一測多評法測定無硫和低硫白芷中5種香豆素類成分的含量

張 強(qiáng)，宋 寶，謝冬梅， 2，王國凱

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012)

白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.或杭白芷A.dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[1]，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、消腫排膿、生肌起痿、燥濕止帶之功效[2-3]。香豆素類成分是白芷中主要成分[4-5]。

一測多評法是利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定一個成分從而實(shí)現(xiàn)多個成分的同步測定，是一種較為簡單易行的中藥多指標(biāo)評價的新方法與多指標(biāo)質(zhì)量評價的新模式[6]。楊芳等[7]建立一測多評法測定川白芷藥材中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量，可準(zhǔn)確控制川白芷的質(zhì)量。

商品白芷經(jīng)過硫磺熏蒸，其有效成分含量會明顯降低[8]。如何建立一種簡便、易行、快捷的方法比較無硫和低硫白芷的質(zhì)量差異，是目前整體評價無硫和低硫白芷質(zhì)量的難題。本研究建立了一測多評方法比較無硫和低硫白芷中歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯及水合氧化前胡素等5種香豆素類成分的含量，以期為評價白芷藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 甲醇(色譜純)：德國Merck公司；水為超純水；水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素對照品(批號分別為CFS201801、CFS201801、CFS201802、CFS201802，純度均為98%)：武漢天植生物技術(shù)有限公司；異歐前胡素(批號110827-201812)：中國食品藥品檢定研究院。白芷藥材2017年收集于安徽亳州、四川遂寧、河南禹州等地(見表1)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥系謝冬梅副教授鑒定為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.的干燥根。

表1 白芷樣品表

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100、Shimadzu LC-16型及Thermo U3000型)；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AX324ZH型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；AB135-S電子天平：瑞士梅特勒托利多公司；JK-450B型超聲儀：合肥金克尼機(jī)械制造有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素對照品，加甲醇溶解，定容，制得水合氧化前胡素0.495 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯0.195 mg/mL、氧化前胡素0.995 mg/mL、歐前胡素2.000 mg/mL及異歐前胡素0.995 mg/mL混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜，待用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取白芷藥材粉末(過3號篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加甲醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲(功率為300 W，頻率為50 kHz)提取1 h后，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，離心(溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心時間為5 min)，靜置，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，水(A)-甲醇 (B)流動相，梯度洗脫(見表2)；流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長300 nm，進(jìn)樣量10 μL。見圖1。

表2 梯度洗脫程序

圖1對照品(A)與白芷樣品(B)的高效液相色譜圖(1.水合氧化前胡素；2.佛手柑內(nèi)酯；3.氧化前胡素；4.歐前胡素；5.異歐前胡素)

2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液分別精密吸取0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，按“2.1.3”項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄。以白芷的5個對照品溶液濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)對照品的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表3。

表3 香豆素成分的線性關(guān)系

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定，記錄峰面積， RSD值分別為0.26%，0.47%，0.12%，0.07%，0.16%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取1號樣品，按“2.1.2”項(xiàng)方法制得供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定，記錄峰面積。結(jié)果RSD值分別為2.04%、1.67%、1.73%、1.73%、1.56%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 選取1號樣品，平行6份，精密稱定，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，測定并記錄峰面積計(jì)算其含量，結(jié)果RSD值分別為1.25%、0.89%、1.32%、0.96%、1.12%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取14號樣品6份，分別加入一定量對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。測定并記錄峰面積，計(jì)算回收率，見表4。結(jié)果表明水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素平均回收率分別為96.74%、99.69%、100.26%、99.48%、101.74%，RSD值分別為0.82%、0.97%、0.77%、0.65%、0.33%。說明該方法的加樣回收率良好。

2.2 相對校正因子的確定

2.2.1 相對校正因子的計(jì)算 根據(jù)在色譜定量分析的基本理論，高效液相響應(yīng)值的大小與各物質(zhì)的質(zhì)量呈線性關(guān)系，即m=f·A。相對校正因子fi/s=fi/fs=(Ai×ms)/(mi×As)，其中As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，ms為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，Ai為待測成分i的峰面積，mi為待測成分i的質(zhì)量。取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，改變進(jìn)樣量為2、4、8、10、20 μL，記錄峰面積，計(jì)算各校正因子。見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5 以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)、其余4個香豆素類

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)；f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)；f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)；f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)；各校正因子均為平行測定3次結(jié)果的均值

2.2.2 儀器和色譜柱的考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)下的色譜條件，平行進(jìn)樣3次，得各峰面積平均值，計(jì)算各相對校正因子，由表6可知RSD均小于3.0%，結(jié)果表明不同高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子無顯著影響。見表6。

2.2.3 不同柱溫、流速對校正因子的影響 同一色譜條件下，考察25、30、35 ℃柱溫、考察0.9、1.0、1.1 mL/min流速對校正因子的影響。由表7可知，柱溫及流速的變化對相對校正因子無顯著影響。

表6 不同儀器和不同色譜柱測定的相對校正因子值(n=3)

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)，f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)，f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)，f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)

2.2.4 待測成分色譜峰的定位 在確定各待測成分的位置時，選取保留時間差值和相對保留時間值兩種方法定位。為了增加定位各組分的可信度，采用了不同的高效液相色譜儀和不同色譜柱進(jìn)行定位考察。由表8可知t(歐前胡素/水合氧化前胡素)、t(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)、t(歐前胡素/氧化前胡素)、t(歐前胡素/異歐前胡素)、Δt(歐前胡素/水合氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)、Δt(歐前胡素/氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/異歐前胡素)的RSD分別為1.94%、2.15%、0.86%、1.76%、19.43%、32.49%、50.88%、39.27%。結(jié)果表明相對保留時間的重復(fù)性較好。

2.3 一測多評法與外標(biāo)法的比較 精密稱取20批藥材粉末0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制成供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，采用外標(biāo)法和一測多評法分別計(jì)算各成分的含量。由表9可知兩種方法所測得5種香豆素成分含量結(jié)果基本一致，表明一測多評法在無硫和低硫白芷多成分測定是可行的。

表7 不同流速對白芷4種校正因子的影響(n=3)

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)，f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)，f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)，f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)

表8 相對保留值及保留時間差值的比較(n=3)

注：t1為t(歐前胡素/水合氧化前胡素)，t2為t(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)，t3為t(歐前胡素/氧化前胡素)，t4為t(歐前胡素/異歐前胡素)；相對保留時間為歐前胡素與水合氧化前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素的保留時間之比，保留時間差的絕對值為各物質(zhì)與歐前胡素保留時間差值的絕對值

表9 外標(biāo)法和一測多評法測定無硫和低硫白芷中5種成分的含量

3 討論

前期研究基礎(chǔ)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，確定色譜條件為甲醇-水系統(tǒng)，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，波長為300 nm，流速為1.0 mL/min。該方法分離度良好，可以對白芷多成分進(jìn)行定量分析。

本研究通過一測多評對水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素5種白芷中香豆素類成分含量進(jìn)行了測定。通過不同儀器、色譜柱、進(jìn)樣量、流速及柱溫可知相對校正因子的RSD值均小于3.0%，說明各因素對相對校正因子無顯著性影響，確立的4種校正因子適用于白芷的一測多評法含量測定。與無硫相比，低硫白芷各成分含量均有下降，且佛手柑內(nèi)酯與氧化前胡素最為明顯。僅有部分低硫白芷歐前胡素含量符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，說明僅以歐前胡素含量為限量指標(biāo)不足以全面控制白芷質(zhì)量。

研究結(jié)果表明外標(biāo)法和一測多評法測定白芷中5種香豆素成分的含量無顯著性差異，說明該方法不僅可用于白芷中5種香豆素類成分同時測定，還可以用來控制硫熏白芷的臨床安全性。采用一測多評法不僅對現(xiàn)有質(zhì)量控制方法有提升，而且還更快捷、可靠。