子宮內(nèi)膜NK細胞在胚胎種植中的研究進展

黎俏 綜述 高天旸 審校

1.南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515；2.東莞康華醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東 東莞 523080；3.廣東省第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東 廣州 518025

最新證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)在生殖相關疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。子宮自然殺傷細胞(uNK)是天然免疫調節(jié)中的一種淋巴細胞亞群，是妊娠后母胎界面中重要的免疫細胞。早期人類對uNK 細胞在生殖系統(tǒng)的作用可能存在一些錯誤的認識，主要是基于對外周血自然殺傷(pbNK)細胞的相關研究，認為uNK細胞也有類似pbNK 的毒性作用，對生殖過程有不良影響。但越來越多的證據(jù)顯示，uNK 細胞和pbNK 細胞具有不同表型和功能特征，uNK在生殖過程中扮演有益的角色，是實現(xiàn)胚胎植入、維持妊娠的基礎保障。妊娠是一個免疫過程，因為兩個基因不同的個體并存。母體淋巴細胞里的T 細胞和大量獨特的uNK 細胞可以識別子宮母胎界面的胎盤細胞，存在多種避免T細胞損傷胎兒的保護機制，從而猜測uNK細胞的激活可能是生理性的，uNK細胞對胎盤細胞的同種異體識別成為調節(jié)胎盤功能的關鍵母嬰免疫機制。近年研究表明，uNK細胞與胚胎種植和早期胎盤功能等密切相關，其維持著胎兒和母體間的平衡，一旦失去平衡，就會導致反復著床失敗或復發(fā)性流產(chǎn)等妊娠相關疾病[2]。隨后廣泛的研究表明了uNK細胞在妊娠期間的各種作用，包括新血管的形成、滋養(yǎng)細胞的遷移和免疫耐受等。然而，目前還不清楚uNK細胞在正常和病理性妊娠中的具體功能，所以須謹慎對待任何抑制NK細胞的療法。本文就uNK細胞在胚胎種植過程中發(fā)揮作用的研究進展做一綜述。

1 母胎界面發(fā)育

母胎界面是子宮黏膜和胚胎的胚外組織的連接交界處，其作為兩個同種異體之間交流的平臺。滋養(yǎng)層細胞的侵入啟動母胎屏障的形成，這些滋養(yǎng)層細胞來源于胚胎的囊胚層以及子宮內(nèi)膜。在人類胚胎發(fā)育過程中，滋養(yǎng)層細胞分化為兩個亞群：絨毛滋養(yǎng)層(VTs)和絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVTs)。EVTs侵入血管內(nèi)壁，重建螺旋動脈，而VTs形成絨毛膜絨毛，絨毛膜絨毛位于絨毛的表面，具有向胎兒運輸營養(yǎng)和氧氣的能力[3]。滋養(yǎng)細胞是胚胎外組織中最常見的細胞類型，它們幫助在胎盤一側形成葉狀絨毛膜和底蛻膜以及在另一側形成絨毛膜羊膜。子宮內(nèi)膜通過蛻膜化的特殊組織反應來幫助胚胎及胎盤的發(fā)育和功能。蛻膜化是母胎關系發(fā)展的重要過程。其特征是黏膜基質細胞(ESCs)增殖分化為具有豐富細胞質的大塊球形細胞，以及蛻膜基質細胞的核和表型變化。隨著胚胎的擴張和細胞滋養(yǎng)層細胞的侵入生長，子宮內(nèi)膜布滿螺旋動脈的蛻膜。子宮腺體、基質細胞和免疫細胞共同作用以實現(xiàn)蛻膜化。胚胎發(fā)育的最重要條件之一是子宮內(nèi)膜蛻膜化。妊娠早期蛻膜化伴隨免疫細胞的增加，其占總蛻膜細胞的40%，這些細胞同時對子宮腺體及胎盤組織有營養(yǎng)作用。缺乏蛻膜化可能會導致其他一些妊娠相關的疾病[4]，如不孕癥、復發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)、胎兒子宮內(nèi)生長受限(IUGR)等。

2 NK細胞

2.1 NK細胞發(fā)育的細胞階段 免疫學家一直被母親和胎兒之間的聯(lián)系所吸引。Fukui 等[5]在1953 年首次描述了半異基因胎兒的存活情況，以此來說明母親對胎兒的免疫耐受性。近年來，主動免疫的概念得到了普及，支持植入部位的免疫系統(tǒng)不受抑制的觀點，說明它是功能性的。最近的研究結果表明，胎兒細胞和母親的免疫細胞包括先天淋巴細胞(ILC)、T調節(jié)細胞、巨噬細胞等，它們可進行雙向免疫對話[6]。在人類中，NK 細胞是一種高度特化的大顆粒淋巴細胞亞群，約占全部循環(huán)淋巴細胞的15%[7]。它們是大型細胞毒性先天淋巴細胞，可在免疫學上調節(jié)白細胞活化和實現(xiàn)微生物感染監(jiān)測。由于它們具有將病毒感染和癌細胞與健康細胞區(qū)分開來的潛力，無需預先致敏，因此被稱為“天然”殺手。IFN-γ和TNF-α是NK細胞分泌的兩種炎癥介質，它們介導細胞毒性并產(chǎn)生大量炎癥細胞因子[8]。NK 細胞存在于骨髓、肝臟、子宮、脾臟和肺中，也有少量發(fā)現(xiàn)在次級淋巴組織(SLT)、黏膜相關淋巴組織(MALT)和胸腺中[9]。與其他血細胞一樣，NK 細胞起源于骨髓來源的多能祖細胞，即CD34+造血干細胞(HSC)。人類NK 細胞的發(fā)育通過由各種細胞表面標志物受體的存在定義為多階段的分化過程，共分為五個階段[10]：第一階段，CD34+CD117+CD123+/+FLT3+；第二階段，CD34+CD117+CD123+FLT3+CD127+；第三階段，CD38+CD117+CD123+CD45+CD7+CD10+CD127+；第四階段，CD34+CD117+/+CD94+CD16+(也稱為CD56bright)；第五階段，CD34-CD117-/+CD94+CD16+(也稱為CD56dim)。CD56+CD16+和CD56-CD16+是基于CD16 表達的人類常見NK細胞的兩個亞群[11]。CD56+NK細胞群產(chǎn)生大量的IFN-γ，并隨著細胞因子IL-2、IL-12、IL-15或IL-18的增加而增殖，但它對靶細胞識別沒有反應并且具有低殺傷力。另一方面，CD56 缺陷型(CD56+)NK細胞大多具有細胞毒性，并且產(chǎn)生較少的IFN-γ。最近發(fā)現(xiàn)了一部分新的NK 細胞，即CD56-CD16-的NK 細胞亞群，其表面受體譜介于CD56+的和CD56-之間，能產(chǎn)生IFN-γ和細胞毒性[12]。

2.2 uNK細胞的起源 長期以來，研究人員一直好奇于妊娠期間uNK 細胞的起源。根據(jù)一項動物研究，子宮中NK細胞的形成和成熟與其他組織中的NK細胞發(fā)育具有一些共同特征，同時也表現(xiàn)出組織特異性，因此它們有利于塑造母胎界面發(fā)育過程中發(fā)生的結構變化[13]。也有人提出，免疫過程通過復雜的信號通路為uNK細胞活化、增殖和分化建立了一個平衡的環(huán)境[14]。曾有報道在小鼠處女子宮中，外周循環(huán)中的CD49a-DX5+cNK 細胞很少，但卻存在大量的CD49a+DX5+trNK細胞[15]。這些trNK細胞不同于肝臟和皮膚組織中發(fā)現(xiàn)的其他trNK 細胞，因為它們?nèi)狈-bet 轉錄因子的表達，并被識別為NK細胞的獨特譜。此外，在妊娠小鼠較處女小鼠子宮中發(fā)現(xiàn)高比例的trNK 細胞，表明其可能通過妊娠期間的局部增殖，同時trNK細胞可能有助于uNK 細胞的積累。此外，通過實驗誘導蛻膜化的試驗證實，在早期妊娠模型中，在trNK細胞局部增殖時，遷移的循環(huán)NK(cNK)細胞貢獻較少[16]。相反，Sojka等[14-15]2018年收集的數(shù)據(jù)并沒有真正忽略cNK細胞的貢獻，因為它們的數(shù)量也是從外周循環(huán)血積累的。因此作者提出了一個兩波假設[16]，以支持cNK細胞和trNK細胞在懷孕期間有利于對uNK細胞積累。第一波為在子宮內(nèi)膜重塑期間蛻膜化過程中開始。根據(jù)研究結果，這種波是由局部trNK細胞增殖引起的，cNK細胞對妊娠早期uNK細胞池的增長貢獻最小。第二波在形成胎盤過程中參與的cNK 細胞，包括血管重塑。缺乏cNK細胞但保留trNK細胞的小鼠，如Nfil3小鼠，在uNK細胞積累方面表現(xiàn)出顯著缺陷，胎盤不理想，螺旋動脈重塑異常?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明trNK 細胞和外周循環(huán)血cNK 細胞都是在妊娠期間的uNK細胞匯集中發(fā)揮作用的。

2.3 uNK 細胞的功能 uNK 細胞在月經(jīng)周期呈周期性表達特點，在妊娠后母胎界面表達顯著升高，受到甾體激素的精細調節(jié)。uNK 細胞通過其表達的受體與EVTs上配體相互作用，在維持免疫耐受、實現(xiàn)螺旋動脈重塑、控制滋養(yǎng)層侵襲和促進胎盤發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用[17]。uNK 細胞表達許多受體，包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)等，EVTs 表達I類HLA-C/E/G/F的MHC分子，具有高度多態(tài)性。KIR/HLA-C的不同組合與復發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇和胎兒生長受限等相關，影響妊娠結局。

3 反復著床失敗中的NK細胞的功能

當有證據(jù)表明沒有發(fā)生植入時，通常被診斷為植入失敗[18]。目前對于反復著床失敗(repeated/recurrent implantation failure，RIF)的定義診斷標準尚未統(tǒng)一，目前國內(nèi)外較為公認的RIF 定義是：經(jīng)歷3 次及以上移植周期，且累積移植至少4 枚卵裂期優(yōu)質胚胎而未獲臨床妊娠[19]。IVF/ICSI-ET周期中胚胎著床率約30%，反復著床失敗的發(fā)生率為5%～10%[20]。有研究表明RIF 經(jīng)常由有功能缺陷的子宮內(nèi)膜引起，約25%的RIF 患者種植窗發(fā)生置換，因此uNK 細胞在植入期的預測中起著重要作用，這表明它們可能導致胚胎植入失敗[21]。曾有研究報告顯示，與正?？缮龐D女組相比，有不明原因的反復植入失敗史的婦女在妊娠前子宮內(nèi)膜中存在更多數(shù)量的uNK細胞，從而推測uNK可能參與RIF[22]。此外，在分泌中期，與正常生育女性組對照相比，IVF 后患有RIF 的女性顯示出uNK 細胞在基質細胞中的比例顯著增加，同時顯示uNK細胞數(shù)量與IL-15 的基質表達相關。同樣，一項隊列研究發(fā)現(xiàn)，患有RIF 的女性子宮內(nèi)膜IL-12 或IL-18 水平較高，這可能與較高的uNK細胞數(shù)量有關[23]。另外一項研究發(fā)現(xiàn)，與IVF后胚胎著床的女性相比，RIF 女性的uNK 細胞與子宮內(nèi)膜小動脈的數(shù)量和分布沒有顯著差異[24]。在一項系統(tǒng)分析中，將患有RIF 的女性與對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中pNK 或uNK 細胞沒有差異[25]。綜上，目前各種研究的結果參差不齊，盡管在臨床研究中廣泛使用了各種細胞計數(shù)測量，但目前還沒有確鑿的證據(jù)表明uNK 細胞參與了妊娠病理。因此在RIF環(huán)境中檢測pbNK或uNK細胞需要進一步研究。

4 妊娠并發(fā)癥治療的免疫調節(jié)策略

正常的妊娠過程是母體免疫系統(tǒng)和胎兒抗原共同作用的結果，該免疫系統(tǒng)適應失敗可導致母胎發(fā)生同種免疫排斥反應，導致各種妊娠的相關并發(fā)癥。為了積極改變母體免疫系統(tǒng)或減少過度的免疫反應所產(chǎn)生的破壞，臨床上常用免疫調節(jié)藥物用于治療妊娠相關并發(fā)癥，如糖皮質激素、靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)和抗TNFα藥物等。先前的研究表明，適當?shù)膁NK(定位于基底蛻膜的uNK 細胞)細胞生理性能可確保健康懷孕，但降低dNK 細胞功能會導致妊娠失敗[26]。盡管dNK 細胞功能障礙的實際病因尚不清楚，但維持NK 細胞的正確激活狀態(tài)對于每次正常妊娠都至關重要，因此，其在抑制NK 細胞功能的治療中可能會增加風險。

自從發(fā)現(xiàn)NK 細胞代表著床和妊娠早期子宮內(nèi)膜基質的關鍵白細胞成分以來，臨床已經(jīng)對NK 細胞進行了很多研究。盡管在了解NK細胞的作用方面取得了重大進展，但人體組織的可用性和從動物模型推斷的局限性限制了臨床對妊娠早期階段的研究。uNK細胞的功能研究揭示了它們的功能，特別強調細胞因子和血管生成生長因子的釋放，以及妊娠早期的螺旋動脈重塑。研究表明NK 細胞計數(shù)在反復種植失敗患者中發(fā)生了改變，但其功能影響尚不清楚。在發(fā)現(xiàn)有效的診斷和治療方法之前，了解uNK 細胞數(shù)量增加的機制以及功能后果至關重要。此外，在未來的研究中，應研究男性變量(如精液成分)對uNK 細胞分化和反復著床失敗的可能影響。此外，了解子宮中不同細胞類型之間的串擾環(huán)境是有限的，未來的研究還應該闡明這些相互作用在各種生理和病理情況下的復雜性。

5 展望

uNK 細胞在水平上的研究仍存在技術上的局限性，因此仍有很多未知值得進一步探索，特別是關于uNK 細胞的確切起源和功能。復雜性是生殖免疫相關研究的主要特點，主要表現(xiàn)為參與分子的多樣性、效應作用水平的差異性(分子、細胞、組織水平等)，以及遺傳組合的多態(tài)性。未來利用新的分子和遺傳學方法進行研究有助于確定uNK 細胞與母胎界面其他細胞的相互作用機制，并在未來實現(xiàn)臨床轉化應用。基于既往pbNK 細胞的相關研究，目前臨床針對反復種植失敗(RIF)和復發(fā)性流產(chǎn)(RM)已開展不同的免疫治療方法，包括：父系淋巴細胞主動免疫、類固醇、TNFa 抑制劑、靜脈輸注免疫球蛋白(IVIG)、脂肪乳以及宮腔灌注重組人粒細胞集落刺激因子(r-GSF)等，用于治療uNK 細胞的“過度”免疫反應。但研究結果存在很大爭議，一些方法已逐漸被停用。此外，現(xiàn)有研究大多集中在尋找外周血中的標志物pbNK，并不直接針對uNK 細胞，對療法缺乏業(yè)內(nèi)共識，研究設計存在很大局限性。未來需要更多設計良好、樣本量更大的前瞻性隨機對照研究，以便更客觀、更完整地評估相關免疫療法的療效、可靠性，特別是關注這些治療方法的安全性。因此，對于相關“免疫療法”的臨床應用，仍應該保持謹慎的態(tài)度。