蒼耳子水提取物對變應性鼻炎豚鼠鼻黏膜病變和血清炎癥細胞因子的影響

孫小草，張 強，章秀梅，劉叢彬，俞年軍,2，謝冬梅,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012)

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是機體接觸變應原后由免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，其典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏、鼻癢和鼻塞、流涕等[1]。AR的發(fā)病機制復雜，現(xiàn)代研究認為其主要是免疫調(diào)節(jié)細胞Th1與Th2比例失衡引起的變應性炎癥疾病。當Th1細胞釋放的干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等細胞因子不足時，Th2細胞會出現(xiàn)亢進現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等細胞因子，從而引起IgE過量，引起AR[2-3]。目前臨床治療AR的藥物種類有糖皮質(zhì)激素類、抗組胺類、抗白三烯類等，其中抗組胺類藥物具有良好的安全性、較少的不良反應等優(yōu)點而成為臨床常用藥，如氯雷他定、依巴斯汀[3-5]。

蒼耳子(Xanthii Fructus)為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)的干燥成熟帶總苞的果實，具有散風寒、通鼻竅、祛風濕的功效[6]。在治療鼻炎、鼻竇炎及AR的30種臨床常用中藥方劑中，含有蒼耳子的有23種，且均作為君藥或臣藥使用，如以蒼耳子為君藥的蒼耳子散對小兒AR具有治療作用[7]。由蒼耳子揮發(fā)油制備的蒼耳油滴鼻劑有明顯的降低AR豚鼠血清IgE水平，修復鼻黏膜結構的作用[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子中含有的咖啡奎寧酸類化合物可能為抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分之一，其水提取物有抗過敏活性[9]。本實驗通過復制AR豚鼠模型，觀察中藥蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學癥狀、鼻黏膜組織病理變化以及血清炎癥細胞因子水平的影響，為蒼耳子治療AR提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及分組 SPF級豚鼠70只，體質(zhì)量200～240 g，購于南京市江寧區(qū)青龍動物繁殖場[生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0008]。將豚鼠隨機分為正常組，模型組，氯雷他定組(2 mg/kg)，玉屏風散組(3 g/kg)，蒼耳子水提取物高劑量(4 g/kg，相當于成人臨床用量的6倍)、中劑量(2 g/kg)、低劑量(1 g/kg)組，每組10只，雌雄各半。

1.2 藥物與試劑 中藥蒼耳子于2017年10月采自北京市朝陽區(qū)長鄉(xiāng)店，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學方成武教授鑒定為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)成熟帶總苞的果實。采用水提取法[10]制備，濾液加熱濃縮至濃度為0.4 g/mL，備用；將氯雷他定片溶于蒸餾水，制成2 mg/mL的溶液；將玉屏風散溶于蒸餾水，制成3 g/mL的溶液。

卵蛋白(ovalbumin，OVA；批號 926A034)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鋁(批號 21645-51-2)：上海麥克林生化科技有限公司；氯雷他定(批號 180225073)：西安楊森制藥有限公司；玉屏風顆粒(批號 ZFB1704)：云南白藥集團股份有限公司；IgE、IL-4、IFN-γ ELISA檢測試劑盒(批號分別為20180516、20180522、201800426)：北京安迪華泰科技有限公司。

1.3 儀器 MSS全波長酶標儀(型號 RT-6000)：深圳雷杜公司；高速冷凍離心機(型號 JW3021HR)：安徽嘉文儀器公司；渦旋混合器(型號 GL-88B)：其林貝爾儀器制造公司；TS-12生物組織自動脫水機；BM-IX生物組織石蠟包埋機；LEICA 2016輪轉(zhuǎn)式切片機；Olympus BX51顯微鏡；JD-80ID形態(tài)學圖形分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 模型復制 基礎致敏階段采用腹腔注射、局部刺激階段采用滴鼻的方法復制AR豚鼠模型[11]。①基礎致敏階段：OVA和氫氧化鋁以1∶100容積比溶于生理鹽水中，使OVA的濃度為0.3%，作為致敏劑。每只豚鼠腹腔注射1 mL，隔日1次，共致敏7次，用時14 d。②局部刺激階段：從第22—31天，對每只豚鼠采用滴鼻法，以5% OVA生理鹽水溶液每側5 μL滴于豚鼠雙側鼻孔，隔日1次。以上步驟正常組均以等容積生理鹽水代替。

每日滴鼻后，依據(jù)鼻癢、流涕、呼吸輕重程度及噴嚏次數(shù)多少為評分標準[12]。①鼻癢：輕擦鼻幾次，計1分；撓鼻不止，計2分；不斷撓鼻，計3分。②流涕：流至前孔，計1分；過鼻孔，計2分；流涕滿面，計3分。③呼吸：呼吸急促，計1分；明顯喘息，計2分；喘息致死，計3分。④噴嚏：滴鼻后30 min內(nèi)1～3個，計1分；4～10個，計2分；10個以上，計3分。于第22、26、30天滴鼻后30 min內(nèi)，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀，并將各癥狀積分疊加，總分大于5分者為模型復制成功。

2.2 分組及給藥 最后一次滴鼻后，根據(jù)鼻部行為學癥狀評分結果重新隨機分為7組。正常組與模型組豚鼠灌胃給予等容量蒸餾水，其余各組豚鼠分別灌胃給予相應藥物，連續(xù)14 d，每日1次。同時采用5% OVA生理鹽水溶液隔日滴鼻，以維持過敏性癥狀直至實驗結束。并于給藥后第7、13天滴鼻后30 min觀察過敏性癥狀并進行評分。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 鼻部行為學癥狀觀察 模型復制期間，于局部刺激階段觀察第22、26、30天各組豚鼠的過敏性癥狀并進行評分。給藥期間，于給藥第7、13天再次激發(fā)，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀并記錄最后一次滴鼻評分。評分標準見“2.1項”。

2.3.2 鼻黏膜組織病理變化觀察 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉處死豚鼠，打開鼻蓋骨，暴露鼻甲及骨性鼻中隔，剝離完整鼻黏膜后放入4%甲醛固定，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學顯微鏡下觀察、拍照、分析。

2.3.3 血清IL-4、IFN-γ及IgE水平檢測 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉處死。腹主動脈取血，推入離心管靜置3 h后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，收集血清。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書操作，依次檢測實驗豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平。

3 結果

3.1 蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學癥狀的影響 模型復制期間，從第1次滴鼻開始，豚鼠30 min內(nèi)均出現(xiàn)不同程度撓鼻、噴嚏癥狀，但無明顯流涕、呼吸急促等癥狀；從第3次滴鼻開始，復制模型的豚鼠不僅出現(xiàn)撓鼻不止、噴嚏不斷，還出現(xiàn)流涕、呼吸急促等癥狀；隨著滴鼻次數(shù)的增加，模型豚鼠過敏性癥狀也越來越明顯。結果說明采用OVA和氫氧化鋁腹腔注射并局部刺激的豚鼠AR模型復制成功。

給藥后，與模型組相比，除玉屏風散組外，其他用藥組AR豚鼠鼻部行為學癥狀積分均有不同程度的降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果說明蒼耳子水提取物對AR豚鼠的過敏性癥狀有一定影響。見表1。

3.2 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學變化比較 HE染色結果顯示，正常組豚鼠鼻黏膜上皮組織結構完整，無血管、腺體改變及炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1A)。模型組豚鼠鼻黏膜上皮組織出現(xiàn)明顯脫落，小血管、腺體出現(xiàn)明顯的增生擴張，組織水腫，大量炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1B)；氯雷他定組鼻黏膜上皮組織結構較為完整，未見明顯小血管增生，少量炎癥細胞浸潤(圖1C)；玉屏風散組鼻黏膜上皮組織輕微脫落，腺體輕微擴張，有嗜酸性粒細胞浸潤(圖1D)；蒼耳子水提取物高劑量組鼻黏膜上皮組織較為完整，少量炎癥細胞浸潤(圖1E)；中劑量組上皮組織基本完整，組織輕微水腫，有炎癥細胞浸潤(圖1F)；低劑量組鼻黏膜上皮組織有輕微脫落，小血管、腺體增生擴張明顯，炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤明顯(圖1G)。

表1 各組豚鼠鼻部行為學癥狀積分比較

注：與正常組比較，*P<0.05

注:A.正常組;B模型組;C.氯雷他定組;D.玉屏風散組;E.蒼耳子水提取物高劑量組;F.蒼耳子水提取物中劑量組;G.蒼耳子水提取物低劑量組圖1 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學變化比較(HE染色,10×20倍)

3.3 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較 與正常組比較，模型組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著升高(P<0.05)，IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各用藥組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)；蒼耳子水提取物各劑量組IgE、IL-4、IFN-γ水平多重比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表2。

4 討論

蒼耳子作為臨床治療鼻淵頭痛的常用藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。在調(diào)節(jié)免疫功能方面，蒼耳子水煎液中琥珀酸被認為可能是蒼耳子調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分之一[13]。王龍妹等[14]發(fā)現(xiàn)，蒼耳子水煎液對細胞免疫作用明顯。張芩等[15]發(fā)現(xiàn)，玉屏風散合蒼耳子散可調(diào)節(jié)機體免疫功能。

豚鼠具有易致敏的生物學特性，并且因血清中含有大量的補體，能產(chǎn)生穩(wěn)定的、高效價的特異性免疫球蛋白，常被選為AR的模型動物。因此，以OVA和氫氧化鋁的混懸液作為致敏劑，腹腔注射和滴鼻激發(fā)AR豚鼠模型。陣發(fā)性噴嚏、鼻癢、流涕等為AR患者的典型癥狀，滴鼻激發(fā)可使模型動物產(chǎn)生相同的過敏性癥狀，對過敏性癥狀進行評分可以初步判斷模型是否成功，是評價藥物治療AR療效的主要方法[11-12]。

Th1細胞主要介導細胞免疫應答，通過釋放IFN-γ、IL-2等細胞因子來抑制Th2細胞活化；Th2細胞主要介導體液免疫應答，通過產(chǎn)生IL-4、IL-5等細胞因子來抑制Th1細胞分化，當Th1細胞釋放的IFN-γ等細胞因子不足時，Th2細胞出現(xiàn)亢進現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的IL-4，從而引起IgE過量[16-17]。因此，通過檢測豚鼠血清中IL-4和IFN-γ水平變化，可以評價蒼耳子水提取物對Th1/Th2細胞平衡的影響，同時檢測血清中IgE水平變化，可以反映AR豚鼠病理狀態(tài)的嚴重程度。

除IL-4外，Th2細胞還可以釋放其他細胞因子刺激肥大細胞釋放遞質(zhì)，從而引起鼻黏膜上皮組織病變，鼻黏膜上皮組織由柱狀纖毛細胞、柱狀細胞、杯狀細胞和基底細胞緊密相連于基底膜上形成上皮屏障。當接觸變應原后，會出現(xiàn)基底膜病變，致使柱狀細胞脫落、炎癥細胞浸潤、小血管擴張等病變[18]。因此，通過HE染色觀察AR豚鼠鼻黏膜病理變化以評價蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻黏膜組織的影響。

表2 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯雷他定組比較，△P<0.05；與玉屏風散組比較，◇P<0.05；與蒼耳子水提取物高劑量組比較，□P<0.05；與蒼耳子水提取物中劑量組比較，▲P<0.05

本研究結果表明，蒼耳子水提取物可以改善AR豚鼠的過敏性癥狀，減輕AR豚鼠鼻黏膜的病理改變，降低血清中IL-4水平，升高IFN-γ的水平，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡，降低血清IgE水平，進而發(fā)揮其治療AR的作用。