線粒體鈣穩(wěn)態(tài)與ATP 生成雙向調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展

陳思遠(yuǎn)，琚昊，王永俠

（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院?動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 311300）

鈣離子（Calcium Ions，Ca）參與凝血、神經(jīng)遞質(zhì)和激素合成及酶活性調(diào)節(jié)等多種生理活動(dòng)，是機(jī)體不可或缺的元素。Ca可通過(guò)激活三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）的Ca敏感脫氫酶和氧化磷酸化（Ox idative Phosphorylation，OXPHOS）的F/F腺嘌呤核苷三磷酸合酶（Adenosine Triphosphate Synthase，ATPase），刺激腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）生成。線粒體內(nèi)Ca濃度（Mitochondrial CaConcen tration，[Ca]）維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)稱為線粒體鈣穩(wěn)態(tài)。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，致使ATP 的生成量大幅減少。同時(shí)，線粒體ATP 生成減少也會(huì)對(duì)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)造成影響。目前學(xué)界有大量針對(duì)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成的研究，但詳細(xì)講述線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和ATP 生成之間的關(guān)系尤其是這二者如何相互影響的文章尚且較少。本文將著重闡述線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和ATP 生成之間的雙向調(diào)控機(jī)制以及兩者在畜牧生產(chǎn)中對(duì)動(dòng)物繁殖的影響，為線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的維持和ATP生成的良性循環(huán)在畜禽繁殖中的作用提供理論參考。

1 線粒體鈣穩(wěn)態(tài)維持與其對(duì)ATP 生成的影響

在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca濃度（Cytoplasmic CaConcentration，[Ca]）在某一較低水平（大約為0.1 μmol/L）維持不變。由于線粒體外膜具有Ca高通透性，此時(shí) [Ca]與 [Ca]相當(dāng)。在細(xì)胞受到刺激引發(fā)Ca內(nèi)流且達(dá)到一定濃度時(shí)，線粒體吸收Ca，當(dāng)刺激消失后又釋放Ca，由此起到緩沖胞內(nèi)Ca劇烈波動(dòng)的作用。

線粒體Ca是調(diào)節(jié)ATP 生成的關(guān)鍵因子，在正常生理狀態(tài)下，[Ca]水平可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)ATP 的生成。ATP 在細(xì)胞分解代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中產(chǎn)生，其主要生成部位在線粒體中OXPHOS 的位置。ATP 的生成過(guò)程分為糖酵解和TCA 2 個(gè)階段。在糖酵解階段，葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)一系列酶解反應(yīng)生成水、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NADH）、ATP 和丙酮酸；丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體后經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（Pyruvate Dehydrogenase Complex，PDC）催化生成NADH 及乙酰輔酶A；乙酰輔酶A 經(jīng)TCA 循環(huán)生成二氧化碳、三磷酸鳥苷（Guanosine Triphosphate）、NADH 和還原黃腺嘌呤二核苷酸（Reduced Flavine Adenine Dinucleotide，F(xiàn)ADH2）。NADH 和FADH中的電子經(jīng)OXPHOS 上多種酶和輔酶的催化轉(zhuǎn)移給氧氣，并在此過(guò)程中逐步釋放能量，并由此泵送氫離子（Hydrogen Ion，H）進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，建立H濃度梯度。最后，ATPase 利用H梯度的電化學(xué)能合成ATP。

Ca進(jìn)入線粒體基質(zhì)后可激活TCA 循環(huán)中的限速酶，包括PDC、異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydroge nase，IDH）和-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（Oxoglutarate Dehydrogenase Complex，OGDC）來(lái)有效提高ATP 產(chǎn)生。

PDC 是一種由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合物，包括丙酮酸脫氫酶（Pyruvate Dehydrogenase，E1）、二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（Dihydrolipoamide Acetyltransferase，E2）和二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide Dehydr ogenase，E3）3 種催化酶及丙酮酸脫氫酶激酶（Pyruvate dehydrogenase Kinase，PDK）和丙酮酸脫氫酶磷酸酶（Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase，PDP）2 種調(diào)節(jié)因子和二氫硫辛酰胺脫氫酶結(jié)合蛋白（Dihydrolipoamide Dehydrogenase-Binding Protein，E3BP）及3 種輔助因子。PDC 活性受PDK 和PDP 調(diào)節(jié)，可由PDK 磷酸化失活，又可經(jīng)PDP 去磷酸化恢復(fù)活性。PDP 存在2 種異構(gòu)體，其中PDP1 活性受到Ca調(diào)節(jié)。當(dāng)PDP1與Ca結(jié)合，PDP1 活性增強(qiáng)。因此，Ca能通過(guò)與PDC 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合與否來(lái)調(diào)節(jié)酶活性。

IDH 可分為2 類，分別與煙酰胺嘌呤二核苷磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）2 種輔酶結(jié)合。在真核生物中，前者存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體，而后一種存在于線粒體。Ca通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合異檸檬酸來(lái)抑制IDH 酶活性。已有研究證明，在生理濃度下，[Ca]升高可增加OGDC活性。

2 線粒體鈣超載及其對(duì)ATP 生成的影響

線粒體鈣超載即[Ca]異常增加，導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的現(xiàn)象。引發(fā)線粒體鈣超載的因素包括肥胖、衰老和劇烈運(yùn)動(dòng)等。線粒體鈣超載不利于線粒體內(nèi)裂變?nèi)诤掀胶獾木S持，可破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，由此將進(jìn)一步破壞線粒體Ca穩(wěn)態(tài)。

在病理狀態(tài)下，線粒體鈣超載能使線粒體膜去極化，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）增加，導(dǎo)致線粒體功能障礙；并通過(guò)線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔（Permeability Transition Pore of Mitochondrial Memb rane，mPTP）、細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）、一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）、電子傳遞鏈（Electron Transport Chain，ETC）復(fù)合物I 和復(fù)合物IV 影響ATP 生成。

mPTP 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，關(guān)于其構(gòu)成目前尚無(wú)定論，但現(xiàn)已普遍認(rèn)為親環(huán)蛋白D（Cyclophilin D，CypD）是mPTP 上唯一關(guān)鍵的活性蛋白。最近的研究表明腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（Adenine Nucleotide Translocase，ANT）和ATPase也參與PTP 構(gòu)成。在高[Ca]情況下，CypD 可通過(guò)調(diào)控線粒體基質(zhì)間的離子交換致使線粒體發(fā)生腫脹，促使mPTP 打開，導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)功能障礙，進(jìn)而造成細(xì)胞死亡。mPTP的開放常伴隨著Cyt c 的釋放。研究表明Cyt c 的釋放與細(xì)胞凋亡相關(guān)。Cyt c 位于線粒體的嵴上，可作為一種傳遞電子的載體參與生物氧化反應(yīng)；或在凋亡初始階段與帶負(fù)電的心磷脂（Cardiolipin，CL）結(jié)合，催化線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)過(guò)氧化。高[Ca]會(huì)促進(jìn)ROS生成，ROS 能使CL 過(guò)氧化，使其重新分布到線粒體外膜，由此促進(jìn)mPTP 的形成及Cyt c 的釋放。Cyt c能調(diào)控ROS 的產(chǎn)生和清除，它的流失會(huì)進(jìn)一步加重過(guò)量ROS 引起的線粒體氧化應(yīng)激，破壞線粒體功能。

NOS 具有3 種類型的同工酶，分別是神經(jīng)元型、內(nèi)皮型和誘導(dǎo)型NOS，其中前兩者為鈣依賴型。有研究指出，Ca濃度的依賴性增加能激發(fā)神經(jīng)和內(nèi)皮NOS 活性，刺激一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的產(chǎn)生，而NO 能影響線粒體功能及ATP 的生成過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)NO 能通過(guò)以下多種方式抑制線粒體的呼吸過(guò)程，從而減少ATP 的產(chǎn)生：其一，NO 通過(guò)與高[Ca]結(jié)合的間接反應(yīng)抑制復(fù)合物I；其二，NO 通過(guò)與氧競(jìng)爭(zhēng)，直接與細(xì)胞色素c 氧化酶（Cytochrome c Oxidase，復(fù)合物IV）可逆結(jié)合，抑制其活性；其三，NO 易與超氧陰離子自由基（Superoxide Anion Radical）結(jié)合生成活性 氮（Reactive Nitrogen Species，RNS），RNS通過(guò)損傷ETC 上酶的活性抑制呼吸作用。

3 ATP 對(duì)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的影響

肌質(zhì)膜Ca-ATPase（Sarcoplasmic Reticulum Ca-ATPase，SERCA）是一種可跨膜進(jìn)行陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP酶，對(duì)Ca存在較高的親和性，能利用ATP 水解的能量通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)把胞質(zhì)內(nèi)Ca泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。SERCA 有3 個(gè)基因編碼并具有多種亞型，其中管家蛋白SERCA2b 內(nèi)包含3 個(gè)負(fù)責(zé)介導(dǎo)ATP 結(jié)合和水解的結(jié)構(gòu)域。SERCA 活性受多種因素調(diào)節(jié)，常見的有膜磷蛋白（Phospholamban）和解偶聯(lián)肌鈣蛋白（Sarcolipin）2 種跨膜蛋白，后者通過(guò)破壞SERCA對(duì)Ca的親和力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca失衡。線粒體ATP 生成下降會(huì)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca攝取，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致SERCA 表達(dá)活性下降，細(xì)胞內(nèi)Ca的循環(huán)和平衡破壞，[Ca]增加，線粒體Ca內(nèi)流加大，最終導(dǎo)致線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡。此外，有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過(guò)阻止ATP 結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的方式導(dǎo)致SERCA 的ATP 依賴性Ca攝取被抑制。

4 鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成對(duì)畜禽繁殖的影響

4.1 鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成對(duì)卵母細(xì)胞的影響 卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)2 次停滯，第1 次是在動(dòng)物性成熟前，大量初級(jí)卵母細(xì)胞停留在第1 次減數(shù)分裂前期；第2 次是次級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)入輸卵管后停留在第2 次減數(shù)分裂中期，只有當(dāng)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后才繼續(xù)完成分裂。在此過(guò)程中，精子上的特異性磷脂酶C Zeta（Phospholipase C Zeta）會(huì)使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（Phosphatidylinositol 4，5-Bisphosphate）裂解產(chǎn)生肌醇三磷酸（Inositol Triphosphate），后者可與肌醇1，4，5-三磷酸受體1（Inositol 1，4，5-Trisphosphate Receptor 1，IP3R1）結(jié)合，打開Ca通道。IP3R1 介導(dǎo)的Ca釋放和SERCA 介導(dǎo)的Ca攝取之間相互作用產(chǎn)生了Ca振蕩，促使第2 次減數(shù)分裂恢復(fù)，因此維持適當(dāng)?shù)拟}穩(wěn)態(tài)對(duì)卵母細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育至關(guān)重要。[Ca]波動(dòng)可影響線粒體代謝，引發(fā)線粒體鈣超載，當(dāng)卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生線粒體鈣超載會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂恢復(fù)的延遲。

卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）可作為遺傳物質(zhì)遺傳給后代，但因缺乏保護(hù)性組蛋白和自身修復(fù)DNA 能力低等原因，較易發(fā)生突變。然而細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸時(shí)難免在mtDNA 附近產(chǎn)生ROS，為減少ROS 誘導(dǎo)的突變，細(xì)胞通過(guò)抑制線粒體活性的方式降低突變頻率，以較低水平的ATP 維持生命活動(dòng)。卵母細(xì)胞的ATP 水平又與受精率及胚胎發(fā)育呈正相關(guān)，低于閾值水平的ATP 可能會(huì)影響卵母細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)程以及進(jìn)一步的胚胎發(fā)育。ATP 還能夠改變Ca振蕩的頻率和持續(xù)時(shí)間，在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞受精過(guò)程中起重要作用。此外，線粒體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和分布模式會(huì)隨著卵母細(xì)胞由不成熟發(fā)展到早期胚胎階段的不同而轉(zhuǎn)變，如不成熟的卵母細(xì)胞內(nèi)部會(huì)缺少線粒體組織或出現(xiàn)較大的線粒體團(tuán)塊。

4.2 鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成對(duì)精子的影響 精子在進(jìn)入雌性生殖道前，以休眠的狀態(tài)存儲(chǔ)在附睪中，由附睪液為其提供環(huán)境支持。附睪液的特征之一是Ca梯度沿附睪小管下降，這意味著在附睪內(nèi)存在著一套鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。附睪內(nèi)局部鈣穩(wěn)態(tài)受損會(huì)導(dǎo)致公雞出現(xiàn)附睪結(jié)石，嚴(yán)重影響公雞的生育能力。此外，線粒體Ca超載會(huì)損傷公雞體外存儲(chǔ)精子的功能。另有研究表明，精子中Ca水平升高會(huì)增加頂體反應(yīng)中精子鞭毛的強(qiáng)度，導(dǎo)致過(guò)度活化的增加。

精子在進(jìn)入雌性生殖道后因出現(xiàn)理化和生物學(xué)改變而獲能，隨后與卵膜上蛋白特異性結(jié)合發(fā)生頂體反應(yīng)。精子獲取能量的方式有2 種，一種是線粒體上的OXPHOS，另一種是發(fā)生于鞭毛頭部和纖維鞘的糖酵解。研究發(fā)現(xiàn)2 種ATP 生成途徑的作用并不完全一致，且首選途徑受到物種差異和環(huán)境底物的影響。有研究證明由熱應(yīng)激（Heat Stress）造成的線粒體活性下調(diào)及ATP 合成的損傷將導(dǎo)致豬精子活力的降低。

4.3 鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成對(duì)胚胎發(fā)育的影響 鈣穩(wěn)態(tài)及ATP 生成對(duì)畜禽繁殖率的影響并不單純停留在影響精子和卵子的活力及發(fā)育方面，而是在整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中都有著重要作用。

在禽類養(yǎng)殖生產(chǎn)中，影響孵化率的主要因素之一就是蛋殼質(zhì)量。蛋殼生物礦化的過(guò)程中需要大量的鈣，這對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)造成了極大的挑戰(zhàn)。雖然雌性禽類在產(chǎn)蛋期間會(huì)通過(guò)增加每日鈣攝入量、增加鈣溶解量并優(yōu)化腸道對(duì)鈣的吸收等特定代謝調(diào)節(jié)方式來(lái)維持鈣穩(wěn)態(tài)，但日糧中鈣供應(yīng)不足或胃腸道鈣吸收不當(dāng)，機(jī)體便會(huì)通過(guò)增加骨髓的動(dòng)員來(lái)滿足暫時(shí)的高鈣需求。然而這一過(guò)程有限且不可持續(xù)，因此鈣穩(wěn)態(tài)的紊亂將導(dǎo)致家禽骨骼礦化、骨質(zhì)疏松及體重減輕，同時(shí)造成蛋殼質(zhì)量不佳而使孵化率降低。在豬和牛等哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育中，調(diào)節(jié)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)受精卵母細(xì)胞維持線粒體功能和促進(jìn)囊泡進(jìn)一步發(fā)育同樣具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b 在豬卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程中可通過(guò)維持[Ca]來(lái)減少ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而避免氧化應(yīng)激引起的胚胎發(fā)育率降低。

ATP 供應(yīng)的不足除了不利于生殖細(xì)胞的發(fā)育成熟外，還會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂異常甚至破裂，降低受精率。線粒體作為ATP 產(chǎn)生的重要來(lái)源，對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育至關(guān)重要。早期卵裂期胚胎內(nèi)的線粒體完全繼承于卵母細(xì)胞，且數(shù)量保持不變，因此需要極大地依賴與多種細(xì)胞內(nèi)底物（即丙酮酸、脂肪酸和谷氨酰胺）的OXPHOS 來(lái)產(chǎn)生ATP。Liu 等發(fā)現(xiàn)在雞胚胎快速生長(zhǎng)的時(shí)期，糖酵解I/ 糖異生I 及TCA 循環(huán)II 同樣增加。研究發(fā)現(xiàn)給老年母豬補(bǔ)充原型輔酶Q和積雪草酸可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，增加 ATP 的產(chǎn)量與活性，從而改善胚胎的質(zhì)量及后續(xù)發(fā)育。綜上所述，不論是作為信號(hào)分子的Ca還是ATP，都能從多個(gè)方面對(duì)生殖細(xì)胞的活性和質(zhì)量以及胚胎進(jìn)一步的發(fā)育產(chǎn)生影響。鈣穩(wěn)態(tài)的失衡及ATP 生成的不足最終將降低畜禽的繁殖效率。

5 小結(jié)與展望

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，以產(chǎn)生ATP、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)控細(xì)胞凋亡等功能為人們熟知。線粒體在緩沖胞質(zhì)Ca波動(dòng)的同時(shí)仍需要維持自身內(nèi)部的鈣平衡，這與線粒體其他功能的發(fā)揮息息相關(guān)。根據(jù)上述內(nèi)容，可以更加清晰地認(rèn)識(shí)到，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和鈣超載可分別通過(guò)TCA 限速酶及mPTP 孔、Cyt c、NOS和ETC 上的復(fù)合物來(lái)調(diào)控ATP 生成，而ATP 的生成又能經(jīng)SERCA 反過(guò)來(lái)影響線粒體鈣穩(wěn)態(tài)。不論是線粒體鈣超載的發(fā)生還是ATP 生成減少，都可能導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終造成細(xì)胞損傷甚至死亡。在畜禽養(yǎng)殖上，要注意二者在畜禽生殖細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育方面發(fā)揮的作用，維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和ATP 生成之間的良性循環(huán)，以求更加有效地提高畜禽的繁殖性能。