以結(jié)果驗證為導(dǎo)向的中醫(yī)學(xué)八年制Western Blot實踐教學(xué)

林玩福 梁淑芳 杜娟 翟笑楓 程彬彬

摘要 “實驗中醫(yī)學(xué)”是海軍軍區(qū)大學(xué)中醫(yī)學(xué)八年制學(xué)員的主干課程。其中WesternBlot是研究蛋白水平的基本方法，也是學(xué)員所必須掌握的實驗研究方法。本課程以結(jié)果驗證為導(dǎo)向的教學(xué)方式革新，最大限度壓縮每個步驟的操作時間，聚焦于讓學(xué)員完成最多的實驗步驟，力求實驗的完整性。該方法可在一堂課完成實驗，展示結(jié)果并進行分析討論。該教學(xué)方式有助于在最短時間內(nèi)掌握完整的Western Blot實驗技術(shù)，值得進一步推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 實踐教學(xué)；Western Blot；實驗中醫(yī)學(xué)

中圖分類號：G642文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2023.6.009

《“十四五”中醫(yī)藥發(fā)展規(guī)劃》提出：“推動中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展和走向世界，為全面推進健康中國建設(shè)、更好保障人民健康提供有力支撐”。中醫(yī)藥若想走向世界并獲得國際認(rèn)可，不僅需要客觀療效，還需要用現(xiàn)代科學(xué)語言去解釋傳統(tǒng)的中醫(yī)理論以及中藥的作用機制[1]。實驗中醫(yī)學(xué)是用現(xiàn)代實驗的方法和手段來研究中醫(yī)基礎(chǔ)理論、中醫(yī)診斷、中藥和方劑的一門學(xué)科，是現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)的一個重要組成部分[2]，對培養(yǎng)中醫(yī)藥創(chuàng)新型人才起著重要作用[3]。

海軍軍醫(yī)大學(xué)（以下簡稱“我?！保┯?014年在全國醫(yī)科院校率先開辦了中醫(yī)學(xué)專業(yè)八年制教育[4]。相較于浙江中醫(yī)藥大學(xué)等高校本碩一貫制的中醫(yī)八年制學(xué)員，我校該專業(yè)學(xué)員畢業(yè)授予博士學(xué)位。因此，其科研創(chuàng)新能力需以中醫(yī)學(xué)博士研究生的要求為基準(zhǔn)，意味著該學(xué)制學(xué)員需在更短的時間內(nèi)達到同樣的培養(yǎng)目標(biāo)[5-6]。實驗中醫(yī)學(xué)的教學(xué)內(nèi)容涵蓋了從整體動物、組織器官、細(xì)胞生物、生物分子學(xué)到組織形態(tài)學(xué)等不同層次的研究方法和技術(shù)及其在中醫(yī)藥科研中的應(yīng)用，經(jīng)過六年的教學(xué)探索與改革，該門課程已由原來的60學(xué)時大幅增加到現(xiàn)在的102學(xué)時，增加的課時以實驗課為主，尤其是分子生物學(xué)相關(guān)的實驗課程。并且該課程由最初的第三學(xué)年調(diào)整為第五學(xué)年授課，以便于學(xué)員科研選題設(shè)計和學(xué)位論文研究開展緊密銜接，學(xué)以致用。

Western Blot技術(shù)又名蛋白質(zhì)印跡法、免疫印跡法，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法，可實現(xiàn)對目的蛋白的定性定量及相互作用研究。WesternBlot實驗是蛋白質(zhì)水平的基本實驗方法，是學(xué)員必須掌握的[7]。常規(guī)Western Blot實驗通常需要1.5天，受課程安排限制，無法使學(xué)員在課堂完成完整的實驗。以往的實驗教學(xué)以視頻教學(xué)為主，同時觀摩其中個別操作為輔，對于初學(xué)者來說，很難理解該實驗的整體面貌，碎片化的實驗操作難以達到課程教學(xué)目標(biāo)。因此，我們通過對教學(xué)設(shè)計進行調(diào)整改革，以最終顯色條帶為檢驗標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果驗證導(dǎo)向進行Western Blot的實驗教學(xué)，獲得良好效果。

1課前準(zhǔn)備工作

由于時間關(guān)系，該實驗課聚焦于Western Blot實驗的操作及流程。在課前，教師提前準(zhǔn)備好提取的蛋白樣品，經(jīng)過變性及混入loading buffer后可在課堂上直接用于蛋白電泳。因時間有限，教師可在課前準(zhǔn)備好課堂使用的凝膠，在電泳過程中再演示及講解凝膠制備過程。此外，還需要準(zhǔn)備與本次實驗相關(guān)的儀器及耗材，如電泳液、濕轉(zhuǎn)液等。

2教學(xué)設(shè)計

本次實驗課是在前期理論講解WesternBlot的技術(shù)原理、操作的主要過程及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用情況的基礎(chǔ)上進行的，因此，本次實驗課主要進行WesternBlot的實驗操作。常規(guī)的Western Blot實驗需要1.5天時間，而本課程在確保步驟完整、結(jié)果可驗證的情況下，進行時間的極限壓縮，在4學(xué)時內(nèi)帶領(lǐng)學(xué)員完成抗體孵育、顯色及結(jié)果反饋，以便于學(xué)員理解完整的Western Blot實驗操作及結(jié)果呈現(xiàn)形式。具體教學(xué)設(shè)計如表1。

3實驗設(shè)置

在濕轉(zhuǎn)過程中，操作并講解Western Blot相關(guān)試劑的配置方法，包括電泳緩沖液、濕轉(zhuǎn)緩沖液、TBST等。本實驗采用的封閉液為5%脫脂牛奶緩沖液，按照1g脫脂奶粉加入20 mL1 TBST溶液的比例進行配制并充分混勻?，F(xiàn)已有制成品的封閉液、電泳緩沖液、濕轉(zhuǎn)緩沖液、TBST等，學(xué)員只需了解其原理即可，實驗過程中根據(jù)具體使用說明書操作。一抗二抗的配制按照抗體說明書的比例，用配制好的5%脫脂牛奶緩沖液進行稀釋。轉(zhuǎn)膜完成后，根據(jù)marker標(biāo)記出目標(biāo)蛋白的位置，然后用塑料薄膜將其覆蓋，裁取靶蛋白條帶，放入帶有封閉液的孵育盒中，室溫下?lián)u床上搖動封閉20min。

封閉完成的條帶放入含一抗緩釋液的孵育盒中，室溫條件下?lián)u床上搖動孵育45min。用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5―10min。二抗孵育45min，后用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5―10min，最后進行顯色。由于顯色劑具有光敏性，因此從配顯色劑開始至顯色完成均需注意避光，顯色液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。顯色的時間應(yīng)根據(jù)蛋白表達豐度決定，可以從短時間開始，如果曝光不理想則適當(dāng)延長曝光時間，應(yīng)注意曝光時間短顯色不明顯，同時也要避免曝光時間長，過度曝光占用條帶泳道影響結(jié)果解讀。將顯色結(jié)果通過班級群向?qū)W員反饋，并提出最終實驗結(jié)果的解讀及問題分析，指導(dǎo)學(xué)生完成實驗記錄。

4學(xué)員評價

學(xué)員評價分兩部分完成，第一部分是反饋結(jié)果并進行結(jié)果解讀和問題分析之后，提問學(xué)員對整個實驗的理解及感受，當(dāng)天進行實驗操作的評價，并將其記錄于實驗記錄中。第二部分評價由下次實驗課課前回顧完成，首先通過檢查學(xué)員關(guān)于Western Blot實驗的記錄本，因所有人均進行了相關(guān)的實驗操作，因此從記錄可以看出其真實學(xué)習(xí)及掌握情況，避免存在隨便抄寫實驗記錄的情況。其次通過提問，Western Blot實驗包括哪些部分，各部分的操作技巧及注意點等，客觀評價學(xué)員對該實驗的掌握情況。

5經(jīng)驗總結(jié)

Western Blot是蛋白水平研究的基礎(chǔ)分子生物學(xué)實驗之一，也是揭示中醫(yī)藥作用的分子機制、促進中醫(yī)藥發(fā)展的重要手段，是學(xué)員必須掌握的實驗研究方法[8-9]。既往的教學(xué)多以理論講解技術(shù)原理為主，即使是實驗操作課，由于時間的限制，往往只截取其中某一步驟讓學(xué)員進行體驗式操作，易造成碎片化理解的劣勢，無法真正為即將進行的學(xué)位論文研究打下堅實基礎(chǔ)。以結(jié)果驗證為導(dǎo)向的教學(xué)方式革新，以最大限度壓縮每個步驟的操作時間，聚焦于讓學(xué)員動手操作完成實驗的最多步驟，力求實驗的完整性，并在當(dāng)天完成實驗結(jié)果并進行分析討論，符合記憶特點，便于學(xué)員更好掌握。

當(dāng)然，該實驗方式也存在一些限制，首先受限于實驗儀器及教員數(shù)量，為達到最好的教學(xué)效果，該實踐教學(xué)僅適合于小班課（一般少于20人）。其次，由于大部分實驗步驟進行了時間壓縮，因此在操作間隙要不斷提示學(xué)員與常規(guī)操作的區(qū)別，闡述其中的技術(shù)原理，引導(dǎo)學(xué)員正確認(rèn)識。再者，通過結(jié)合視頻教學(xué)等方式，可以進一步強化學(xué)員對Western Blot技術(shù)的理解。

*通訊作者：程彬彬

基金項目：海軍院校重點建設(shè)教材——《實驗中醫(yī)學(xué)》。

參考文獻

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