三七總皂苷對(duì)大鼠急性重癥胰腺炎鈣超載中CaMKⅡ-γ表達(dá)的影響

董文志 周陽(yáng) 劉志恒 莫小華

摘要：目的 探討三七總皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺組織中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ-γ（CaMKⅡ-γ）基因和蛋白水平的表達(dá)，降低細(xì)胞鈣超載的程度，減輕急性重癥胰腺炎時(shí)胰腺組織的損傷。方法 雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)（SO）組、重癥急性胰腺炎（SAP）組、三七總皂苷干預(yù)（PNS）組。檢測(cè)3組大鼠的血清淀粉酶（AMS）、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、胰腺組織內(nèi)CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表達(dá)量、并對(duì)大鼠胰腺石蠟切片進(jìn)行病理評(píng)分。結(jié)果 SAP組及PNS組在術(shù)后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶、胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA的表達(dá)量、胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達(dá)量、胰腺組織病理評(píng)分及胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8h、12h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA及CaMKⅡ-γ 蛋白表達(dá)量均明顯高于PNS組（P均<0.05），SAP組在術(shù)后8h、12h、24h的胰腺組織病理評(píng)分及胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于PNS組（P均<0.05）。結(jié)論 1.CaMKⅡ-γ在大鼠SAP模型中高表達(dá)，其與大鼠胰腺炎鈣超載的發(fā)生有關(guān)。2.三七總皂苷可以通過(guò)降低CaMKⅡ-γ在胰腺組織內(nèi)的表達(dá)，減輕胰腺細(xì)胞鈣超載的程度，對(duì)胰腺組織起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：SAP;PNS;鈣超載;CaMKⅡ-γ

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）09-0067-04

Effect of Panax Notoginseng Saponins on Expression of CaMKII-γin Calcium

Overload in Rats with Acute Severe Pancreatitis

DONG Wen-zhi， ZHOU Yang， LIU Zhi-heng， MO Xiao-hua

（The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650101， China）

【Abstract】Objective： To study whether Panax notoginseng saponins can reduce the expression of calmodulin-dependent protein kinase II-γ（CaMKII-γ） gene and protein in pancreatic tissue of rats with pancreatitis， lower the degree of calcium overload and alleviate the pancreatic tissue damage during acute severe pancreatitis. Methods： 120 SD male rats were randomly divided into 3 groups， sham operation （SO） group， severe acute pancreatitis （SAP） group and Panax notoginseng saponin intervention （PNS） group. The serum amylase （AMS）， intracellular Ca2+ concentration， CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γprotein expression in pancreatic tissue were detected in three groups， and their pathological scores were obtained from rat pancreatic paraffin sections. Results： The serum amylase， pancreatic tissue CaMKII-γand mRNA expression， pancreatic tissue CaMKII-γ， protein expression， pancreatic tissue pathological score and pancreatic intracellular Ca at 4h， 8h， 12h and 24h after operation and the concentration of 2+ in SAP group and PNS group were significantly higher than those of SO group （P<0.05）. The expression of CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γ protein in pancreatic tissue of SAP group were significantly higher than that of PNS group at 8h and 12h after operation （P<0.05）， the pathological scores of pancreatic tissue and the concentration of Ca2+ in pancreatic cells in the SAP group were significantly higher than those in the PNS group at 8h， 12h and 24h after operation （P<0.05）. Conclusion： A. CaMKII-γ is highly expressed in rat SAP model， which is related to the occurrence of calcium overload in rat pancreatitis. B. Panax notoginseng saponins can reduce the degree of calcium overload in pancreatic cells by reducing the expression of CaMKII-γ in pancreatic tissue and protect pancreatic tissue.

【Key words】 SAP， PNS， calcium overload， CaMKII-γ

隨著學(xué)者們對(duì)SAP研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡“鈣超載”是 SAP 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)，通過(guò)阻斷“鈣超載”，可延緩SAP病情的發(fā)展[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ-γ是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+的重要調(diào)控蛋白，對(duì)細(xì)胞膜上的鈣通道以及細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)膜上的相關(guān)鈣通道的調(diào)節(jié)都起著重要作用[2]。本實(shí)驗(yàn)是想通過(guò)建立大鼠SAP模型，三七總皂苷腹腔注射，檢測(cè)大鼠的血清淀粉酶、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、胰腺組織內(nèi)CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表達(dá)量、并對(duì)大鼠胰腺石蠟切片進(jìn)行病理評(píng)分。以尋求SAP鈣超載的發(fā)生機(jī)制和三七總皂苷對(duì)鈣超載改善作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年清潔級(jí)SD雄性大鼠120只，體重200～250 g，120只SD大鼠隨機(jī)分成3組：①假手術(shù)組（SO組，n=40）;②重癥急性胰腺炎組（SAP組，n=40）;③三七總皂苷介入組（PNS組，n=40）。分別于術(shù)后4、8、12、24h時(shí)，每組隨機(jī)各選取10只大鼠處死采集標(biāo)本。

1.2 SO動(dòng)物模型制備 開(kāi)腹后僅將十二指腸提出切口，用棉簽輕輕翻動(dòng)胰腺3次，不注射?；悄懰徕c，消毒棉球及滲出液后，注射生理鹽水（0.1 mL/100 g）補(bǔ)液。縫合腹壁各層。

1.3 SAP組動(dòng)物模型制備 辨認(rèn)十二指腸降部腸管壁內(nèi)潛行的胰膽管，用無(wú)損傷絲線結(jié)扎肝門處膽管，提起十二指腸辨認(rèn)出十二指腸乳頭處，在其對(duì)側(cè)腸壁，用預(yù)先去尖鈍針頭1 mL注射器插入腸腔，探查十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭逆行穿刺入胰膽管并向前推進(jìn)約0.5 cm，使用無(wú)損傷血管夾固定針頭。以0.2 mL/min的速度向胰膽管內(nèi)注入5% ST（0.1 mL/100 g），注射完畢后約2～3 min肉眼觀察確認(rèn)大鼠胰腺組織水腫，顏色變?yōu)榇u紅色或灰白色，繼續(xù)維持針頭原位2 min，用消毒棉簽吸凈腹腔內(nèi)滲出，解開(kāi)結(jié)扎在肝門部的絲線。注射生理鹽水（0.1 mL/100 g）補(bǔ)液。縫合腹壁各層。建立大鼠SAP模型。

1.4 PNS組動(dòng)物模型制備 在進(jìn)行胰腺炎模型建模前，行腹腔注射三七總皂苷[50 mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/100 g）]。注射后1h，按照SAP組方法建立急性重癥胰腺炎模型。成功建立大鼠PNS模型。3組大鼠術(shù)后背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg，以補(bǔ)充術(shù)巾丟失水分。清醒后自由飲水，仍然禁食。

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后按預(yù)定時(shí)間點(diǎn)從各組隨機(jī)挑選10只大鼠麻醉后經(jīng)原切口進(jìn)腹，觀察胰腺炎癥及腹水性質(zhì)，快速采集血液標(biāo)本和組織標(biāo)本。心臟采血3-4mL，離心后取上層血清置EP管中-80°C保存，用于檢測(cè)血清淀粉酶。取全部胰腺組織，25%置于4%多聚甲醛溶液中固定、切片HE染色用于病理組織觀察;25%用于CamkII-γ mRNA測(cè)定;25%用于CaMKII-γ 蛋白含量測(cè)定;25%新鮮標(biāo)本制備成細(xì)胞懸液供細(xì)胞內(nèi)（Ca2+）測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SO組、SAP組、PNS組不同時(shí)相大鼠血清淀粉酶濃度比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶均明顯高于SO組（P均<0.05），SAP組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的血清淀粉酶與PNS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均≥0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 SO組、SAP組、PNS組不同時(shí)相大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA表達(dá)水平的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA的表達(dá)量均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h、24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA與PNS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均≥0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 SO組、SAP組、PNS組不同時(shí)相大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達(dá)水平的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白的表達(dá)量均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h、24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白與PNS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均≥0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 SO組、SAP組、PNS組不同時(shí)相胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的比較 將轉(zhuǎn)染了熒光顯色劑的胰腺組織碎片，放在載玻片上，使用蓋玻片輕壓胰腺組織。使用熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子的顯影，呈現(xiàn)綠光（見(jiàn)圖1、圖2）。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度（FI）來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度大小。SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h、24 h的胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h的胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與PNS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均≥0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 SO組、SAP組、PNS組不同時(shí)相胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h、24 h的胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4h的胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分與PNS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均≥0.05）。見(jiàn)表5。

表1 各組血清淀粉酶（AMS）水平的比較（x±s，U/L）

注：與SO組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA表達(dá)水平的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達(dá)水平的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠胰腺胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表5 各組大鼠胰腺胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

圖1 在普通顯微鏡下胰腺組織的形態(tài)

圖2 在熒光顯微鏡下組織內(nèi)Ca2+呈現(xiàn)綠色

3 討論

急性胰腺炎為外科常見(jiàn)的急腹癥之一，其患者中的20%-30%為SAP患者，SAP病情發(fā)展兇險(xiǎn)，死亡率較高。導(dǎo)致SAP治療難度大的原因之一是其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，對(duì)其機(jī)制的研究也還不夠透徹。因而其發(fā)病機(jī)制的研究一直是學(xué)者們研究的重中之重。自“胰腺腺泡細(xì)胞鈣超載學(xué)說(shuō)”被提出以來(lái)，鈣超載學(xué)說(shuō)一直成為研究的熱點(diǎn)，并且有學(xué)者認(rèn)為，胰腺腺泡“鈣超載”在 SAP 發(fā)病機(jī)制中占有中心地位[3]。

Ca2+是胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行生理活動(dòng)的主要離子。在靜息狀態(tài)下，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定在150mmL/L水平左右，刺激狀態(tài)下Ca2+呈波動(dòng)性變化。細(xì)胞Ca2+主要存儲(chǔ)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在胰腺腺泡細(xì)胞中的濃度與分泌顆粒在細(xì)胞中的分布一致。胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)可分為生理性和病理性兩種明顯不同反應(yīng)。

生理狀態(tài)下胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)會(huì)發(fā)生小幅度的振蕩，主要受神經(jīng)性遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）和循環(huán)激素縮膽囊素（CCK）激發(fā)。乙酰膽堿和縮膽囊素的受體位于腺泡細(xì)胞的基底區(qū)質(zhì)膜上[4-5]，它們接受刺激產(chǎn)生第二信使并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子。小幅度的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)振蕩和全細(xì)胞鈣信號(hào)振蕩波是生理性的鈣信號(hào)。但是過(guò)量的乙酰膽堿和縮膽囊素以及甲萘醌（氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑）能引起全細(xì)胞鈣離子超載，這最終能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。病理狀態(tài)下，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣釋放通道Ryanodine受體和質(zhì)膜SOCs通道開(kāi)放，引起細(xì)胞外鈣離子順化學(xué)梯度大量?jī)?nèi)流，同時(shí)伴有細(xì)胞ATP耗竭及生物膜的損傷，二者皆可影響鈣-鎂ATP酶活性，導(dǎo)致升高的鈣離子不能有效重吸收或泵出細(xì)胞外，不僅影響細(xì)胞正常分泌功能導(dǎo)致胰酶大量分泌造成胰腺組織“自我消化”，甚至導(dǎo)致胰酶在胞內(nèi)的過(guò)早激活，最終導(dǎo)致SAP的發(fā)病。

鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）存在于體內(nèi)所有重要器官中。它主要存在于神經(jīng)組織，其中大腦中含量高，總蛋白含量的1%，其中在突觸后致密帶占神經(jīng)總蛋白含量的20%～30% 。胰島中含量很高，它也較多地存在于垂體前葉細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[6]。CaMKⅡ在細(xì)胞中的主要作用是調(diào)節(jié)器Ca2+的代謝。但是其在不同的組織中，以不同形式存在，發(fā)揮不同作用。

鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一種多功能蛋白激酶，存在于體內(nèi)所有重要器官中，純化的CaMKⅡ幾乎無(wú)活性，其與鈣/鈣調(diào)素結(jié)合后，自身要通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)：①作用于胞膜L型鈣通道，磷酸化胞膜上的電壓依賴性鈣通道及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，起易化作用，使其開(kāi)放能力增加，大量鈣離子進(jìn)入細(xì)胞[2]。②磷酸化可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白（sorcin），去除后者對(duì)肌質(zhì)網(wǎng)上鈣釋放通道Ryanodine受體（RyR）的抑制，使其開(kāi)放時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放增加。通過(guò)以上途徑降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，大大避免細(xì)胞的鈣超載發(fā)生。在胰腺外分泌細(xì)胞，它可以被鈣離子釋放激素氨甲酰甲膽堿、膽囊收縮素所激活，但是它不被血管活性腸肽激活。鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ 在胰島素分泌中起重要作用。在β細(xì)胞中它主要是以β3 同工酶的形式存在[7]。CaMKⅡ的多克隆抗體的免疫化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胰島有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，垂體有中度的免疫反應(yīng)，肌肉細(xì)胞也有適度反應(yīng)。

在試驗(yàn)中就是將上述的“鈣超載”、“CaMKⅡ-γ”以及“三七總皂苷”與“SAP”的發(fā)病機(jī)制和治療進(jìn)行研究。我們使用逆行胰膽管注射法建立大鼠SAP模型，通過(guò)檢測(cè)血清淀粉酶、觀察腹水情況、評(píng)估胰腺組織變化來(lái)明確SAP模型建立成功與否。在SAP發(fā)病過(guò)程中，我們觀察大鼠血清中的Ca2+在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)降低，這和臨床工作中人體SAP病情變化相一致，可以推測(cè)降低的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+時(shí)，我們使用Fluo-3-am生理學(xué)探針，其可以特異標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，探針標(biāo)記后的胰腺細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Ca2+的熒光強(qiáng)度（FI），使用胰腺細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度（FI）代表細(xì)胞內(nèi)“鈣超載”的程度。實(shí)驗(yàn)中我們得出：SAP時(shí)胰腺細(xì)胞發(fā)生“鈣超載”。在CaMKⅡ-γ的檢測(cè)，通過(guò)基因和蛋白兩個(gè)水平分別闡述，兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相互印證，都能說(shuō)明其在在胰腺細(xì)胞中的表達(dá)均有細(xì)胞“鈣超載”的發(fā)生有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)課題中，使用PNS腹腔注射預(yù)治療SAP，對(duì)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，筆者得出：三七總皂苷可以通過(guò)抑制胰腺組織中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞內(nèi)“鈣超載”的程度，對(duì)胰腺組織進(jìn)行保護(hù)。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)建立SAP模型，三七總皂苷腹腔注射，從“胰腺鈣超載學(xué)說(shuō)”方面解釋了SAP的可能發(fā)病機(jī)制，并且闡述了三七總皂苷治療SAP的可能機(jī)制，即三七總皂苷可以通過(guò)抑制胰腺組織中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表達(dá)，從而減輕細(xì)胞內(nèi)“鈣超載”的程度，以致達(dá)到治療胰腺炎的作用。相信通過(guò)人們更多的研究及努力，對(duì)SAP發(fā)病機(jī)制的研究將會(huì)越來(lái)越透徹，最終實(shí)現(xiàn)預(yù)防及更有效治療重癥急性胰腺炎的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]薛平，鄧力暉，張肇達(dá)，等.柴芩承氣湯減輕急性胰腺炎大鼠胰腺鈣超載的機(jī)制研究[M].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008;10（6），1054-1058.

[2]CurrieS.Cardiac ryanodine receptor phosphorylation by CaM Kinase II：keeping the balance right[J].Front Biosci，2009，14：5134-5156.

[3]Nagar AB，Gorelick FS.Acute pancreatitis[M].Curr Opin Gastroenterol，2002;18（5）：552-557.

[4]ThornP，LawrieAM，SmithPM，etal.Localand global cytosolic Ca2+oscillations inexocrine cells ev-oked by agonists and inositoltrisphosphate[J].Cell，1993，74（4）：661-668.

[5]Nathanson MH，F(xiàn)allon MB，Padfield PJ，et al.Localization of the type 3 inositol 1，4，5-trisp-hosphate receptor in the Ca2+ wave trigger zone of pancreatic acinar cells[J].cells，1993，74（4）：661-668.

[6]Cui ZJ，Gorelick FS，Dannies PS.Calcium/calmodulin-dependent protein kinase-II activation in rat pituitary cells in the presence of thyrotropin-releasing hormone and dopamine[J].Endocrinology，1994，134（5）：2245-2250.

[7]Urquidi V，Ashcroft SJ.A novel pancreatic beta-cell isoform of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II（beta3 isoform）contains a proline rich tandem repeat in the assoc-iation domain[J].FEBS Lett.1995，358（1）：23-26.

（收稿日期：2018-05-15）