種生殖激素濃度變化

3 討 論

灘羊發(fā)情周期通常為17～19 d，發(fā)情持續(xù)時間為24～48 h。由于灘羊發(fā)情時外部發(fā)情癥狀表現(xiàn)不明顯，需要利用試情公羊進行試情，試情時發(fā)情母羊愿意或主動接近公羊并接受公羊爬跨。本研究使用的14 只母羊中，發(fā)情周期為16 d 的母羊有2 只、17 d 有5 只、18 d有4 只、19 d 有2 只，21 d 的有1 只，基本能夠代表灘羊發(fā)情周期天數(shù)的總體分布情況。

大多數(shù)哺乳動物卵泡發(fā)育受系統(tǒng)的內(nèi)分泌調控而且以卵泡波的方式進行，在繁殖季節(jié)綿羊每個發(fā)情周期通常有3 個左右的卵泡波，每個卵泡波發(fā)生之前會伴隨著刺激生長卵泡波發(fā)生的FSH 濃度增加，因此每個FSH 分泌峰的出現(xiàn)都代表著1 個卵泡波出現(xiàn)。本研究中，大多數(shù)灘羊在1 個情期內(nèi)出現(xiàn)2～4 個FSH 和LH峰，這與綿羊卵泡波動態(tài)發(fā)育的研究一致。灘羊在發(fā)情期血清FSH 濃度和LH 濃度高于福清山羊、戴云山羊、陜北絨山羊和吐魯番黑羊，這可能是由于品種或測定方法不同導致測定結果的差異，但FSH、LH 在不同品種羊的發(fā)情周期內(nèi)分泌規(guī)律是類似的。FSH 可促進卵泡生長發(fā)育，LH 在卵泡優(yōu)勢化、成熟、恢復卵母細胞減數(shù)分裂和誘發(fā)排卵中發(fā)揮重要作用。本研究中的14 只母羊，在間情期存在1 個比發(fā)情當天FSH 濃度更高的FSH 峰，然而母羊并沒有發(fā)情排卵，認為雖然此時期灘羊體內(nèi)FSH 水平較高，而相應的LH和E水平遠低于發(fā)情期的峰值，說明FSH 水平較高而E和LH 水平較低時不會誘發(fā)灘羊卵泡成熟和排卵，這也表明誘發(fā)灘羊發(fā)情排卵需要適當濃度比例FSH、E和LH 的協(xié)同作用。

灘羊血清E和P在發(fā)情周期內(nèi)呈波動式分泌，發(fā)情當天E濃度達到峰值，P濃度最低，這與在哈薩克綿羊和多浪羊中的報道一致。E可以促進卵泡成熟、提高母畜性欲，少量P與E協(xié)同作用促進雌性動物發(fā)情。有研究認為卵泡波的出現(xiàn)也與雌激素的血清濃度瞬時升高的起始有關，并且最大卵泡生長階段的結束時間與血清雌激素峰值濃度出現(xiàn)時間一致，這與本研究中灘羊血清E在發(fā)情周期內(nèi)隨FSH 峰后出現(xiàn)分泌峰的結果一致。發(fā)情前期在優(yōu)勢卵泡的發(fā)育過程中，E濃度升高和P濃度下降，刺激FSH 和LH 在排卵前形成極大峰值，從而誘發(fā)排卵。發(fā)情排卵后顆粒細胞在LH作用下發(fā)生黃體化，因此P濃度由最低水平開始上升。P在發(fā)情周期的6～13 d 保持較高水平，說明間情期母羊黃體功能正常，高水平P通過負反饋作用抑制下丘腦合成與分泌促性腺激素釋放激素，進而抑制垂體FSH 和LH 的產(chǎn)生和釋放，最終抑制卵巢上卵泡發(fā)育和母畜發(fā)情；間情期結束后，黃體溶解，P濃度下降，解除了對FSH 和LH 產(chǎn)生與釋放的抑制作用，外周血FSH 水平隨之升高，促進有腔卵泡發(fā)育，又出現(xiàn)新的發(fā)情和排卵。這說明P濃度的高低也調控著灘羊的卵泡發(fā)育和發(fā)情。

母羊血清生殖激素檢測結果顯示，發(fā)情周期天數(shù)不同的灘羊在發(fā)情周期內(nèi)卵泡波的數(shù)量和出現(xiàn)的時間差異較大，這可能是同期發(fā)情處理時即使采用相同的激素制劑和程序而結果有較大差異的原因之一。通過研究結果可以分析出，發(fā)情周期16 d 的母羊（n=2）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)2 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的7～8 d，第2 個卵泡波（排卵卵泡波）出現(xiàn)于發(fā)情周期的14 d 左右；發(fā)情周期17 d 的母羊（n=5）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)3 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的5～7 d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的12～14 d，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）出現(xiàn)于發(fā)情周期的15 d左右；發(fā)情周期18 d 的母羊（n=4）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)4 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的5～6 d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的8～9 d，第3 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的13～14 d，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的15 d 左右；發(fā)情周期19 d的母羊（n=2）在發(fā)情周期一般會出現(xiàn)3～4 個卵泡波，第1 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的7（8）d，第2 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的11（14）d，第3 個卵泡波出現(xiàn)在發(fā)情周期的15 d 左右，最后1 個卵泡波（排卵卵泡波）開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的16 d 左右?？傮w來看，灘羊在發(fā)情前3～4 d 均會出現(xiàn)排卵卵泡波，因此確定灘羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生的時間對灘羊同期發(fā)情或超數(shù)排卵程序的準確制定尤為重要。

4 結 論

本研究表明，灘羊血清FSH、LH、E和P共同調控著灘羊的發(fā)情周期和卵泡波動態(tài)發(fā)育。大多數(shù)灘羊發(fā)情周期中出現(xiàn)3～4 個卵泡波，發(fā)情周期16 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的14 d 左右；發(fā)情周期17、18 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的15 d 左右；發(fā)情周期19 d 的母羊最后1 個卵泡波開始發(fā)生于發(fā)情周期的16 d 左右，即大多數(shù)灘羊最后1 個卵泡波開始出現(xiàn)于發(fā)情周期的14～16 d。