補(bǔ)骨脂素治療骨關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

王蔚陸 陳建新 朱 姜 梁丁龍 馬彥旭

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京,100029; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院,廈門,361009; 3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)學(xué)院,北京,100010)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種不由衰老引起,多受關(guān)節(jié)軟骨生化改變與生物力學(xué)應(yīng)力影響的退行性關(guān)節(jié)疾病。中醫(yī)有“骨痹、膝痹、膝眼風(fēng)”的相關(guān)記載?！肮潜浴弊钤缭从凇饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論篇》[1],現(xiàn)代中醫(yī)對(duì)其病因病機(jī)有了更全面的認(rèn)識(shí),認(rèn)為素體年邁、骨節(jié)虧虛、筋骨失養(yǎng),外加風(fēng)寒濕邪侵襲,終致氣血不通,脈絡(luò)痹阻[2]。補(bǔ)骨脂又名破故紙、胡韭子[3]。薔薇目,豆科植物成熟果實(shí),出自《雷公炮炙論》。補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要成分,屬于香豆素類化合物,能有效調(diào)控細(xì)胞因子,尤其是白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)通路所介導(dǎo)的滑膜-軟骨交互作用。由于PSO在紫外線燈的照射下可產(chǎn)生光毒反應(yīng),有光致敏史的患者、兒童及孕婦應(yīng)慎用。本文結(jié)合李梢教授提出的藥理學(xué)的研究方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[4-5],以受體或靶點(diǎn)為藥物活性的治療關(guān)鍵,探討化合物作用受體機(jī)制及特性表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人原代OA滑膜成纖維細(xì)胞(貨號(hào):JY-J884,培養(yǎng)體系:1×原代細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代細(xì)胞培養(yǎng)添加劑5 mL,-20 ℃避光保存;終濃度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×青霉素-鏈霉素雙抗混合液(Penicillin-streptomycin Solution,P/S)5 mL,-20 ℃避光保存),人原代OA軟骨細(xì)胞(貨號(hào):JY-J905,培養(yǎng)體系:1×原代細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代細(xì)胞培養(yǎng)添加劑5 mL,-20 ℃避光保存;終濃度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×P/S 5 mL,-20 ℃避光保存),以上細(xì)胞購(gòu)自上海瑾原生物科技有限公司,25 mL培養(yǎng)瓶放置在孵育箱中,細(xì)胞培養(yǎng)基于碳酸氫鹽的緩沖體系,設(shè)置5% CO2氣體環(huán)境,維持pH=7.2,溫度37 ℃。

1.1.2 藥物 藥物:補(bǔ)骨脂素(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司,批號(hào):RFS-B06502005013)。

1.1.3 試劑與儀器 TransZol Up Plus RNA Kit(TRANS,批號(hào):ER501-01-V2);TransScript? Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS,批號(hào):AU341-02-V2);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(康為世紀(jì),批號(hào):CW0659)。凝膠電泳儀(Tanon,型號(hào):EPS600);凝膠成像儀(Peiqing Science and Technology,型號(hào):JS-2012);熒光定量PCR儀(ROCGENE,型號(hào):Archimed-X4);Transwell小室(北京索萊寶生物科技,批號(hào):Corning 3422)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到85%以上融合時(shí)進(jìn)行消化傳代,將傳至第3代的滑膜細(xì)胞(1×104個(gè)/mL)和軟骨細(xì)胞(8×104個(gè)/mL),分別種于Transwell小室的上室和下室,制備滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,共培養(yǎng)4 d。

1.2.2 分組與干預(yù)方法 將軟骨細(xì)胞-滑膜細(xì)胞體系隨機(jī)分為補(bǔ)骨脂素低濃度組(1 μmol/L)、補(bǔ)骨脂素中濃度組(8 μmol/L)、補(bǔ)骨脂素高濃度組(50 μmol/L)以及空白對(duì)照組(0 μmol/L),共4組,干預(yù)48 h,每組留取Transwell小室下室軟骨細(xì)胞的3個(gè)樣本進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,選取IL-17、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和核因子κB作為藥物干預(yù)細(xì)胞共培養(yǎng)體系的觀測(cè)對(duì)象,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察不同濃度補(bǔ)骨脂素對(duì)模型細(xì)胞中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA水平表達(dá)量的影響。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 補(bǔ)骨脂素靶點(diǎn)獲取 通過(guò)SymMap2.0(http://www.symmap.org/)平臺(tái)檢索化合物靶點(diǎn)[6],中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)以及文獻(xiàn)補(bǔ)充化合物靶點(diǎn)信息,利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.3.2 OA的基因獲取 分別向GeneCards(http://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)等數(shù)據(jù)庫(kù)輸入Osteoarthritis,獲得疾病基因,參考《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》可靠性、規(guī)范性和合理性的定義,以相關(guān)性大小為依據(jù)篩選關(guān)鍵基因[4]。

1.3.3 補(bǔ)骨脂素治療疾病核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、生物富集分析和通路分析 將PSO與OA靶點(diǎn)取交集,得到化合物治療疾病的位點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape繪制模型,節(jié)點(diǎn)表示蛋白,線表示相互關(guān)系。節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深越重要。線越粗,顏色越深,聯(lián)系越緊密。

使用Metascape(http://metascape.org/)平臺(tái),導(dǎo)入16個(gè)靶點(diǎn),設(shè)置種屬為人類,進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,包含生物過(guò)程(Biological Process,BP)、細(xì)胞組分(Cell Component,CC)及分子功能(Molecular Function,MF),根據(jù)富集系數(shù)(Enrichment)大小進(jìn)行排序,保留排名靠前的結(jié)果;使用Cytoscape插件ClueGO進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,Kappa系數(shù)選中等,繪制yFiles Tree Layout圖。

1.3.4 病癥結(jié)合研究補(bǔ)骨脂素治療作用 首先下載補(bǔ)骨脂素化合物(Ingredients)相關(guān)的草藥(Herb)、疾病(Disease)、中醫(yī)證候(Traditional Chinese Medicine Syndrome,TCM Syndrome)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀(Modern Medicine Symptom,MM Symptom)和綜合征(Syndrome)板塊;其中Disease內(nèi)容較多,使用“炎、痛、骨、關(guān)節(jié)、脊、椎”為關(guān)鍵詞篩選OA相關(guān)疾病。

然后下載OA疾病相關(guān)的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板塊。

最后將PSO和OA二者對(duì)應(yīng)的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板塊條目取交集,建構(gòu)PSO和OA之間的聯(lián)系。確定核心Syndrome和TCM Syndrome后,下載其對(duì)應(yīng)的草藥Herb,用Cytoscape軟件繪制化合物-草藥-癥狀體征圖(Ingredients-herb-syndrome/TCM Syndrome)。黃色圓形節(jié)點(diǎn)表示PSO,粉色菱形節(jié)點(diǎn)表示OA患者的Syndrome,橘黃菱形節(jié)點(diǎn)表示OA患者TCM Syndrome,中草藥用藍(lán)方形節(jié)點(diǎn)表示,其中深藍(lán)方形節(jié)點(diǎn)代表核心中藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂素治療OA的靶點(diǎn)選取 藥物方面,涉及26個(gè)PSO靶點(diǎn),結(jié)合TCMSP及文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充靶點(diǎn),共計(jì)27個(gè)。疾病方面,獲得靶點(diǎn)741個(gè),最后將27個(gè)PSO靶點(diǎn)與741個(gè)OA靶點(diǎn)取交集,得到16個(gè)PSO精準(zhǔn)治療OA的靶點(diǎn)。

2.2 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)建構(gòu) PSO治療OA靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及15個(gè)節(jié)點(diǎn),46條邊,獨(dú)立節(jié)點(diǎn)EFEMP1未納入網(wǎng)絡(luò),剩余15個(gè)節(jié)點(diǎn)按節(jié)點(diǎn)間聯(lián)系次數(shù)由高到低排序,依次為TNF、FOS、ESR1、MMP9、TGFB1和NFKB1,其中TNF和NFKB1與炎癥相關(guān),且關(guān)系緊密。見圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂素治療骨關(guān)節(jié)炎PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 共有靶點(diǎn)生物富集與通路分析 PSO治療OA靶點(diǎn)生物過(guò)程顯示細(xì)胞生物過(guò)程于骨和軟骨的分化發(fā)育(Osteoblast Differentiation and Development)有關(guān),細(xì)胞成分主要作用于介導(dǎo)免疫炎癥發(fā)生發(fā)展的髓系白細(xì)胞(Myeloid Leukocyte),通過(guò)調(diào)控類固醇激素合成(Steroid Biosynthetic)的分子功能發(fā)揮抗炎作用。見圖2。Cytoscape插件ClueGO富集出6個(gè)通路,主要包括破骨細(xì)胞分化通路(軟骨下骨組織的異常改變),IL-17通路,TNF信號(hào)通路以及催乳素通路。見圖3。

圖2 補(bǔ)骨脂素治療OA靶點(diǎn)生物過(guò)程、細(xì)胞成分與分子功能結(jié)果圖

圖3 補(bǔ)骨脂素治療OA靶點(diǎn)的通路富集分析

2.4 病癥結(jié)合分析 SymMap共有21種含PSO的藥物。見表1。14條PSO相關(guān)的骨傷科疾病。見表2。PSO對(duì)應(yīng)101條TCM symptom,20條MM symptom,常見詞匯Sputum和Pain,7條syndrome。OA(按部位分為髖、膝、脊柱)對(duì)應(yīng)174條TCM symptom,18條MM symptom,常見詞匯Pain,46條syndrome。二者取交集后得到6條TCM Syndrome和1條syndrome。見表3。

表1 常見含有補(bǔ)骨脂素化合物的中草藥

表2 補(bǔ)骨脂素有關(guān)的骨傷科疾病

表3 補(bǔ)骨脂素對(duì)癥治療綜合征和中醫(yī)證候

化合物-草藥-癥狀體征圖包含71個(gè)節(jié)點(diǎn),78條邊。結(jié)果顯示“風(fēng)”“寒”挾“濕”雜合而為痹(骨關(guān)節(jié)炎),其中核心藥物有骨碎補(bǔ)、蛇床子、獨(dú)活和補(bǔ)骨脂。見圖4。

圖4 補(bǔ)骨脂素治療OA化合物-草藥-癥狀體征圖

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較,補(bǔ)骨脂素低濃度組IL-17和核因子κB的擴(kuò)增倍數(shù)有所升高(均P<0.01);補(bǔ)骨脂素中濃度組IL-17和TNF-α有所下降(均P<0.01);補(bǔ)骨脂素高濃度組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 補(bǔ)骨脂素干預(yù)共培養(yǎng)體系mRNA擴(kuò)增倍數(shù)(n=3)

3 討論

3.1 病癥與中草藥化合物 補(bǔ)骨脂素又叫補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、制斑素,屬呋喃香豆素類,近年研究顯示其在骨傷科疾病方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。病癥結(jié)合領(lǐng)域,中醫(yī)認(rèn)為補(bǔ)骨脂素主治的OA屬于風(fēng)寒挾濕的痹癥。首先,針對(duì)疼痛走注不定為特征的行痹,中醫(yī)認(rèn)為與“風(fēng)”有關(guān)。風(fēng)為百病之長(zhǎng),寒濕等常依附風(fēng)侵犯人體,其中以風(fēng)寒、風(fēng)濕最為常見。內(nèi)因?yàn)樾l(wèi)陽(yáng)不固,腠理空虛。而以肢體骨節(jié)疼痛酸困、痛處不移的著痹,中醫(yī)多認(rèn)為與“濕”有關(guān)。外濕內(nèi)濕,同氣相求,常相互引動(dòng),病位主要在肢體、經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)。病久不愈,內(nèi)侵筋骨血脈,復(fù)感于邪,累及心腎。針對(duì)疼痛較甚,痛有定處,筋骨攣痛的寒痹,中醫(yī)認(rèn)為寒則凝塞,不通則痛,主張溫經(jīng)散寒,由于風(fēng)寒濕痹與炎癥疼痛密切相關(guān),現(xiàn)代理論研究提出了津液不歸正化,痰濕內(nèi)蘊(yùn)的學(xué)說(shuō),借助西醫(yī)免疫炎癥的具體機(jī)制,闡述中醫(yī)痰濕致病的理論,使“無(wú)形之痰”更為直觀,中醫(yī)治法強(qiáng)調(diào)溫化以去除水濕痰飲。證候?qū)W研究更是印證了二者的緊密聯(lián)系,理法方藥環(huán)環(huán)相扣,渾然天成。另外中醫(yī)藥有著鮮明的辨證論治色彩,東西方文化在證候改觀和病因祛除的認(rèn)知上存在差異,從祛除致病因素的角度,做好鑒別診斷至關(guān)重要,而從緩解癥狀角度出發(fā),不同疾病有時(shí)可以存在相似的表征,所以中醫(yī)又有異病同治的原則[7]。

3.2 疾病與基因 本節(jié)我們重點(diǎn)介紹上游的IL-17通路相關(guān)基因。

首先,IL-17屬于一種重要的炎癥介質(zhì)[8],參與多種炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的病理過(guò)程,下游介導(dǎo)核因子κB等通路,與炎癥關(guān)系明確。其次,IL-17可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨和骨細(xì)胞分泌TNF-α等因子,TNF可能與受體結(jié)合,由巨噬細(xì)胞分泌,通過(guò)去磷酸化損害關(guān)節(jié)炎患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Cells,Treg Cells)能力。上述因子導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的驟然發(fā)作,通過(guò)IL-17維持Th17細(xì)胞(Helper T Cell 17,Th17 Cell)的數(shù)量,形成正反饋,維持慢性炎癥狀態(tài),刺激多種趨化因子(Chemokines)產(chǎn)生,其中包括CXCL家族和CC家族,CXCL 1、CXCL2、CXCL8和CCL20、CCL2與CCL7。

以上因子將淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與粒細(xì)胞招募到滑膜加重其炎癥,骨與軟骨大量損傷會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)難逆性變形,IL-17通過(guò)誘導(dǎo)可降解胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)參與此過(guò)程。破骨細(xì)胞通過(guò)碳酸酐酶酸化,幫助骨基質(zhì)溶解成為水、鈣離子和其他物質(zhì)。質(zhì)子泵以高濃度梯度泵送氫離子,特化的液泡ATP酶能夠釋放多種水解酶,比如MMP和組織蛋白酶,以消解基質(zhì),尤其是軟骨下骨基質(zhì)的有機(jī)成分。其中MMP9由破骨細(xì)胞表達(dá),與骨微環(huán)境有關(guān),是破骨細(xì)胞遷移所必需的一種強(qiáng)大明膠酶。破骨細(xì)胞分化受到其護(hù)骨因子(Osteoprotegerin,OPG)抑制,它由成骨細(xì)胞產(chǎn)生并與核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for NF-κB Ligand,RANKL)結(jié)合,阻止與RANK的作用。基于以上機(jī)制,IL-17既可增強(qiáng)炎癥,又能刺激破骨細(xì)胞分化導(dǎo)致骨與軟骨的異常改變,如破骨細(xì)胞數(shù)量減少、骨硬化及其吸收減少[30]。

此外IL-17與TNF-α等協(xié)同放大其炎癥效應(yīng),其中與TNF-α配合形成正反饋環(huán)路,加重局部反應(yīng),關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中IL-17顯著升高,IL-17是炎癥反應(yīng)和免疫偏移的重要調(diào)節(jié)因子,可促進(jìn)TNF-α等炎癥介質(zhì)的分泌,破壞軟骨穩(wěn)態(tài),促進(jìn)滑膜浸潤(rùn),與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度成正比[10]。IL-17不僅反映全身炎癥狀態(tài),同時(shí)調(diào)控關(guān)節(jié)內(nèi)局部炎性微環(huán)境。二者間的交互傳遞極有可能刺激下游靶向核因子κB通路,而作為促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPKs)信號(hào)級(jí)聯(lián),其過(guò)度激活可加劇關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)及功能障礙與軟骨下骨重塑異常[12]。最后IL-17可通過(guò)環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)誘導(dǎo)前列腺素?cái)U(kuò)血管作用,促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)入病變部位,吞噬免疫復(fù)合物,釋放溶酶體,包括膠原酶和中性蛋白酶,破壞膠原彈力纖維,使滑膜表面及關(guān)節(jié)軟骨損傷[9]。IL-17還可以誘導(dǎo)RANKL表達(dá),促使破骨細(xì)胞分化,RANKL是TNF家族成員,基因敲除小鼠可表現(xiàn)出骨硬化以及破骨細(xì)胞缺失的表型,RANKL通過(guò)RANK激活核因子κB,近年開發(fā)的RANKL抑制劑(地舒單抗)在預(yù)防骨質(zhì)疏松,抑制關(guān)節(jié)炎性病變上也顯示出了良好前景[11]。

另外部分基因從不同角度干預(yù)病程,乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase,ACE)通過(guò)快速水解釋放到突觸間隙中的乙酰膽堿終止神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[13]。單胺氧化酶A(Monoamine Oxidase A,MAOA)優(yōu)先氧化生物胺,其代謝(合成、儲(chǔ)存、釋放和滅活)異常是導(dǎo)致疼痛的主要原因。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)可使組織免受活性氧中間體毒害,OA中氧化應(yīng)激可致滑膜炎癥和局部關(guān)節(jié)內(nèi)病變[14]。

最后我們嘗試解釋男女性別分布差異原因,高雌激素水平所致疾病的女性,及肥胖、藥物等因素所致男性雌化的患者,OA臨床癥狀更嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)OA患者臨床特點(diǎn)及中醫(yī)證型分布流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論何種中醫(yī)證型,一般女性多于男性,提示雌激素在OA病理進(jìn)程中發(fā)揮作用[15-16,29]。不同性別患者在疼痛、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨退變以及軟骨下骨硬化方面存在差異。澳大利亞一項(xiàng)研究顯示女性患者軟骨損失率更高,差異在40歲時(shí)顯現(xiàn),并隨年齡增長(zhǎng)越發(fā)明顯[17]。動(dòng)物研究表明雌性大鼠比雄性滑膜炎癥、軟骨破壞和軟骨下骨質(zhì)退化表現(xiàn)更嚴(yán)重,對(duì)刺激更敏感,滑膜周圍巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)更廣泛,這是女性疼痛程度更高的原因[18-19]。與男性O(shè)A軟骨細(xì)胞相比,女性O(shè)A細(xì)胞雌激素受體表達(dá)較高,相關(guān)白細(xì)胞介素mRNA水平更高[20]。研究顯示PSO與雌激素受體結(jié)合,具有植物類雌激素樣作用,發(fā)揮抗炎作用,該效應(yīng)可被雌激素受體抑制劑逆轉(zhuǎn)[21-22]。但是考慮疾病在性別分布上的差異,參考類固醇激素代謝及負(fù)反饋調(diào)節(jié),我們提出了PSO可能存在類雌激素樣的作用,而非雌激素本身的假設(shè),同時(shí)我們猜想PSO的類雌激素樣作用,與雌激素本身存在明顯不同,它可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)受體,同時(shí)加速了雌激素向糖皮質(zhì)激素方向轉(zhuǎn)化,發(fā)揮抗炎作用。實(shí)驗(yàn)研究也顯示中等濃度補(bǔ)骨脂素的確有效降低OA患者軟骨-滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系IL-17和TNF-α的水平。

3.3 疾病與通路 骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的綜合作用在維持OA患者軟骨下骨量方面發(fā)揮重要作用。從骨軟骨交界處形成“骨-軟骨-鈣化軟骨”的三明治結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)硬化、纖維化與疏松并存,提示骨代謝異常,雙向軟骨病理性鈣化始于軟骨表面纖維化區(qū)域,有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素可以增加骨密度,用于治療骨質(zhì)疏松和OA軟骨下骨組織流失,同時(shí)抑制軟骨病理性鈣化,以維持正常骨組織生理結(jié)構(gòu),體現(xiàn)了藥物干預(yù)后機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)。通路富集還顯示催乳素途徑和利什曼病較顯著,二者分別對(duì)應(yīng)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和原蟲性關(guān)節(jié)炎;脾腎陽(yáng)虛的潰瘍性結(jié)腸炎患者,常出現(xiàn)五更泄瀉,四神丸是治療本病的經(jīng)典方劑,但是與OA關(guān)系不緊密,并非研究重點(diǎn)。本節(jié)著重將其和IL-17炎癥通路關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。

再吸收的骨表面可發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞,它是一種大的多核細(xì)胞,可有幾十個(gè)細(xì)胞核,特點(diǎn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀疏,高爾基體廣泛,主要表達(dá)破骨細(xì)胞蛋白[23]。骨骼中的破骨細(xì)胞位于骨表面凹坑的豪息潑氏陷窩(Howship Lacuna)。破骨細(xì)胞胞質(zhì)具有均勻泡沫樣外觀,這利于液泡填充酸性磷酸酶溶酶體。骨吸收活躍部位,破骨細(xì)胞形成廣泛折疊或起皺的專有邊界,通過(guò)增加細(xì)胞膜表面積來(lái)分泌和吸收區(qū)室內(nèi)容物,促進(jìn)骨的去除。另外分泌酸和膠原酶,在分子水平上消解吸收水合蛋白與礦物質(zhì),破骨細(xì)胞影響骨基質(zhì)再吸收、無(wú)機(jī)成分溶解及骨基質(zhì)有機(jī)成分消化,能夠?qū)潆x子泵入亞破骨細(xì)胞室制造酸性微環(huán)境,增加礦物質(zhì)溶解度,致使礦物質(zhì)釋放入破骨細(xì)胞胞質(zhì),最終轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近毛細(xì)血管。礦物質(zhì)去除后,膠原酶和明膠酶被分泌到亞破骨細(xì)胞隔室中,消化、降解、脫鈣基質(zhì)膠原蛋白與有機(jī)成分,其產(chǎn)物在褶皺邊緣被破骨細(xì)胞吞噬。具有吞噬特性可以認(rèn)定其屬于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的一部分,激素與細(xì)胞因子可調(diào)控其活性。

IL-17屬于前炎癥介質(zhì),調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫偏倚,含6個(gè)家族成員與5種受體[24]。IL-17來(lái)源于活化的肥大細(xì)胞和Th17細(xì)胞,通過(guò)血管浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜。軟骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞表面均存在IL-17受體[25]。研究表明OA進(jìn)程中T細(xì)胞直接對(duì)軟骨和成纖維細(xì)胞膜抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。關(guān)節(jié)炎患者的血清和滑液中IL-17水平較對(duì)照組顯著升高,其能夠抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖,促進(jìn)MMPs產(chǎn)生,與影像學(xué)呈現(xiàn)正相關(guān),不僅如此,部分人群中基因IL-17多態(tài)性與關(guān)節(jié)炎發(fā)展的易感性相關(guān)[26-27]。作為前體,IL-17可通過(guò)核因子κB通路引發(fā)炎癥反應(yīng),IL-17通過(guò)與細(xì)胞表面的IL-17受體特異性結(jié)合,激活激酶引起磷酸化[28]。與空白對(duì)照組比較,中等濃度補(bǔ)骨脂素可以使OA患者軟骨-滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的IL-17、TNF-α顯著下降,對(duì)于抑制OA癥進(jìn)展具有重要意義,另外核因子κB無(wú)顯著變化,仍需擴(kuò)大樣本做進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之,上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析符合中等劑量補(bǔ)骨脂素治療OA的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,為進(jìn)一步研究提供了有力依據(jù)。

利益沖突聲明:本研究不涉及利益沖突。