基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究防風(fēng)中生物活性成分及對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

蔣 勇，鐘淑欣，何升華，梁家彬，張浩宇，葉裕豐，陳漢威

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究防風(fēng)中生物活性成分及對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

蔣 勇1, 2，鐘淑欣3，何升華4，梁家彬1, 2，張浩宇1, 2，葉裕豐2*，陳漢威2, 5*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 510006 2. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511486 3. 暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033 5. 廣州市番禺區(qū)健康管理中心，廣東 廣州 511495

通過以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)的策略研究防風(fēng)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的分子生物學(xué)機(jī)制。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集防風(fēng)活性成分和治療RA的潛在靶點(diǎn)，并評(píng)估活性成分的藥理和毒理學(xué)等相關(guān)參數(shù)；構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)，并通過生物信息學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證核心靶點(diǎn)和疾病的關(guān)聯(lián)；對(duì)核心成分和相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。體外通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞凋亡、qRT-PCR和Western blotting分析，闡明別歐前胡素對(duì)MH7A細(xì)胞磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路的調(diào)控作用。從防風(fēng)中共鑒定出18種活性成分和66個(gè)與篩選出的RA疾病靶基因相交的潛在靶基因，最終獲得了漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等核心成分。防風(fēng)治療RA的潛在機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、凋亡等信號(hào)通路和多種生物過程來實(shí)現(xiàn)，以發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。分子對(duì)接證實(shí)了所有的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有很好的對(duì)接活性。別歐前胡素抑制MH7A細(xì)胞的活力、遷移和侵襲（＜0.05、0.01），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（＜0.01），并顯著下調(diào)、、、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，）和的基因表達(dá)（＜0.01）。分子分析表明別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮對(duì)MH7A的調(diào)控作用。成功預(yù)測(cè)了防風(fēng)治療RA的有效成分和潛在靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探究其分子機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。揭示了別歐前胡素通過PI3K/Akt通路抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的活力、遷移、侵襲及細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

防風(fēng)；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；發(fā)病機(jī)制；別歐前胡素；漢黃芩素；5--甲基維斯阿米醇；成纖維樣滑膜細(xì)胞；PI3K/Akt信號(hào)通路

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性全身性自身免疫疾病，主要損害關(guān)節(jié)，以對(duì)稱性滑膜炎癥為特征。目前，RA的全球發(fā)病率為0.5%～1.0%，以女性為多見，其晚期形式的特點(diǎn)為嚴(yán)重且使人衰弱的慢性疼痛，管理不善會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致疾病進(jìn)展，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕、破壞和畸形[1]。迄今尚無有效的針對(duì)RA的治療方法，目前的西醫(yī)治療主要用于減少關(guān)節(jié)炎癥、防止不可逆的骨破壞和盡可能維持關(guān)節(jié)功能，但構(gòu)成高昂的財(cái)務(wù)成本并表現(xiàn)出嚴(yán)重的不良反應(yīng)[2]?；ぱ资荝A的病理基礎(chǔ)，而成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）是RA中具有免疫作用的核心靶細(xì)胞。在RA滑膜炎性環(huán)境中，F(xiàn)LSs發(fā)生凋亡異常，導(dǎo)致RA滑膜增生，聚積并黏附在骨和軟骨上加重關(guān)節(jié)破壞[3]。同樣，RA-FLSs“類腫瘤樣”異常增殖，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度活化，遷移、侵襲能力加強(qiáng)，產(chǎn)生大量的蛋白酶、細(xì)胞因子和黏附分子促使軟骨破壞，進(jìn)一步激活破骨細(xì)胞造成骨破壞，并且激活的FLSs還可以通過與鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生串?dāng)_來調(diào)節(jié)炎癥浸潤(rùn)的侵入，在關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞中也發(fā)揮重要作用[4-8]。

防風(fēng)(Turcz.) Schisch廣泛分布于東西伯利亞和北亞[9]。首載于秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，一般規(guī)定用防風(fēng)祛風(fēng)解表、祛濕止痛、定驚，與現(xiàn)代應(yīng)用大致相符，對(duì)普通感冒、頭痛、風(fēng)疹、瘙癢、破傷風(fēng)、風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)痛有明顯的治療作用[10-11]。防風(fēng)在當(dāng)前臨床實(shí)踐中被廣泛用于治療炎癥、疼痛和關(guān)節(jié)炎等[12]。防風(fēng)含有100多種化學(xué)成分，主要有色原酮類、香豆素類、多糖類、聚乙炔等，這些活性成分有解熱、抗炎鎮(zhèn)痛、抗增殖、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[13-15]?；谙到y(tǒng)生物學(xué)與藥理學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，是評(píng)價(jià)藥物的代謝和有效性特征，分析藥物治療疾病的具體途徑，揭示藥物作用的分子機(jī)制的強(qiáng)有力方法[16-17]。分子對(duì)接技術(shù)可以評(píng)估分析藥物與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合的活性和機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步藥物篩選和研發(fā)提供一些見解[18]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、微陣列數(shù)據(jù)分析和分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)地鑒定防風(fēng)活性成分的有效靶蛋白，探索防風(fēng)治療RA的分子機(jī)制，篩選出防風(fēng)治療RA的活性成分和重要信號(hào)通路，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人RA成纖維樣滑膜細(xì)胞系MH7A購(gòu)自吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

別歐前胡素（批號(hào)D21091501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號(hào)031825）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑LY294002（批號(hào)134167）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX，批號(hào)02211101）購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司；Matrigel膠（批號(hào)2082001）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胎牛血清（批號(hào)SA220629）、胰蛋白酶溶液（批號(hào)WH0622G111）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8123020）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)2321131）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)VB816）購(gòu)自日本DOJINDO公司；總RNA提取試劑盒（批號(hào)343904）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)H0104731）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑盒（批號(hào)027E2232EB）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20220610）、全蛋白提取試劑盒（批號(hào)20221009）、BCA測(cè)定試劑盒（批號(hào)20220427）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)溶液（批號(hào)2127701）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；特大B細(xì)胞淋巴瘤（B-cell lymphoma-extra-large，Bcl-xL）抗體（批號(hào)F1741）購(gòu)自英國(guó)EterLife公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)GR151406-19）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)GR46472-1）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PI3K抗體（批號(hào)CJ36131）、p-PI3K抗體（批號(hào)AA10171）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)CN13211）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）p-Akt抗體（批號(hào)AA44161）、抗體（批號(hào)1201908）、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號(hào)AA102109）購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。

1.3 儀器

5804R型冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；371型CO2培養(yǎng)箱、1300 series A2型生物安全柜、Variskan LUX microplate reader多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；DMI1型倒置光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；LightCycler480 II Real-time PCR系統(tǒng)（瑞士Roche公司）；CytoFLEX Flow Cytometer流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；PowerPac HC型垂直電泳/轉(zhuǎn)膜套裝、Bio-Rad Gel-Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 防風(fēng)中的有效成分和靶點(diǎn) 在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、YaTCM（http://cadd. pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）和TCMIP（http://www.tcmip.cn/TCMIP）4個(gè)中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和收集防風(fēng)的化學(xué)成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（符合這一標(biāo)準(zhǔn)的化合物具有更高的類藥物特性）對(duì)防風(fēng)的成分進(jìn)行篩選[19]，同時(shí)通過文獻(xiàn)檢索進(jìn)行補(bǔ)充，獲得最終候選目標(biāo)活性成分。然后，搜集TCMSP中預(yù)測(cè)的與這些活性分子相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。所有活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)均來自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）。

2.1.2 藥理和毒理參數(shù)評(píng)估 通過參考里賓斯基“五規(guī)則”（rule of 5，RO5），評(píng)估活性成分的“類藥物”特性，符合該規(guī)則的化合物有更好的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)和更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物?；衔锒拘缘念A(yù)測(cè)是藥物設(shè)計(jì)開發(fā)過程的關(guān)鍵部分之一。ProTox-II網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（https://tox-new.charite.de/protox_II）用于預(yù)測(cè)獲得的活性成分的毒理學(xué)參數(shù)，包括毒理學(xué)終點(diǎn)（免疫毒性、致突變性和致癌性）、器官毒性（肝毒性）和急性口服毒性（median lethal dose，LD50）。活性成分的合成可及性得分（synthetic accessibility score，SAscore）通過ADMETlab 2.0（https://admetmesh.scbdd.com）計(jì)算，SAscore旨在計(jì)算類藥物分子的合成難度，SAscore＜6表示容易合成，否則難以合成。

2.1.3 防風(fēng)-RA潛在靶基因 為確保數(shù)據(jù)的全面性與準(zhǔn)確性，從GeneCard（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/search/advanced/geneMap）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/search）、DRUGBANK（https://go.drugbank.com）4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中收集RA相關(guān)的靶點(diǎn)。其中DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)基于臨床試驗(yàn)藥物證據(jù)構(gòu)建而成，包含豐富的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶標(biāo)信息，GeneCard、OMIM、DisGeNET 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)基于現(xiàn)有文獻(xiàn)構(gòu)建，各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)之間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。將上述4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的靶基因，刪除重復(fù)項(xiàng)后合并。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// www.uniprot.org）將藥物成分和疾病的目標(biāo)統(tǒng)一規(guī)范為標(biāo)準(zhǔn)“Gene Symbol”，通過VENNY 2.1網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取防風(fēng)治療RA的潛在靶基因（即共存靶基因）。

通過收集基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)集（GSE93272和GSE97779）的對(duì)照組和RA組中差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），分析與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的防風(fēng)靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。此外，通過Panther分類系統(tǒng)（http://pantherdb.org）進(jìn)行潛在靶基因的功能分類。

2.1.4 防風(fēng)-RA潛在靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 通過將獲取的防風(fēng)-RA潛在靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org）并選擇生物體為“Homo sapiens”，設(shè)置靶基因交互得分的置信度為0.40，以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)來呈現(xiàn)潛在靶基因之間互作的直接與間接調(diào)控關(guān)系。PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)，即潛在靶基因相互之間共同功能的關(guān)聯(lián)。將這些結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行包含拓?fù)鋮?shù)的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將防風(fēng)-RA共同靶基因?qū)隦（https://www.r-project.org）軟件，利用“Cluster Profiler”包進(jìn)行生物信息富集分析，包括GO功能和KEGG信號(hào)通路分析。＜0.05為顯著富集，結(jié)果用R軟件繪制氣泡圖和條形圖來直觀地顯示。R包“pathview”和“GOplot”分別用于將KEGG數(shù)據(jù)映射到RA相關(guān)的信號(hào)通路圖上并顯示出來和繪制Chord plot將靶基因映射到GO或KEGG條目來反應(yīng)歸屬關(guān)系。

2.1.6 靶點(diǎn)-器官定位網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 防風(fēng)體內(nèi)代謝過程尚未明確，防風(fēng)誘導(dǎo)的RA治療作用可能涉及多個(gè)器官和組織。通過使用BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// biogps.org）獲得每個(gè)防風(fēng)-RA靶點(diǎn)在器官組織水平的mRNA表達(dá)譜。分別計(jì)算每個(gè)mRNA在每個(gè)組織或器官中的平均值和在所有組織器官中的總體平均值，提取mRNA表達(dá)值高于總體值的相關(guān)組織器官。使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建靶點(diǎn)-器官定位網(wǎng)絡(luò)。

2.1.7 “成分-潛在靶基因-信號(hào)通路（ingredients-potential target genes-signaling pathways，IPS）”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建IPS網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)代表活性化合物、靶基因或信號(hào)通路，線條則代表活性化合物、靶基因和信號(hào)通路三者之間的相互作用。利用Cytoscape 3.7.1中內(nèi)置的“Network Analyzer”功能分析活性成分和靶基因的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度、緊密度等，并據(jù)此鑒定核心靶基因和化合物。

2.1.8 核心成分和核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 對(duì)IPS核心網(wǎng)絡(luò)（Hithubs Network）中得到的核心成分和靶基因按照化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的組合關(guān)系進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。首先從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的SDF格式文件并利用Chem 3D軟件進(jìn)行能量最小化計(jì)算后轉(zhuǎn)換為MOL2格式文件。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org）下載分辨率低于0.2 nm（優(yōu)先選擇分辨率值更小且有小分子復(fù)合的結(jié)構(gòu)）的靶蛋白的PDB結(jié)構(gòu)文件，并使用AutoDock Tools1.5.7軟件進(jìn)行去雜原子、氫化、計(jì)算電荷等加工。運(yùn)行AutoDock Vina 1.2.3進(jìn)行分子對(duì)接，以對(duì)接評(píng)分Affinity＜?20.929 3 kJ/mol表明具有較強(qiáng)的結(jié)合活性[20]。最后，通過CB-Dock網(wǎng)站（http://clab. labshare.cn/cb-dock）將結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 MH7A細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72小時(shí)傳代1次（細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞）。MH7A細(xì)胞以1×105/mL接種于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，給予TNF-α（10 ng/mL），別歐前胡素（20、40、60 μmol/L），MTX（20 μmol/L）或LY294002（20 μmol/L）干預(yù)24 h或48 h。

2.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 MH7A細(xì)胞分別給予別歐前胡素（20、40、60、80、120、160 μmol/L）處理24、48 h，然后用CCK-8試劑孵育3 h，酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.2.3 劃痕愈合測(cè)定 細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，用藥物預(yù)處理24 h，再使用移液管尖端制造傷口，記作0 h，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別在0、24、48 h進(jìn)行拍照，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

2.2.4 遷移和侵襲測(cè)定 細(xì)胞用藥物預(yù)處理12 h后轉(zhuǎn)移至Transwell小室，24 h（遷移）或48 h后（侵襲，Matrigel膠包被）對(duì)小室進(jìn)行固定、染色、拍照并計(jì)數(shù)。

2.2.5 qRT-PCR檢測(cè)、、、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，）和基因表達(dá) 按照試劑盒說明書提取細(xì)胞中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) IL-1βF: CAGGCTGCTCTGGGATTCTC R: GTCCTGGAAGGAGCACTTCAT IL-6F: CCTGAACCTTCCAAAGATGGC R: TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA IL-8F: GAAGTTTTTGAAGAGGGCTGAGA R: GCCCTTGGCCTCAATTTTGC MMP-1F: ATGAAGCAGCCCAGATGTGGAG R: TGGTCCACATCTGCTCTTGGCA MMP-3F: TGGACAAAGGATACAACAGGGAC R: ATCTTGAGACAGGCGGAACC GAPDHF: TCGGAGTCAACGGATTTGGT R: TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC

2.2.6 細(xì)胞凋亡測(cè)定 收集藥物干預(yù)48 h后的細(xì)胞，PBS洗滌3次，在細(xì)胞緩沖液中依次加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）孵育5～10 min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.2.7 Western blotting檢測(cè)PI3K/Akt通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 使用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入p-Akt（1∶750）、Akt（1∶750）、p-PI3K（1∶750）、PI3K（1∶750）、Bax（1∶5000）、cleaved Caspase-3（1∶500）、Bcl-xL（1∶1000）和GAPDH（1∶5000）抗體，4 ℃孵育過夜。然后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)溶液后，使用Bio-Rad Gel-Doc XR+可視化蛋白條帶。使用Image Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 防風(fēng)活性成分的藥理學(xué)性質(zhì)和靶基因 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)對(duì)防風(fēng)檢索出的成分進(jìn)行篩選并結(jié)合文獻(xiàn)檢索，最終獲得19種活性成分。其中升麻素苷（Hacc＞10），其余18種活性成分符合“RO5”（MW＜500、Hdon＜5、Hacc＜10、?2＜log＜5、RBN＜10）。這些活性成分的相關(guān)藥理參數(shù)見表2。通過檢索HERB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://herb.ac.cn/）分析它們?cè)谥兴幹蟹植记闆r。結(jié)果表明，它們?cè)诜里L(fēng)中具有高度特異性。11-羥基-亥茅酚苷_qt、divaricatacid和珊瑚菜內(nèi)酯僅存在于防風(fēng)中，防風(fēng)色酮醇和divaricatol存在于包括防風(fēng)在內(nèi)的2種中藥中，川白芷內(nèi)酯和別歐前胡素則是3種。防風(fēng)的所有活性成分均未表現(xiàn)出肝毒性，亞油酸乙酯和11,14-二十碳二烯酸甲酯的LD50值最高（圖1）。SAscore評(píng)估表明所有成分都是容易合成的。上述結(jié)果表明，篩選出的這些防風(fēng)活性成分具有很高的“類藥物”藥理學(xué)性質(zhì)。在TCMSP收集到防風(fēng)18種活性成分的218個(gè)靶蛋白，經(jīng)去重和驗(yàn)證后得到80個(gè)靶蛋白。

表2 防風(fēng)生物活性成分的藥理學(xué)和分子性質(zhì)

Table2 Pharmacological and molecular properties of bioactive components in S. divaricata

活性成分MWAlogPHdonHaccOB/%DLCaco-2BBBTPSARBNSAscore 黃花菜木脂素A386.382.492868.830.660.21?0.53107.5943.448 11-羥基-亥茅酚苷_qt292.310.883650.240.27?0.27?1.23100.1313.502 川白芷內(nèi)酯426.465.050759.650.660.56?0.0292.0463.932 divaricatacid320.321.342787.000.32?0.18?1.05106.2033.436 divaricatol334.351.252731.650.38?0.13?1.09106.2033.505 歐前胡素270.303.650434.550.221.130.9252.5832.782 防風(fēng)色酮醇374.422.802732.050.510.07?0.81106.2043.718 珊瑚菜內(nèi)酯300.333.640543.390.280.900.4361.8142.815 5-O-甲基維斯阿米醇290.342.021537.990.250.54?0.1068.9023.466 珊瑚菜素300.333.640540.190.280.980.4861.8142.815 3-表-β-谷甾醇414.798.081136.910.751.320.8720.2364.388 漢黃芩素284.282.592530.680.230.790.0479.9022.288 β-谷甾醇414.798.081136.910.751.320.9920.2364.388 亞油酸乙酯308.566.990242.000.191.461.1426.30162.305 異歐前胡素270.303.650445.460.230.970.6652.5832.674 別歐前胡素270.303.791436.310.220.910.5063.5822.982 11,14-二十碳二烯酸甲酯322.597.550239.670.231.471.1026.30172.322 紫花前胡素328.393.960539.270.380.770.2565.7433.359

MW-相對(duì)分子質(zhì)量 Alog-辛醇/水分配系數(shù)的對(duì)數(shù) Hdon-氫鍵供體 Hacc-氫鍵受體 Caco-2-腸上皮通透性 BBB-血腦屏障 TPSA-拓?fù)錁O性表面積 RBN-化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的個(gè)數(shù)

MW-molecular weight Alog-log of octanol/water partition coefficient Hdon-hydrogen bond donors Hacc-hydrogen bond acceptors Caco-2-intestinal epithelial permeability BBB-blood-brain barrier TPSA-topological polar surface area RBN-rotation bonds number

圖1 防風(fēng)生物活性成分的毒理學(xué)參數(shù)

3.1.2 防風(fēng)治療RA的潛在靶基因及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 選取GeneCard、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中評(píng)分大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，合并DRUGBANK、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的靶點(diǎn)，去重得到5769個(gè)RA相關(guān)靶基因。利用VENNY 2.1工具將防風(fēng)活性成分靶基因和RA靶基因取交集，得到66個(gè)潛在靶基因（圖2-A）。將該66個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)來呈現(xiàn)靶點(diǎn)間相互作用的調(diào)控關(guān)系（圖2-B）。將這些結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建了66個(gè)節(jié)點(diǎn)、547條邊的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2-C），平均節(jié)點(diǎn)連接度為16.6。排名前12的關(guān)鍵靶點(diǎn)見圖2-D，18種活性成分靶向RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)量見圖2-E。

3.1.3 與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的防風(fēng)靶點(diǎn)的功能分類 FLSs功能障礙（如異常增殖、凋亡）導(dǎo)致滑膜增生，與免疫系統(tǒng)細(xì)胞相互作用從而產(chǎn)生一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而持續(xù)的滑膜炎癥是RA進(jìn)展的主要原因[2]。通過Panther分類系統(tǒng)，對(duì)66個(gè)防風(fēng)-RA靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分類。與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的66個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)根據(jù)其細(xì)胞功能分為10個(gè)不同的類別，其中蛋白質(zhì)修飾酶、跨膜信號(hào)受體和基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是最豐富的類別（圖3-A）。涉及蛋白質(zhì)修飾酶的15個(gè)潛在防風(fēng)靶點(diǎn)形成了1個(gè)具有13個(gè)節(jié)點(diǎn)和35個(gè)邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3-B），其中AKT1和CASP3是關(guān)鍵靶點(diǎn)。由酶活性介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾在調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和功能方面起著至關(guān)重要的作用，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞增殖和凋亡等[21]。在蛋白質(zhì)修飾酶中（圖3-C），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與磷酸酶共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡過程關(guān)鍵元件的磷酸化狀態(tài)。CASP3、CASP8、CASP9則屬于Caspase家族蛋白酶，其在細(xì)胞程序性死亡中起關(guān)鍵作用。根據(jù)相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)量提出了可能的RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白質(zhì)修飾酶調(diào)節(jié)因子（圖3-D）。這些發(fā)現(xiàn)表明防風(fēng)活性成分對(duì)RA的治療靶點(diǎn)與多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)功能密切相關(guān)。

A-Venn圖 B、C-PPI網(wǎng)絡(luò) D-排名前12的關(guān)鍵靶點(diǎn) E-防風(fēng)中18種活性成分靶向RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)量

3.1.4 防風(fēng)生物活性成分治療RA的潛在協(xié)同機(jī)制 GO分析結(jié)果顯示66個(gè)靶基因在1081個(gè)GO生物過程（biological process，BP）條目中顯著富集，基于調(diào)整后值排序的前20個(gè)富集項(xiàng)繪制的條形-氣泡圖如圖4-A所示。主要豐富的BP條目是對(duì)激素的反應(yīng)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)等。前8個(gè)BP條目的數(shù)據(jù)導(dǎo)入R包“GOplot”繪制“GOChord plot”來直觀地映射“條目”與“基因”的歸屬關(guān)系（圖4-B）。RA在女性中患病率較高，大量的研究表明激素與RA的發(fā)病和臨床表現(xiàn)密切相關(guān)[22]。27個(gè)RA相關(guān)的防風(fēng)目標(biāo)密切參與對(duì)激素的反應(yīng)并形成1個(gè)包含25個(gè)節(jié)點(diǎn)和173個(gè)邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-C）。其中有9個(gè)是關(guān)鍵靶點(diǎn)，在這個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用（即圖4-C內(nèi)一圈）。FLSs凋亡異常導(dǎo)致的持續(xù)滑膜炎癥在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要的意義。19個(gè)防風(fēng)目標(biāo)參與細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)，并形成1個(gè)具有18個(gè)節(jié)點(diǎn)和112個(gè)邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-D）。表明防風(fēng)的有效成分通過多種BP起到治療RA的協(xié)同作用。

同樣，KEGG富集分析結(jié)果顯示66個(gè)靶基因在215個(gè)信號(hào)通路中顯著富集。基于調(diào)整后值排序的前20個(gè)KEGG富集項(xiàng)如圖4-E所示。KEGG通路主要涉及對(duì)PI3K/Akt、IL-17和凋亡等信號(hào)通路。對(duì)按照“基因計(jì)數(shù)”排序的前10個(gè)KEGG條目繪制KEGG“Chord plot”來映射項(xiàng)目與基因歸屬關(guān)系（圖4-F）。PI3K/Akt和IL-17信號(hào)通路是最顯著富集的通路，19個(gè)SD靶點(diǎn)參與PI3K/Akt信號(hào)通路，形成1個(gè)包含19個(gè)節(jié)點(diǎn)和94條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4-G）。這些結(jié)果表明，防風(fēng)活性成分對(duì)RA的多種協(xié)同作用涉及多個(gè)靶點(diǎn)和多種途徑。此外，防風(fēng)治療RA潛在靶基因的PI3K/Akt和IL-17信號(hào)通路分別如圖5所示（紅色矩形代表潛在的靶基因）。

A-BP分析的前20個(gè)富集項(xiàng)的條形-氣泡圖，按調(diào)整后的值排序 B-BP分析中主要8項(xiàng)富集弦圖 C、D-參與激素響應(yīng)（GO：0009725）和細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)（GO：0010942）防風(fēng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) E-KEGG分析的前20個(gè)富集途徑的條形-氣泡圖，按調(diào)整后的值排序 F-KEGG分析前10項(xiàng)富集途徑的弦圖，按潛在靶基因的基因數(shù)排序 G-參與PI3K/Akt信號(hào)通路的防風(fēng)靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)（hsa04151）

A-bar-bubble plot of top 20 enriched terms of BP analysis, sorted by adjustedvalue B-GO chord plot of primary enriched 8 terms of BP analysis C, D-PPI network of targets ofinvolved in response to hormone (GO: 0009725) and positive regulation of cell death (GO: 0010942) E-bar-bubble plot of top 20 enriched pathways of KEGG analysis, sorted by adjustedvalue F-KEGG chord plot of top 10 enriched pathways of KEGG analysis sorted by gene count for potential target genes G-PPI network of targets ofinvolved in PI3K/Akt signaling pathway (hsa04151)

圖4 防風(fēng)治療RA靶點(diǎn)的GOBP和KEGG途徑富集分析

Fig. 4 GO BP and KEGG pathway enrichment analysis of targets ofagainst RA

3.1.5 IPS網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 根據(jù)獲得的KEGG通路富集分析結(jié)果，運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建IPS網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地解釋防風(fēng)對(duì)RA的作用機(jī)制，并通過內(nèi)置工具分析防風(fēng)靶點(diǎn)。如圖6-A所示，該網(wǎng)絡(luò)由104個(gè)節(jié)點(diǎn)和366條邊構(gòu)成，橙色節(jié)點(diǎn)代表防風(fēng)活性成分（六邊形），綠色節(jié)點(diǎn)代表KEGG分析得到的前20條信號(hào)通路（正方形），紅色節(jié)點(diǎn)代表防風(fēng)和RA（橢圓）的共同靶基因。在Cytoscape中將拓?fù)鋮?shù)高于IPS網(wǎng)絡(luò)平均連接度、介度和緊密度的節(jié)點(diǎn)提取出來，得到Hithubs Network（核心網(wǎng)絡(luò)，圖6-B），這些節(jié)點(diǎn)是防風(fēng)治療RA的核心靶點(diǎn)、核心成分和重要的信號(hào)通路。涉及的主要信號(hào)通路是PI3K/Akt和IL-17，核心靶點(diǎn)是前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase2，PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）和AKT1等，核心成分則包括漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等。

3.1.6 靶點(diǎn)-器官定位網(wǎng)絡(luò)分析 評(píng)估66個(gè)防風(fēng)-RA靶點(diǎn)的mRNA水平，所有靶蛋白的mRNA水平在BioGPS中均可用。其中有64個(gè)靶蛋白在21個(gè)與RA相關(guān)免疫器官中mRNA表達(dá)水平升高，包括滑膜（29個(gè)靶點(diǎn)）、脾臟（26個(gè)靶點(diǎn)）、淋巴結(jié)（25個(gè)靶點(diǎn)）、腎上腺皮質(zhì)（28個(gè)靶點(diǎn)）、骨髓（28個(gè)靶點(diǎn)）、腎皮質(zhì)（19個(gè)靶點(diǎn)）、腎髓質(zhì)（19個(gè)靶點(diǎn)）、淋巴細(xì)胞（30個(gè)靶點(diǎn)）、漿細(xì)胞（25個(gè)靶點(diǎn)）等。構(gòu)建的靶點(diǎn)-器官定位網(wǎng)絡(luò)，包含85個(gè)節(jié)點(diǎn)和549條邊（圖7）。大多數(shù)靶標(biāo)在多個(gè)器官和組織中高表達(dá)，表明這些器官與防風(fēng)的靶標(biāo)密切相關(guān)。此外，21個(gè)器官與免疫密切相關(guān)，表明防風(fēng)對(duì)RA的治療作用可能涉及全身免疫的激活。

圖6 IPS網(wǎng)絡(luò)(A) 與核心網(wǎng)絡(luò)(B) 構(gòu)建與分析

3.1.7 與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的防風(fēng)靶點(diǎn)的GEO數(shù)據(jù)集分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取感興趣的GEO數(shù)據(jù)集，分析了GSE93272數(shù)據(jù)集健康對(duì)照組和RA組中與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的SD靶點(diǎn)的歸一化表達(dá)值。該數(shù)據(jù)集收集了大樣本RA患者和健康對(duì)照的全血基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)，可用于分析鑒定不同人群基因的差異表達(dá)。結(jié)果表明，66個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)中的38個(gè)存在差異表達(dá)，其中有10個(gè)在RA組中顯著上調(diào)，其余28個(gè)顯著下調(diào)。其中腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、CASP3、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、PTGS2和G1/S期特異細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）是關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖8-A）；維生素A與絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、RELA、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、熱休克蛋白αB1（heat shock protein 90 kDa alpha family class B member 1，HSP90AB1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）和二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）屬于IPS中的核心靶點(diǎn)（圖8-B）。以上結(jié)果表明，這些防風(fēng)靶標(biāo)與RA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

箭頭節(jié)點(diǎn)代表器官，菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)明暗和大小與其連接度相關(guān)

3.1.8 巨噬細(xì)胞病理學(xué)相關(guān)的防風(fēng)靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析 滑膜炎是RA的病理基礎(chǔ)，滑膜巨噬細(xì)胞和FLSs是RA的核心靶細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致骨骼和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[4]。巨噬細(xì)胞與炎癥微環(huán)境相互作用以參與RA炎癥的發(fā)展。當(dāng)被激活時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子、代謝物和其他參與RA過程的因子[23]。同樣地，通過分析GSE97779數(shù)據(jù)集中滑膜巨噬細(xì)胞在健康對(duì)照組和RA組的DEGs，發(fā)現(xiàn)66個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)中的26個(gè)是差異表達(dá)的，包括RA中上調(diào)的18個(gè)基因和8個(gè)下調(diào)的基因（圖9-A）。這26個(gè)DEGs的表達(dá)式模式的熱圖見圖9-B。25個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)參與巨噬細(xì)胞病理學(xué)，形成1個(gè)包含25個(gè)節(jié)點(diǎn)和105條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中TNF、IL6、CASP3、CCND1、MAPK14、纖連蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）、PTGS2和RELA是發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖9-C）。為了進(jìn)一步分析這些參與巨噬細(xì)胞病理學(xué)的目標(biāo)，進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析以進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。主要在靶標(biāo)中富集的GO BP條目包括對(duì)激素的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)等（圖9-D）。在KEGG通路分析中，這26個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)在IL-17、PI3K/Akt、RA和凋亡等信號(hào)通路高度富集。上述結(jié)果表明，這些防風(fēng)靶點(diǎn)與巨噬細(xì)胞病理學(xué)密切相關(guān)，在RA發(fā)病機(jī)制的相關(guān)病理過程中發(fā)揮著重要的作用。

A-PPI網(wǎng)絡(luò)中防風(fēng)治療RA關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá) B-IPS網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)表達(dá)

A-DEGs和防風(fēng)治療RA的共同靶點(diǎn)，每個(gè)氣泡點(diǎn)的大小表示相應(yīng)的P值 B-26個(gè)DEGs的表達(dá)模式熱圖 C-參與巨噬細(xì)胞病理學(xué)的25個(gè)防風(fēng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) D-巨噬細(xì)胞病理學(xué)相關(guān)靶標(biāo)的GO BP和KEGG通路富集分析，BP和KEGG分析的前20個(gè)富集項(xiàng)的氣泡圖，按?lgP排序

3.1.9 通過分子對(duì)接檢測(cè)核心成分與核心靶標(biāo)之間的結(jié)合能力 在IPS核心網(wǎng)絡(luò)中共有8個(gè)活性成分和10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，最終得到40組配體-受體對(duì)接結(jié)果。基于親和力分?jǐn)?shù)的對(duì)接結(jié)果見圖10，所有對(duì)接組合的結(jié)合能均小于?20.929 3 kJ/mol，其中得分最低的是漢黃芩素-AKT1對(duì)接組合，得分為?26.370 9 kJ/mol，最高的是紫花前胡素-PTGS2對(duì)接組合，得分為?47.300 1 kJ/mol。配體-受體結(jié)合構(gòu)象結(jié)合能越低，表明構(gòu)象越穩(wěn)定，則互作的可能性也越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示所有對(duì)接組合均具有較強(qiáng)的對(duì)接活性，表明這些核心活性成分可能通過核心靶點(diǎn)在RA的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)接分?jǐn)?shù)排名前5的分子對(duì)接三維視圖如圖11所示。

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 別歐前胡素抑制細(xì)胞活力、遷移和侵襲及細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 在Hithubs Network中排名前4的核心成分是漢黃芩素（26）、β-谷甾醇（567）、5--甲基維斯阿米醇（11）和別歐前胡素（3），前3個(gè)并不是防風(fēng)的特異性成分，因此選擇僅在3種（括號(hào)中數(shù)字）中藥中分布的別歐前胡素作進(jìn)一步的深入驗(yàn)證機(jī)制研究。

圖10 防風(fēng)的8個(gè)核心成分與10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接得分

如圖12-A所示，在MH7A細(xì)胞中干預(yù)24 h后，別歐前胡素（60、80、120、160 μmol/L）和MTX（20 μmol/L）明顯抑制細(xì)胞活力（＜0.05、0.01）；在處理48 h后，別歐前胡素（80、120、160 μmol/L）和MTX（20 μmol/L）明顯抑制細(xì)胞活力（＜0.01）。在MH7A細(xì)胞中選擇濃度為20、40、60 μmol/L的別歐前胡素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。別歐前胡素和MTX顯著抑制MH7A細(xì)胞的遷移和侵襲（＜0.05、0.01，圖12-B）；別歐前胡素和MTX均顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中、、、和的mRNA表達(dá)水平（＜0.01，圖12-C）；別歐前胡素（40、60 μmol/L）和MTX顯著誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01，圖12-D）。

圖11 按對(duì)接分?jǐn)?shù)排序的前5種分子對(duì)接組合的3D視圖

A-別歐前胡素和MTX作用24、48 h對(duì)細(xì)胞活力的影響 B-別歐前胡素和MTX對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響 C-別歐前胡素和MTX對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響 D-別歐前胡素和MTX對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與TNF-α組比較：##＜0.01；與MTX組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

A-effects of prangenidin and MTX for 24 and 48 h on cell viability B-effects of prangenidin and MTX on cell migration and invasion C-effects of prangenidin and MTX on inflammatory factors gene expressions in TNF-α-induced cells D-effects of prangenidin and MTX on cell apoptosis*< 0.05**< 0.01control group;##< 0.01TNF-α group;▲< 0.05▲▲< 0.01MTX group

圖12 別歐前胡素對(duì)MH7A細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

Fig. 12 Effect of prangenidin on biological behavior of MH7A cells

3.2.2 別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路對(duì)MH7A細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果表明別歐前胡素治療RA的機(jī)制與PI3K/Akt通路和細(xì)胞死亡的調(diào)控生物過程相關(guān)，潛在靶基因包括Bax、Bcl-2等與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。為了闡明別歐前胡素改善RA的機(jī)制，采用Western blotting分析相關(guān)蛋白表達(dá)。TNF-α（10 ng/mL）誘導(dǎo)后p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt值顯著升高（＜0.01，圖13-A），別歐前胡素（40 μmol/L）作用后顯著降低了p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt值（＜0.01）。然后，使用PI3K抑制劑LY294002檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子和MMPs表達(dá)的調(diào)控作用，并檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。LY294002（20 μmol/L）顯著抑制MH7A細(xì)胞遷移和侵襲（＜0.01，圖13-B），并顯著降低TNF-α（10 ng/mL）誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中、、、和的mRNA表達(dá)水平（＜0.01，圖13-C）。別歐前胡素（40 μmol/L）和LY294002（20 μmol/L）顯著誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01，圖13-D），下調(diào)Bcl-xL并上調(diào)Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)（＜0.01，圖13-E）。

A-別歐前胡素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 B-LY294002對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響 C-LY294002對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響 D-別歐前胡素和LY294002對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 E-別歐前胡素和LY294002對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與TNF-α組比較：##＜0.01；與LY294002組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

A-effect of prangenidin on PI3K/Akt pathway related protein expressions in TNF-α-induced cells B-effect of LY294002 on cell migration and invasion C-effect of LY294002 on inflammatory factors gene expressions in TNF-α-induced cells D-effects of prangenidin and LY294002 on cell apoptosis E-effects of prangenidin and LY294002 on apoptosis related protein expressions in cells*< 0.05**< 0.01control group;##< 0.01TNF-α group;▲< 0.05▲▲< 0.01LY294002 group

圖13 別歐前胡素對(duì)MH7A細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響

Fig. 13 Effect of prangenidin on PI3K/Akt pathway in MH7A cells

4 討論

本研究系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了防風(fēng)生物活性成分的藥理、毒理和分子特性，加深了對(duì)這些防風(fēng)活性成分的認(rèn)識(shí)。對(duì)防風(fēng)-RA共存靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分類、BioGPS靶點(diǎn)-器官定位分析，還使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中人類高通量組學(xué)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了與RA致病機(jī)制相關(guān)的防風(fēng)靶點(diǎn)，并對(duì)別歐前胡素進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過建立和篩選IPS網(wǎng)絡(luò)得到核心成分漢黃芩素、β-谷甾醇、5--甲基維斯阿米醇和別歐前胡素等，核心靶點(diǎn)PTGS2、RELA、AKT1等。Khan等[24]研究顯示漢黃芩素可以有效抑制IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、一氧化氮和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）炎癥介質(zhì)的表達(dá)和產(chǎn)生，通過激活相應(yīng)信號(hào)通路發(fā)揮確切的抗炎和軟骨保護(hù)作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明漢黃芩素通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠RA癥狀，并呈劑量相關(guān)性地改善抗氧化蛋白、氧化應(yīng)激標(biāo)志物和炎性細(xì)胞因子水平的變化[25]。一項(xiàng)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的研究表明，β-谷甾醇處理后，一些趨化因子和促炎因子釋放減少，抗炎因子IL-10水平增加，并且提高了蛋白酪氨酸磷酸酶1（protein phosphoserine phosphatase-1，SHP-1）活性，抑制了信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。其他研究表明，β-谷甾醇通過抑制NF-κB和激活血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路對(duì)CIA大鼠起到抗關(guān)節(jié)炎作用，β-谷甾醇可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，抑制M1極化，增強(qiáng)M2極化從而減少促炎因子和增加抗炎因子釋放[27-28]。大量研究表明漢黃芩素、5--甲基維斯阿米醇等色原酮類化合物在各種動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中抑制炎性細(xì)胞因子釋放和炎癥相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[29-30]。以上研究充分說明防風(fēng)活性成分在RA的治療中有很好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。此外，既往大量文獻(xiàn)研究表明這些核心靶點(diǎn)在RA的治療和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[31-33]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)可以看出66個(gè)靶點(diǎn)間并非相互獨(dú)立，而是呈現(xiàn)相互作用的交互關(guān)系[34]。在成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，很多靶基因可以被防風(fēng)的多種活性成分調(diào)控，這體現(xiàn)了中醫(yī)藥療法多成分、多靶點(diǎn)的特質(zhì)。進(jìn)一步對(duì)66個(gè)靶基因進(jìn)行了GO BP和KEGG通路富集分析。其中PI3K/Akt和IL-17是IPS核心網(wǎng)絡(luò)中的主要信號(hào)通路。和既往的研究一致[35]，表明這些信號(hào)通路在RA疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響。研究表明，阻斷PI3K/Akt通路可以抑制RA患者FLSs的腫瘤樣生物學(xué)行為[36-37]。Chang等[38]發(fā)現(xiàn)IL-17通過激活STAT3上調(diào)自噬增強(qiáng)了RA中FLSs的腫瘤樣增殖。IL-17在RA-FLSs中誘導(dǎo)線粒體功能障礙和自噬體形成，表明它們對(duì)細(xì)胞凋亡具有抗性。IL-17誘導(dǎo)的自噬相關(guān)抗細(xì)胞凋亡通過抑制自噬而恢復(fù)，這表明線粒體功能障礙與RA-FLSs中的細(xì)胞存活之間存在關(guān)系。輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）和IL-17通過引起線粒體功能障礙增加RA-FLSs的自噬[39]。最近一項(xiàng)研究總結(jié)了中藥及其活性成分對(duì)RA-FLSs的凋亡誘導(dǎo)，闡述了促凋亡治療RA的重要分子機(jī)制[40]。本研究結(jié)果表明，防風(fēng)有效成分可以通過作用于多種生物學(xué)過程和信號(hào)通路發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用，從而起到對(duì)RA的治療作用。對(duì)IPS中篩選出的核心成分和核心靶點(diǎn)組合進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示所有對(duì)接組合均具有良好的對(duì)接活性，說明其可能在RA的治療中發(fā)揮著重要的作用。預(yù)測(cè)結(jié)果為防風(fēng)中活性成分作用于特定靶點(diǎn)治療RA提供了依據(jù)。

在RA滑膜炎性環(huán)境中，F(xiàn)LSs會(huì)發(fā)生凋亡異常，“類腫瘤樣”異常增殖，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度活化，遷移、侵襲能力加強(qiáng)。RA-FLSs分泌細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的募集都會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt通路的高度激活，并進(jìn)一步參與RA-FLSs的異常生物學(xué)行為和炎癥，導(dǎo)致炎癥性侵蝕性關(guān)節(jié)炎和TNF-α介導(dǎo)的軟骨破壞[41]。TNF-α刺激T細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子，激活成骨細(xì)胞產(chǎn)生核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），間接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生[42]。被PI3K激活的Akt能夠通過磷酸化作用抑制或激活其下游死亡啟動(dòng)子相關(guān)靶蛋白Bcl-xL/Bcl-2從而影響細(xì)胞凋亡[35]。別歐前胡素是一種香豆素類生物活性化合物，既往研究表明，其具有抗腫瘤活性、抗氧化、抗炎，以及誘導(dǎo)激活細(xì)胞凋亡、鐵死亡、氧化死亡以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移、侵襲等多種藥理學(xué)作用[43-47]。但目前為止，有關(guān)該化合物的研究很少，其對(duì)RA-FLSs的異常生物學(xué)行為影響的研究尚無報(bào)道。在本研究中，首次闡述了別歐前胡素可以抑制MH7A細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也能抑制、、、和的表達(dá)，這可能是別歐前胡素治療RA的機(jī)制。分子分析表明別歐前胡素通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮對(duì)MH7A細(xì)胞的調(diào)控作用。

本研究通過以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)的研究方法，系統(tǒng)地闡明了防風(fēng)治療RA的分子靶點(diǎn)和潛在機(jī)制。構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選出防風(fēng)治療RA的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)及其作用的方式，以及對(duì)活性成分-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，為揭示防風(fēng)治療RA的分子生物學(xué)機(jī)制和藥物研發(fā)提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，別歐前胡素是通過抑制PI3K/Akt通路的分子機(jī)制在RA治療中發(fā)揮作用的一種新的有價(jià)值的天然潛在藥物。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bioactive components inand its mechanism on rheumatoid arthritis based on network pharmacology

JIANG Yong1, 2, ZHONG Shu-xin3, HE Sheng-hua4, LIANG Jia-bin1, 2, ZHANG Hao-yu1, 2, YE Yu-feng2, CHEN Han-wei2, 5

1. Guangzhou Panyu Central Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. Central Laboratory, Guangzhou Panyu Central Hospital, Guangzhou 511486, China 3. School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China 4. The Fourth Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, China 5. Guangzhou Panyu Health Management Center, Guangzhou 511495, China

To investigate the molecular biological mechanism ofin treating rheumatoid arthritis (RA) through a pharmacology-based strategy.The bioactive phytochemicals ofand potential targets for the treatment of RA were screened by network pharmacology, and phytochemicals-related parameters such as pharmacology and toxicology were evaluated. The protein interaction network was established to screen the core targets, and the correlation between the core targets and RA was further validated by bioinformatics strategy. Finally, molecular docking of core components and corresponding targets was performed. CCK-8 assay, cell migration and invasion, cell apoptosis, qRT-PCR, and Western blotting analysis were performed to clarify the regulation of prangenidin on phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway in MH7A cells.A total of 18 bioactive phytochemicals and 66 potential target genes intersecting with the screened RA disease target genes were identified from. Finally, core ingredients such as wogonin, β-sitosterol, 5--methylvisamminol and prangenidin were obtained. The underlying mechanism ofin treating RA might be achieved by regulating pathways such as PI3K/Akt, interleukin-17 (IL-17), apoptosis and multiple biological processes to exert anti-inflammatory and immunomodulatory effects. Molecular docking confirmed that all core ingredients and key targets had great docking activity. Prangenidin inhibited viability, migration and invasion (< 0.05, 0.01), induced apoptosis in MH7A cells (< 0.01), and significantly down-regulated,,, matrix metalloproteinase-1 () andgene expressions (< 0.01). Molecular analysis showed that prangenidin exerts its regulatory effect on MH7A cells by inhibiting PI3K/Akt pathway.This study successfully predict the effective components and potential targets ofin the treatment of RA, which provide a new theoretical basis for further exploring its molecular mechanism. It is revealed that prangenidin inhibits the activity, migration, invasion and expressions of cytokines and MMPs of RA fibroblast-like synovial cells through PI3K/Akt pathway, and induces cell apoptosis.

(Turcz.) Schischk; rheumatoid arthritis; network pharmacology; pathogenesis mechanism; prangenidin; wogonin; 5--methylvisamminol; fibroblast-like synoviocytes; PI3K/Akt signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5601 - 18

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.014

2023-04-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（8217150266）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81729003）；廣州市衛(wèi)生健康委員會(huì)科技項(xiàng)目（20211A011114）；廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（2022-Z04-114）

蔣 勇，博士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: 20202120219@stu.gzucm.edu.cn

葉裕豐，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: 838554325@qq.com

陳漢威，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: docterwei@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]