全蝎-土鱉蟲藥對抑制NF-κB信號(hào)通路減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠骨破壞研究

趙呈雷，何晶晶，王馨瑩，盧 曼，楊 杰，曹 鵬, 3

全蝎-土鱉蟲藥對抑制NF-κB信號(hào)通路減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠骨破壞研究

趙呈雷1, 2，何晶晶1，王馨瑩1，盧 曼1，楊 杰1, 2，曹 鵬1, 2, 3

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

研究全蝎-土鱉蟲藥對減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型小鼠關(guān)節(jié)骨破壞的作用以及對破骨細(xì)胞分化的核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的影響，探討全蝎-土鱉蟲藥對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。DBA/1J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及全蝎-土鱉蟲低、高劑量組和甲氨蝶呤組。除正常組外，其余組建立CIA模型，正常組和模型組ig純凈水，其余各組給藥干預(yù)4周。測定各組小鼠足趾腫脹情況；采用Micro-CT掃描的方法重建小鼠關(guān)節(jié)3D圖并分析相關(guān)骨參數(shù)；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠踝關(guān)節(jié)病理變化；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色檢測關(guān)節(jié)中破骨細(xì)胞分化情況。體外實(shí)驗(yàn)考察全蝎-土鱉蟲藥對對核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）處理的小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的影響；免疫熒光染色檢測NF-κB p65核定位情況。Western blotting檢測破骨細(xì)胞分化、CIA小鼠骨組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。各給藥組顯著降低CIA模型小鼠足趾腫脹（＜0.05、0.01）；與模型組比較，Micro-CT 3D重建結(jié)果表明，全蝎-土鱉蟲藥對明顯抑制CIA模型小鼠骨破壞，保留小鼠骨結(jié)構(gòu)完整性，顯著改善骨參數(shù)（＜0.05、0.01）；全蝎-土鱉蟲藥對顯著減少關(guān)節(jié)TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)量（＜0.01）；全蝎-土鱉蟲藥對高劑量組顯著降低CIA小鼠骨組織中NF-κB p65磷酸化水平（＜0.01）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全蝎-土鱉蟲藥對顯著抑制破骨細(xì)胞的分化（＜0.01），抑制NF-κB p65核定位；與RANKL對照組比較，全蝎-土鱉蟲藥對組p65、核因子-κBα抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor-κB alpha，IκBα）磷酸化水平明顯降低（＜0.05、0.01）。全蝎-土鱉蟲藥對能夠減輕CIA小鼠骨破壞，可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化、降低破骨細(xì)胞的分化而發(fā)揮作用。

全蝎-土鱉蟲藥對；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠；破骨細(xì)胞；NF-κB信號(hào)通路

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性、慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的自身免疫性疾病。RA是一種臨床常見病和多發(fā)病，全世界約有1%的成人發(fā)病。隨著滑膜的增生，后期可對關(guān)節(jié)軟骨和骨組織侵蝕，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和滑囊破壞，最終關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。RA反復(fù)發(fā)作，不斷侵蝕關(guān)節(jié)骨和軟骨，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，同時(shí)也是導(dǎo)致我國人群勞動(dòng)力喪失和致殘的主要疾病之一，目前尚無有效治療RA骨破壞的方法，因此，抑制骨破壞被認(rèn)為是治療RA的重點(diǎn)[2]。破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，許多證據(jù)表明，破骨細(xì)胞在RA骨破壞中起著關(guān)鍵作用[3-4]，RA患者骨破壞關(guān)節(jié)部位存在大量分化成熟的破骨細(xì)胞，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟有利于防治RA骨破壞。研究表明，在RA發(fā)病中多種細(xì)胞因子可以激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路是破骨細(xì)胞分化的主要信號(hào)通路之一[5]。

全蝎-土鱉蟲藥對為臨床治療RA的常用藥對，具有祛風(fēng)通絡(luò)、逐瘀散結(jié)的功效，在控制RA疾病發(fā)展方面療效明顯。全蝎-土鱉蟲藥對是否通過抑制破骨細(xì)胞分化起到治療RA的作用尚不清楚。本研究采用II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型，探討全蝎-土鱉蟲藥對治療CIA小鼠骨破壞的作用，觀察全蝎-土鱉蟲體外對破骨細(xì)胞分化NF-κB信號(hào)通路的影響，初步研究其潛在的作用機(jī)制，為全蝎-土鱉蟲治療RA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性DBA/1J小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005；SPF級雄性C57BL/6小鼠6只，7周齡，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2021-0013。動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫（20±2）℃，相對濕度50%～60%，12 h光/暗循環(huán)光照，自由飲水和攝食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合江蘇省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)AEWC-20211123-174。

1.2 藥材

全蝎（鄭州潤龍制藥股份有限公司，批號(hào)18040115）、土鱉蟲（江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)201806），經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院黃一平研究員鑒定分別為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎Karsch的干燥體和鱉蠊科昆蟲地鱉雌蟲Walk的全體。

1.3 藥品與試劑

甲氨蝶呤片（2.5 mg/片，批號(hào)036210701）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；免疫級牛II型膠原（批號(hào)210217v）、完全弗氏佐劑（批號(hào)190288）、弗氏不完全佐劑（批號(hào)210332）購自美國Chondrex公司；重組小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF，批號(hào)ME4920081）、重組小鼠核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL，批號(hào)CWA2519111）購自美國R&D公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（批號(hào)SLBP7795V）購自美國Sigma-Aldrich公司；p65抗體（批號(hào)13）、p-p65抗體（批號(hào)17）、核因子-κBα抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor-κB alpha，IκBα）抗體（批號(hào)17）、p-IκBα抗體（批號(hào)18）、β-actin抗體（批號(hào)12）、HRP標(biāo)記的IgG二抗，HRP連接抗體（批號(hào)29）購自美國CST公司；CCK-8試劑（批號(hào)110427）購自美國MCE公司。

1.4 儀器

HERA CELL 150型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SG604型二級生物安全柜（美國BAKER公司）；Skyscan 1176型Micro-CT（德國Bruker公司）；Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；520MR型鼠爪腫脹測量儀（美國IITC公司）；Axio Observer A1型蔡司倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；Mini-Protean垂直板電泳槽、Mini Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 全蝎-土鱉蟲藥對的制備

全蝎-土鱉蟲藥對組方臨床處方常用劑量為全蝎6 g、土鱉蟲10 g。分別取全蝎、土鱉蟲粉碎，過24目篩。按質(zhì)量比3∶5分別取全蝎、土鱉蟲過篩粉末，混合，加10倍量的去離子水煎煮提取2次，每次45 min，合并提取液，減壓濃縮，得0.2 g/mL的濃縮液。通過高效液相色譜法檢測提取物主要成分腺苷、次黃嘌呤含量，其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.045%、0.25%，同時(shí)通過競爭性酶聯(lián)免疫吸附法測定makatoxin-3[6]的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09%，對全蝎-土鱉蟲藥對提取物進(jìn)行質(zhì)控。

2.2 CIA模型的建立與分組

將50只雄性DBA/1J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及全蝎-土鱉蟲低、高劑量組和甲氨蝶呤組，每組10只。按照文獻(xiàn)方法制備CIA模型[7-8]，將2 mg/mL牛II型膠原蛋白與2 mg/mL完全弗氏佐劑在相對無菌的4 ℃環(huán)境下混合乳化，以乳劑滴入水中不擴(kuò)散為乳化完成終點(diǎn)。首次免疫，除正常組外，其余每只小鼠在尾部距離尾根0.5 cm處sc 0.1 mL上述乳化好的乳劑，此為第0天；第21天加強(qiáng)免疫，免疫佐劑為弗式不完全佐劑，加強(qiáng)免疫時(shí)距離尾根部1.5 cm，每只小鼠免疫劑量0.1 mL。

2.3 給藥方法

參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]附錄中人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，計(jì)算小鼠的全蝎-土鱉蟲藥對等效劑量為2.08 g/(kg·d)，其2倍劑量4.16 g/(kg·d)定為高劑量，甲氨蝶呤組劑量為0.65 mg/kg。待CIA模型小鼠建立成功后ig藥物，正常組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，甲氨蝶呤組每周2次ig給藥，給藥4周。

2.4 足腫脹度測量

采用鼠爪腫脹測量儀測量小鼠雙后肢容積，以鼠爪對水的壓力的質(zhì)量轉(zhuǎn)換值（g）表示，每4天測量1次，直至處死。

2.5 Micro-CT掃描

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，隨機(jī)取各組5只小鼠左后肢進(jìn)行Micro-CT掃描分析，掃描參數(shù)：層厚18 μm，電壓50 kV，電流455 μA。掃描結(jié)束后采用CTvox軟件對骨骼進(jìn)行3D重建，采用CTAn軟件分析骨參數(shù)（骨密度、骨小梁厚度、骨表面積與骨體積比值、骨體積分?jǐn)?shù)）。

2.6 組織學(xué)染色分析

將已固定好的小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)以下部分剔除皮膚和肌肉組織，置10% EDTA脫鈣溶液中脫鈣4周，將脫鈣好的小鼠骨骼組織進(jìn)行石蠟包埋切片，切片厚度5 μm。對切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）和TRAP染色。

2.7 小鼠骨髓單核-巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）的分離和培養(yǎng)

BMMs從6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠的長骨中分離得到[10]，分散在含10%胎牛血清、30 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，貼壁細(xì)胞即為BMMs。

2.8 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)評價(jià)全蝎-土鱉蟲藥對對BMMs的毒性。將全蝎-土鱉蟲藥對提取濃縮液用α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，過0.22 μm無菌微孔濾膜，設(shè)置0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL劑量組，各劑量組分別置于滲透壓儀中檢測，滲透壓均在哺乳動(dòng)物細(xì)胞適宜的260～320 mmol/kg范圍內(nèi)。BMMs以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、30 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入上述不同質(zhì)量濃度的全蝎-土鱉蟲藥對提取物，分別繼續(xù)培養(yǎng)48、96 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞毒性，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

2.9 破骨細(xì)胞分化及給藥

將BMMs消化后以1×104/孔接種于48孔板，培養(yǎng)在含30 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)液中，同時(shí)給予全蝎-土鱉蟲藥對提取液干預(yù)，設(shè)置空白組、RANKL對照組及全蝎-土鱉蟲（0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL）組，每組平行設(shè)置3個(gè)孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d，每2天全量換液1次，BMMs分化成多核的破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞分化結(jié)束后加入4%多聚甲醛溶液固定10 min，依據(jù)TRAP染色試劑盒說明進(jìn)行TRAP染色，細(xì)胞核≥3的細(xì)胞為TRAP染色陽性多核破骨細(xì)胞，并在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量。

2.10 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞爬片置入24孔板中，BMMs細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板中，加入30 ng/mL M-CSF培養(yǎng)24 h，設(shè)置空白組、RANKL對照組及全蝎-土鱉蟲（1.0 mg/mL）組，其中全蝎-土鱉蟲給藥8 h后加入RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)，RANKL誘導(dǎo)1 h，吸棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100滲透15 min，PBS清洗2次，加入1%牛血清白蛋白阻斷30 min，將固定的細(xì)胞與p65一抗孵育過夜，PBS清洗3次，避光加入熒光標(biāo)記二抗孵育1 h，PBST清洗爬片3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBST清洗4次，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡觀察采集圖像。

2.11 Western blotting檢測NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.11.1 Western blotting檢測RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) BMMs以6×105/孔接種于6孔板，于含10%胎牛血清、30 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，加入1 mg/mL全蝎-土鱉蟲提取物，6 h之后加入50 ng/mL的RANKL分別刺激5、10、20、30、60 min，細(xì)胞用PBS清洗2次，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入p-IκBα、IκBα、p-p65、p65抗體孵育后顯影，采用Image J軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。

2.11.2 Western blotting檢測CIA小鼠骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，隨機(jī)取各組3只小鼠后肢，去除皮膚及肌肉組織，將含有踝關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)的后肢骨置研缽中，加入適量液氮冷凍，迅速研磨，得骨組織粉末，收集骨組織粉末置1.5mL離心管中，加入RIPA裂解液和研磨珠，離心管置低溫研磨儀中充分研磨，研磨結(jié)束后離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。采用Western blotting檢測p-p65和p65蛋白表達(dá)。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 全蝎-土鱉蟲抑制CIA小鼠足趾腫脹

如圖1所示，小鼠第2次免疫后7 d腳趾最先開始出現(xiàn)腫脹，隨著時(shí)間的進(jìn)展，模型組小鼠腳背和踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，后爪關(guān)節(jié)僵硬，第44天腫脹達(dá)到高峰。與模型組比較，全蝎-土鱉蟲組第32天后呈劑量相關(guān)性地顯著減輕了CIA小鼠足趾腫脹程度（＜0.05、0.01）。甲氨蝶呤組能顯著抑制CIA小鼠足趾腫脹情況（＜0.05），其抑制效果與全蝎-土鱉蟲低劑量組類似。

3.2 全蝎-土鱉蟲降低CIA小鼠關(guān)節(jié)骨破壞

Micro-CT成像分析可以更直觀地評估全蝎-土鱉蟲藥對抑制CIA小鼠骨破壞的效果，對小鼠足關(guān)節(jié)Micro-CT掃描結(jié)果進(jìn)行3D重建，得小鼠足3D骨結(jié)構(gòu)圖。如圖2所示，模型組小鼠骨表面粗糙、關(guān)節(jié)變形，有嚴(yán)重的骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞的特征。與模型組比較，全蝎-土鱉蟲低、高劑量組對CIA小鼠骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞均有保護(hù)作用，且高劑量組幾乎未見骨侵蝕。3D重建圖顯示，甲氨蝶呤組能抑制CIA小鼠骨破壞，全蝎-土鱉蟲高劑量組抑制踝關(guān)節(jié)和趾骨關(guān)節(jié)骨破壞作用要優(yōu)于甲氨蝶呤組。全蝎-土鱉蟲低、高劑量組能顯著改善CIA小鼠的骨密度、增加骨小梁厚度、提高骨體積分?jǐn)?shù)、降低骨表面積與骨體積比值（＜0.05、0.01）。骨參數(shù)結(jié)果表明，全蝎-土鱉蟲能延緩CIA小鼠骨侵蝕放射學(xué)進(jìn)展，對CIA小鼠骨侵蝕具有顯著緩解作用。

與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖2、4、9同

圖2 全蝎-土鱉蟲對CIA小鼠骨破壞的影響和相關(guān)骨參數(shù)分析(, n = 5)

3.3 全蝎-土鱉蟲改善CIA小鼠關(guān)節(jié)病理并減少關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞分化

3.3.1 病理切片HE染色觀察 如圖3所示，模型組可見滑膜組織增生、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、關(guān)節(jié)腔狹窄、關(guān)節(jié)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，全蝎-土鱉蟲組和甲氨蝶呤組可減輕滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)腔炎性細(xì)胞浸潤，且全蝎-土鱉蟲高劑量組優(yōu)于甲氨蝶呤組。

3.3.2 TRAP染色分析 如圖4所示，模型組小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)可見大量染成紅色的陽性破骨細(xì)胞，全蝎-土鱉蟲低、高劑量組均能顯著抑制小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)破骨細(xì)胞的分化形成（＜0.01），且其抑制作用呈劑量相關(guān)性。甲氨蝶呤組能抑制小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)破骨細(xì)胞的分化（＜0.01），但其抑制作用低于全蝎-土鱉蟲低、高劑量組。

3.4 全蝎-土鱉蟲對BMMs細(xì)胞活力的影響

如圖5所示，與空白組比較，0.250、0.500、1.000 mg/mL的全蝎-土鱉蟲對BMMs的增殖無明顯影響，0.125 mg/mL的全蝎-土鱉蟲對BMMs增殖有顯著促進(jìn)作用（＜0.05、0.01）；2.000 mg/mL的全蝎-土鱉蟲對BMMs增殖有顯著抑制作用（＜0.01）。因此，選擇全蝎-土鱉蟲質(zhì)量濃度≤1 mg/mL進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 全蝎-土鱉蟲對CIA小鼠關(guān)節(jié)骨破壞的影響(HE, ×200)

圖4 全蝎-土鱉蟲對CIA小鼠關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞形成的影響(, n = 3)

與空白組（0 mg·mL?1）比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 全蝎-土鱉蟲抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞

如圖6所示，BMMs細(xì)胞加入M-CSF、RANKL誘導(dǎo)5 d后，大量的TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞在RANKL對照組出現(xiàn)。與RANKL對照組比較，全蝎-土鱉蟲組呈劑量相關(guān)性顯著降低TRAP染色陽性破骨細(xì)胞分化數(shù)量（＜0.01）。表明全蝎-土鱉蟲能夠抑制破骨細(xì)胞的形成。

與RANKL對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖8同

3.6 全蝎-土鱉蟲減少RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞NF-κB p65核定位

通過免疫熒光染色觀察NF-κB p65定位，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，NF-κB p65染成紅色。如圖7所示，空白組、1.000 mg/mL全蝎-土鱉蟲組NF-κB p65表達(dá)較弱，且主要分散在胞質(zhì)中，胞核呈空洞狀。RANKL對照組NF-κB p65表達(dá)增強(qiáng)，呈亮紅色分布于胞核中。全蝎-土鱉蟲能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)及核定位。

圖7 全蝎-土鱉蟲對破骨細(xì)胞形成NF-κB p65核定位的影響(免疫熒光, ×120)

3.7 全蝎-土鱉蟲抑制破骨細(xì)胞分化中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

RANKL為破骨細(xì)胞分化因子，RANKL刺激BMMs時(shí)間不同，BMMs向破骨細(xì)胞分化的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量不同。如圖8所示，1.000 mg/mL全蝎-土鱉蟲處理BMMs細(xì)胞后，加入RANKL分別刺激5、10、30、60 min，顯著降低了p-IκBα水平（＜0.01）；RANKL分別刺激5、10、20、30、60 min能顯著降低p-p65的表達(dá)（＜0.05、0.01）。表明全蝎-土鱉蟲能夠在不同時(shí)間點(diǎn)抑制破骨細(xì)胞分化NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

3.8 全蝎-土鱉蟲抑制CIA小鼠骨組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Micro-CT成像結(jié)果表明，CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)容易發(fā)生骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞。如圖9所示，與正常組比較，模型組骨組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，全蝎-土鱉蟲低、高劑量組p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢，且高劑量組p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

圖8 全蝎-土鱉蟲對破骨細(xì)胞分化NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖9 全蝎-土鱉蟲對CIA小鼠骨組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

RA屬中醫(yī)痹癥范疇，根據(jù)RA骨破壞的發(fā)展規(guī)律，其中醫(yī)主要病機(jī)可概括為外邪（風(fēng)、寒、濕為主）內(nèi)侵，襲踞經(jīng)隧，氣血為邪所阻，周流不暢，濕停為痰，血停為淤，痰瘀交阻，凝澀不通，痹阻經(jīng)絡(luò)，病延日久，邪入骨骸，蓄于骨節(jié)，膠著不去，骨節(jié)腫痛，結(jié)節(jié)畸形，甚則潰破，最終導(dǎo)致骨質(zhì)損傷，關(guān)節(jié)破壞。RA骨破壞患者常久痛多瘀，關(guān)節(jié)腫痛，功能障礙，纏綿不愈，多是病邪與瘀血凝聚骨節(jié)，膠結(jié)難解，常規(guī)草木之品，恒難湊效。須采用透骨搜絡(luò)、滌痰化瘀之品，可搜剔深入骨骱之痰瘀，以蠲腫痛，利關(guān)節(jié)，壯筋骨。蟲類善行，入藥搜剔穿透力雄，為開閉解結(jié)之良藥，能軟堅(jiān)除痰、破血消癥，治療頑痹具有殊效[11]。

全蝎具有息風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效，對于風(fēng)寒濕痹久治不愈，筋脈拘攣，甚則關(guān)節(jié)變形之頑痹，作用頗佳。土鱉蟲具有破血逐淤、消腫止痛、續(xù)筋接骨的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，全蝎具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用[12-13]，土鱉蟲具有促進(jìn)骨折愈合、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)的作用[14]。臨床上全蝎、土鱉蟲配伍相須為用，能開堅(jiān)結(jié)，祛瘀血，散頑風(fēng)，消凝痰，對于難治性風(fēng)濕入絡(luò)、痰瘀互結(jié)之RA關(guān)節(jié)屈伸不利，甚至畸形者作用較好。

骨是一種動(dòng)態(tài)組織，通過在破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的平衡來持續(xù)重塑以保持骨骼的完整性。正常生理?xiàng)l件下，破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成活動(dòng)受到嚴(yán)格控制[15]。RA表現(xiàn)為慢性炎癥，破壞了這種生理平衡，從而有利于骨吸收而不是骨形成。破骨細(xì)胞是唯一能進(jìn)行骨吸收的細(xì)胞類型，大量證據(jù)表明，在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了具有破骨細(xì)胞表型的多核細(xì)胞[16-17]。破骨細(xì)胞的分化主要是由核因子受體激活劑RANKL調(diào)控，RANKL誘導(dǎo)了一些與破骨細(xì)胞活化有關(guān)的基因編碼蛋白的表達(dá)，如組織蛋白酶-K、TRAP、破骨細(xì)胞相關(guān)Ig樣受體（osteoclast-associated immunoglobulin-like receptor，OSCAR）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）等[18]。RANKL與其在單核破骨前體細(xì)胞上的特定受體RANK的結(jié)合啟動(dòng)了一系列轉(zhuǎn)錄變化，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化[19-20]。

RANKL與RANK結(jié)合激活的NF-κB信號(hào)通路在破骨細(xì)胞形成中起著關(guān)鍵作用[21-22]。NF-κB信號(hào)通路廣泛存在于多種細(xì)胞過程中，包括各種免疫細(xì)胞的激活和分化過程、樹突狀細(xì)胞的成熟以及巨噬細(xì)胞的天然和獲得性免疫途徑[23]。NF-κB信號(hào)通路由NF-κB、IκB和IκB激酶（IκB kinase，IKK）組成。當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號(hào)刺激時(shí)可激活NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路，信號(hào)傳遞到IKK，IκB在IKK誘導(dǎo)下發(fā)生磷酸化而被降解，暴露NF-κB核轉(zhuǎn)移定位信號(hào)區(qū)域，NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路[24]。NF-κB信號(hào)通路是細(xì)胞因子與炎癥反應(yīng)之間的橋梁。RA是一種與炎癥相關(guān)的自身免疫性疾病，與NF-κB信號(hào)通路的過度激活密切相關(guān)[25]。本研究采用CIA小鼠模型及RANKL誘導(dǎo)的體外破骨細(xì)胞分化模型，確認(rèn)了全蝎-土鱉蟲藥對治療RA骨破壞的藥效。全蝎-土鱉蟲藥對在整體動(dòng)物水平上能顯著抑制CIA模型小鼠的骨破壞，減少關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)量，改善關(guān)節(jié)病理。體外能顯著抑制BMMs向破骨細(xì)胞的分化，并能降低破骨細(xì)胞分化的NF-κB p65、IκBα磷酸化水平，減少NF-κB p65的核定位，體內(nèi)結(jié)果表明全蝎-土鱉蟲高劑量組能顯著降低CIA小鼠骨組織中NF-κB p65磷酸化水平，表明全蝎-土鱉蟲藥對可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路，減少破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制RA骨破壞。

綜上，本研究針對全蝎-土鱉蟲藥對抑制RA骨破壞及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明，全蝎-土鱉蟲藥對作為臨床常用動(dòng)物藥藥對能夠抑制RA骨破壞，表現(xiàn)為調(diào)控過度激活的NF-κB信號(hào)通路中p65、IκBα磷酸化水平，抑制破骨細(xì)胞的分化，降低CIA小鼠骨組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。提示全蝎-土鱉蟲可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路降低RA骨破壞。本研究為全蝎-土鱉蟲藥對臨床治療RA特別是有RA骨破壞放射學(xué)進(jìn)展的患者，提供了組方遣藥選擇的理論依據(jù)，同時(shí)為該藥對進(jìn)一步開發(fā)成治療RA骨破壞的藥物提供了相關(guān)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Carmona-Rivera C, Carlucci P M, Moore E,. Synovial fibroblast-neutrophil interactions promote pathogenic adaptive immunity in rheumatoid arthritis [J]., 2017, 2(10): eaag3358.

[2] McInnes I B, Schett G. Pathogenetic insights from the treatment of rheumatoid arthritis [J]., 2017, 389(10086): 2328-2337.

[3] McDonald M M, Khoo W H, Ng P Y,. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption [J]., 2021, 184(5): 1330-1347.

[4] Auréal M, Machuca-Gayet I, Coury F. Rheumatoid arthritis in the view of osteoimmunology [J]., 2020, 11(1): 48.

[5] Bae S, Zeng S, Park-Min K H. Nuclear receptors in osteoclasts [J]., 2020, 53: 8-17.

[6] Chen Y G, Xu E J, Sang M,. Makatoxin-3, a thermostable Nav1.7 agonist fromKarsch (BmK) scorpion elicits non-narcotic analgesia in inflammatory pain models [J]., 2022, 288: 114998.

[7] Haleagrahara N, Miranda-Hernandez S, Alim M A,. Therapeutic effect of quercetin in collagen-induced arthritis [J]., 2017, 90: 38-46.

[8] 馬喆, 宋志敏, 韓雅馨, 等. 白芍總苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠長期給藥的組織分布研究[J]. 中草藥, 2023, 54(10): 3167-3178.

[9] 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M]. 第3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001: 1861.

[10] Wu T L, Li F, Sha X,. A novel recombinant RANKL vaccine prepared by incorporation of an unnatural amino acid into RANKL and its preventive effect in a murine model of collagen-induced arthritis [J]., 2018, 64: 326-332.

[11] 林良佳. 蟲類藥治療頑固性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效觀察 [J]. 新中醫(yī), 2016, 48(7): 117-119.

[12] 白潔, 江華, 李強(qiáng), 等. 蝎毒素對人T淋巴細(xì)胞系Jurkat E6-1細(xì)胞增殖的影響 [J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(12): 3112-3113.

[13] 徐龍生, 馮勤麗, 張小平, 等. 蜈蚣全蝎散鎮(zhèn)痛效應(yīng)及毒副作用實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2018, 16(3): 346-348.

[14] 劉丹, 李興暖, 秦仲君, 等. 土鱉蟲多肽的制備及免疫調(diào)節(jié)作用研究 [J]. 中藥材, 2012, 35(9): 1382-1385.

[15] Bolamperti S, Villa I, Rubinacci A. Bone remodeling: An operational process ensuring survival and bone mechanical competence [J]., 2022, 10(1): 48.

[16] Gan K, Xu L X, Feng X K,. Celastrol attenuates bone erosion in collagen-induced arthritis mice and inhibits osteoclast differentiation and function in RANKL-induced RAW264.7 [J]., 2015, 24(2): 239-246.

[17] Li Y Q, Yang C, Jia K X,. Fengshi Qutong Capsule ameliorates bone destruction of experimental rheumatoid arthritis by inhibiting osteoclastogenesis [J]., 2022, 282: 114602.

[18] Tanaka Y, Ohira T. Mechanisms and therapeutic targets for bone damage in rheumatoid arthritis, in particular the RANK-RANKL system [J]., 2018, 40: 110-119.

[19] Takayanagi H. RANKL as the master regulator of osteoclast differentiation [J]., 2021, 39(1): 13-18.

[20] 李平順, 王鋼, 周孟茹. 基于RANKL-RANK-OPG環(huán)路探討骨癆愈康丸改善肝腎虧虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨破壞機(jī)制研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(3): 1603-1607.

[21] Tsukasaki M, Takayanagi H. Osteoimmunology: Evolving concepts in bone-immune interactions in health and disease [J]., 2019, 19(10): 626-642.

[22] 章平衡, 劉健, 談冰, 等. 新風(fēng)膠囊通過降低NF-κB通路活性改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血瘀狀態(tài) [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2016, 31(11): 4684-4689.

[23] Liu S, Ma H X, Zhang H X,. Recent advances on signaling pathways and their inhibitors in rheumatoid arthritis [J]., 2021, 230: 108793.

[24] Hayden M S, Ghosh S. Shared principles in NF-κB signaling [J]., 2008, 132(3): 344-362.

[25] Sun S C. The non-canonical NF-κB pathway in immunity andinflammation [J]., 2017, 17(9): 545-558.

-drug pair inhibits NF-κB signaling pathway and alleviates bone destruction in collagen-induced arthritis mice

ZHAO Cheng-lei1, 2, HE Jing-jing1, WANG Xin-ying1, LU Man1, YANG Jie1, 2, CAO Peng1, 2, 3

1. Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 2. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 3. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the effect of Quanxie ()-Tubiechong () drug pair on alleviating joint bone destruction in collagen-induced arthritis (CIA) mice and nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway for osteoclast differentiation, and explore the mechanism therapy for treating rheumatoid arthritis.DBA/1J mice were randomly divided into normal group, model group,-low-and high-dose groups, and methotrexate group. Except for the normal group, the other groups were established with CIA models. The normal group and model group were treated with purified water, the other groups were treated with medication for four weeks. The swelling of toes of mice in each group was measured; Micro CT scanning method was used to reconstruct 3D images of mouse joints and analyze relevant bone parameters; HE staining was used to observe the pathological changes of the mouse ankle joint; Tartaric acid resistant acid phosphatase (TRAP) staining was used to detect the differentiation of osteoclast in joints.experimental study on the effect of-drug pair on receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) treated mice bone marrow derived macrophages induced osteoclast. Immunofluorescence staining was used to detect NF-κB p65 nuclear localization. Western blotting was used to detect the differentiation of osteoclast and NF-κB signaling pathway related protein expressions in bone tissue of CIA mice.Each administration group significantly reduced toe swelling in CIA model mice (< 0.05, 0.01); Compared with model group, Micro-CT 3D reconstruction results showed that-drug pair significantly inhibited bone destruction in CIA model mice, preserved bone structural integrity of mice, and significantly improved bone parameters (< 0.05, 0.01);-drug pair significantly reduced the number of TRAP positive cells in joints (< 0.01);-drug pair high-dose group significantly decreased NF-κB p65 phosphorylation level in bone tissue of CIA mice (< 0.01). The results ofexperiment showed that-drug pair significantly inhibited the differentiation of osteoclast and NF-κB p65 nuclear localization; Compared with RANKL control group, p65 and inhibitor of nuclear factor-κB alpha (IκBα) phosphorylation levels were significantly decreased in-drug pair group (< 0.05, 0.01).-drug pair can alleviate bone damage in CIA mice, which may be through inhibiting NF-κB signaling pathway activation and reducing the differentiation of osteoclast.

-drug pair; rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis mice; osteoclast; NF-κB signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5640 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.017

2023-04-01

江蘇省中醫(yī)藥科技發(fā)展專項(xiàng)（2020ZX16）；國家自然科學(xué)基面上項(xiàng)目（81773973）；南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（XZR2021037）

趙呈雷，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: zhaocl292 @163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]