ART調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移的影響

張雄，周江，李濤，郝琪偉，李勝，楊剛，李騰，李建雄，喬培宇，張?chǎng)?/p>

榆林市第二醫(yī)院普通外科二病區(qū)，陜西 榆林 719000

肝癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，起病較為隱匿，發(fā)病初期無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)到中、晚期或發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1-2]。尋找高效低毒的抗肝癌藥物對(duì)于肝癌患者的臨床治療及預(yù)后具有重要意義。青蒿琥酯(artesunate，ART)是青蒿素的衍生物，具有特異的抗瘧效果，在治療重癥以及耐藥性瘧疾上效果顯著[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ART除了具有特異的抗瘧作用以外，還具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等其他生物學(xué)特性[4]。目前，有較多文獻(xiàn)報(bào)道，ART對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期有關(guān)[5]。磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路在肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程[6]。本研究探討了ART對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路以及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 本研究的主要試劑和儀器見(jiàn)表1。

表1 主要試劑及儀器明細(xì)Table 1 Details of main reagents and instruments

1.2 方法

1.2.1 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng) 在10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 培養(yǎng)基中接種HepG2 細(xì)胞后放置在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中(二氧化碳含量為5%，溫度37℃，濕度97%)培養(yǎng)。隨后每隔1 d 更換液體，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)，按照1∶2 傳代培養(yǎng)。采用含0.05%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。青蒿琥酯采用二甲基亞砜(DMSO)溶解，加水稀釋到10 mg/mL 作為儲(chǔ)存液，避光儲(chǔ)存到-20℃的冰箱中，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用DMEM/F12 培養(yǎng)基稀釋到目標(biāo)濃度。

1.2.2 分組方法 將HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用0.25%胰蛋白酶消化后，離心去上清液。采用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至2.5×104個(gè)/mL，每孔加入200 μL 接種至96 孔板中放置在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)(二氧化碳含量為5%，溫度37℃，濕度97%)，分別加入200 μL 含有30 μg/mL、60 μg/mL和120 μg/mL的ART，每種濃度各加20孔，分別作為30 μg/mL組、60 μg/mL組、120 μg/mL組，另取20孔加入等量的培養(yǎng)液作為對(duì)照組。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將四組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入90 μL細(xì)胞培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑，放置在恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h后，采用酶標(biāo)儀450 nm 處的光密度(OD)值，計(jì)算各組的HepG2細(xì)胞增殖率，增殖率=(處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2 細(xì)胞，采用10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至2.5×104個(gè)/mL，每孔1.0 mL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)液，加入200 μL 含有30 μg/mL、60 μg/mL 和120 μg/mL 的ART，每種濃度各加20 孔，另取20 孔加入等量的培養(yǎng)液作為對(duì)照組，將四組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用0.25%胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，采用PBS清洗兩次，300目尼龍網(wǎng)濾除細(xì)胞團(tuán)塊后，調(diào)整細(xì)胞濃度≥1×106個(gè)/mL，按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min后再加入5 μL PI，避光孵育10 min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.5 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2 細(xì)胞，采用10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至2.5×104個(gè)/mL。遷移實(shí)驗(yàn)：上、下室分別加入100 μL細(xì)胞懸液、500 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。細(xì)胞懸液分別加入200 μL 含有30 μg/mL、60 μg/mL 和120 μg/mL 的ART以及等量的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基。取出小室后采用4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取20 個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell 上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后加入100 μL細(xì)胞懸液，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，PBS洗滌2 次后去除液體，加入RIPA 裂解液后4℃環(huán)境下裂解細(xì)胞30 min；提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)得領(lǐng)蛋白含量后進(jìn)行定量，之后將蛋白質(zhì)溶液與等量上樣緩沖液混合，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，在脫脂奶粉溶液中(稀釋比例為5%，溫度37℃)封閉放置3 h；分別加入一抗后放置在4℃下孵育過(guò)夜，TBS漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃下孵育1 h，TBS 漂洗3 次；滴加化學(xué)放光液后在室溫環(huán)境下孵育3 min，去除化學(xué)放光液后將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，檢測(cè)各蛋白條帶的積分光密度(IOD)值，重復(fù)三次取平均值作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究中各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ART對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度ART作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率和Ki-67蛋白表達(dá)均明顯降低，ART濃度越高，細(xì)胞增殖率和Ki-67蛋白表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2和圖1。

圖1 Western Blot 檢測(cè)不同濃度ART對(duì)Ki-67蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of Ki-67 protein in the four groups by western blot

表2 各組肝癌HepG2細(xì)胞的增殖率及Ki-67蛋白表達(dá)水平比較()Table 2 Comparison of proliferation rate and Ki-67 protein expression of HepG2 cells among the four groups()

表2 各組肝癌HepG2細(xì)胞的增殖率及Ki-67蛋白表達(dá)水平比較()Table 2 Comparison of proliferation rate and Ki-67 protein expression of HepG2 cells among the four groups()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。Note:Compared with that in the control group,aP＜0.05.

組別對(duì)照組30 μg/mL組60 μg/mL組120 μg/mL組F值P值Ki-67 0.98±0.16 0.76±0.11a 0.43±0.09a 0.29±0.04a 165.46 0.001例數(shù)20 20 20 20細(xì)胞增殖率(%)100.00±10.51 81.73±8.39a 65.26±6.48a 44.27±4.66a 184.32 0.001

2.2 不同濃度ART對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度ART作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低；ART濃度越高，細(xì)胞凋亡率、Bax和Caspase-3 蛋白表達(dá)越高，Bcl-2 表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3和圖2。

圖2 Western Blot 檢測(cè)不同濃度ART對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of Bax,Bcl-2,and Caspase-3 proteins in the four groups by western blot

表3 各組肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較()Table 3 Comparison of apoptosis rate and expression of Bax, Bcl-2,and Caspase-3 proteins in HepG2 cells among the four groups()

表3 各組肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較()Table 3 Comparison of apoptosis rate and expression of Bax, Bcl-2,and Caspase-3 proteins in HepG2 cells among the four groups()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。Note:Compared with that in the control group,aP＜0.05.

組別對(duì)照組30 μg/mL組60 μg/mL組120 μg/mL組F值P值Caspase-3 8.73±0.46 10.26±0.68a 12.47±0.77a 14.96±0.81a 306.17 0.001例數(shù)20 20 20 20細(xì)胞凋亡率(%)5.75±1.63 24.84±4.91a 36.02±7.35a 50.27±10.02a 155.91 0.001 Bax 0.17±0.03 0.26±0.05a 0.39±0.06a 0.58±0.08a 189.05 0.001 Bcl-2 0.83±0.09 0.62±0.07a 0.48±0.06a 0.33±0.04a 198.83 0.001

2.3 不同濃度ART 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度ART 作用于HepG2 細(xì)胞后，細(xì)胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量和MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)明顯降低；ART 濃度越高，細(xì)胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量和MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4和圖3。

圖3 Western Blot 檢測(cè)不同濃度ART對(duì)MMP2、MMP9蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of MMP2 and MMP9 protein in the four groups by western blot

表4 各組肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量以及MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)()Table 4 Cell migration,invasion number,and MMP2,MMP9 protein expression of HepG2 cells in the four groups()

表4 各組肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量以及MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)()Table 4 Cell migration,invasion number,and MMP2,MMP9 protein expression of HepG2 cells in the four groups()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。Note:Compared with that in the control group,aP＜0.05.

組別對(duì)照組30 μg/mL組60 μg/mL組120 μg/mL組F值P值例數(shù)20 20 20 20細(xì)胞遷移數(shù)量(個(gè))234.28±20.64 189.11±16.73a 162.29±15.03a 134.26±13.26a 130.85 0.001細(xì)胞侵襲數(shù)量(個(gè))187.55±16.31 144.13±13.46a 121.61±10.23a 90.26±8.71a 213.38 0.001 MMP2 0.83±0.19 0.46±0.08a 0.38±0.06a 0.29±0.05a 92.51 0.001 MMP9 0.74±0.16 0.41±0.09a 0.33±0.06a 0.24±0.03a 99.55 0.001

2.4 各組細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，不同濃度ART 作用于HepG2 細(xì)胞后，PI3K、p-P13K 和p-AKT 蛋白表達(dá)明顯降低；ART 濃度越高，PI3K、p-P13K 和p-AKT 蛋白表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表5 和圖4。

圖4 Western Blot 檢測(cè)不同濃度ART對(duì)PI3K、p-P13K、p-AKT蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of PI3K,p-P13K,and p-AKT proteins in the four groups by western blot

表5 各組細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較()Table 5 Comparison of expression levels of PI3K/AKT pathway-related proteins in cells among the four groups()

表5 各組細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較()Table 5 Comparison of expression levels of PI3K/AKT pathway-related proteins in cells among the four groups()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。Note:Compared with that in the control group,aP＜0.05.

組別對(duì)照組30 μg/mL組60 μg/mL組120 μg/mL組F值P值p-AKT 0.75±0.19 0.56±0.11a 0.38±0.09a 0.21±0.04a 74.66 0.001例數(shù)20 20 20 20 PI3K 0.85±0.17 0.51±0.13a 0.36±0.09a 0.19±0.05a 111.71 0.001 p-P13K 0.79±0.16 0.54±0.12a 0.41±0.08a 0.22±0.03a 96.86 0.001

3 討論

手術(shù)切除和肝移植是目前治療肝癌的最佳方案，但介于多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)切除和肝移植并不適用；而介入治療操作難度較大，極易造成誤栓、分流、微轉(zhuǎn)移等情況發(fā)生；放療、化療對(duì)正常肝臟細(xì)胞損傷較大，且化療常因腫瘤耐藥性而導(dǎo)致療效效果欠佳[7]。因此，尋求安全有效的肝癌治療方法對(duì)于其臨床治療及預(yù)后具有重要意義。

中草藥在治療腫瘤上具有低毒副作用、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種中草藥對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用[8-9]。ART是治療瘧疾的經(jīng)典藥物，在治療重癥瘧疾以及耐藥性瘧疾上具有較好的治療效果。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，ART除了具有較好的抗瘧作用以外，還具有較好的抗腫瘤活性[10-11]，對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。尤楊等[12]研究表明，ART具有抑制肺腺癌A549 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的異常增殖和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的最重要機(jī)制，其中細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體正常生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而腫瘤細(xì)胞的凋亡受阻是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[13]。通過(guò)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是控制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵，也是臨床治療腫瘤的新的途徑。Ki-67 在細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志性蛋白，能夠較好反映細(xì)胞的增殖活性[14]。Bcl-2蛋白存在于線粒體膜，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞線粒體膜電位而抑制細(xì)胞凋亡[15]。Bax 能夠與Bcl-2 蛋白與形成二聚體：Bax 相對(duì)量高于Bcl-2 時(shí)，Bax 同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2相對(duì)量高于Bax時(shí)，Bcl-2同二聚體增加而抑制細(xì)胞凋亡[16]。

Caspase-3 蛋白在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行過(guò)程中發(fā)揮作用，是細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控蛋白，其表達(dá)反映了Caspases家族蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[17]。本研究結(jié)果顯示，ART 能夠顯著降低HepG2 細(xì)胞中Ki-67蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖率，同時(shí)能夠有效促進(jìn)Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)及HepG2 細(xì)胞凋亡。ART 能夠在一定程度上抑制HepG2 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且呈劑量依賴性。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲對(duì)于降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要意義。本研究結(jié)果表明，ART 能夠有效降低HepG2 細(xì)胞的遷移、侵襲以及細(xì)胞中MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)，ART 可抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號(hào)通路是惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制之一[18]。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可通過(guò)特異性催化使磷酸肌醇-3-位羥基發(fā)生磷酸化，產(chǎn)生肌醇脂物質(zhì)而進(jìn)一步激活或募集通路下游靶蛋白產(chǎn)生一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。AKT 是PI3K 的下游效應(yīng)基因，被激活后能夠促進(jìn)磷酸化發(fā)生，進(jìn)而激活或抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路的下游靶蛋白，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖或凋亡進(jìn)行調(diào)控[20]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的ART 作用于HepG2 細(xì)胞后，PI3K、p-P13K 和p-AKT 蛋白表達(dá)明顯降低。ART 濃度越高，PI3K、p-P13K 和p-AKT 蛋白表達(dá)越低。ART 可通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路活性而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

本研究存在一定局限性，首先只是從細(xì)胞水平上驗(yàn)證了ART對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，缺乏臨床樣本驗(yàn)證其臨床實(shí)用性；其次，本研究對(duì)于ART抑制肝癌HepG2細(xì)胞的具體機(jī)制缺乏深入研究，值得后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，ART對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且呈劑量依賴性，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。ART能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ki-67、Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP2、MMP9 等多種蛋白的表達(dá)以及PI3K/AKT 信號(hào)通路活性，抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。