越橘花青素的純化工藝及其食用安全性研究

◎ 郝長偉，柴發(fā)永

（1.包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟南 250014）

越橘是杜鵑花科植物，屬于低糖水果，味道酸甜可口，可鮮食，亦可制作果醬等食品。越橘中含有豐富的花青素，是一種天然抗氧化劑，具有抗氧化、保護視力、修復肌膚、調(diào)節(jié)血脂、抗癌癥等多種功效，其營養(yǎng)價值極高，是食品加工等領(lǐng)域的熱門原料[1]。但鮮有文章報道越橘花青素的純化工藝及其食用安全性，本試驗采用大孔樹脂吸附法對越橘花青素進行分離純化，通過單因素試驗確定其最佳工藝條件，并進行大鼠30 d喂養(yǎng)試驗，為高純度、高收率的越橘花青素純化工藝及其食用安全性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

越橘鮮果，莊河市光華村巴爾虎屯種植基地；乙醇、甲醇、HCl、NaOH均為分析純；超純水；SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

飛燕草素標準品（四川省維克奇生物科技有限公司），DM21大孔樹脂（山東魯抗立科藥物科技有限公司），AB-8大孔樹脂（天津南開大學化工廠），XAD-7HP大孔樹脂（北京慧德易科技有限責任公司），AB204-S型電子分析天平（德國Sartorius），HH-S8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司），SHZ-D Ⅲ型水浴恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），SJ-4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），TU-18010紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），BD-SW50光學顯微鏡（深圳市博視達光學儀器有限公司），URIT-8036全自動生化分析儀（成都一科儀器設(shè)備有限公司），N-1300S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）。

1.2 試驗方法

1.2.1 越橘花青素粗提液的制備

取適量越橘鮮果，壓榨后分離出果渣，加入50%乙醇，料液比為1∶6，提取溫度62 ℃，提取2次，每次2 h，合并提取液，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液，除去乙醇，用蒸餾水定容，得越橘花青素粗提液。

1.2.2 吸光度的測定

精密稱取飛燕草素對照品5 mg，加入2%鹽酸-甲醇定容至25 mL，精密稱取1 mL溶液于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇定容至刻度線，即為對照品溶液。精密稱取對照品溶液，加2%鹽酸-甲醇稀釋至飛燕草素質(zhì)量濃度為1.10 μg·mL-1、3.31 μg·mL-1、5.52 μg·mL-1、6.62 μg·mL-1、8.83 μg·mL-1。以2%鹽酸-甲醇溶液為空白，采用紫外可見分光光度法，測定540 nm波長處吸光度。以飛燕草素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得回歸方程y=0.099 6x+0.035 6，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。以2%鹽酸-甲醇作為空白試劑，取適量待測溶液，測定540 nm處吸光度。

1.2.3 大孔樹脂預處理

將大孔樹脂浸入95%乙醇溶液，室溫下浸泡24 h，去除樹脂表面吸附的雜質(zhì)和污染物，用蒸餾水清洗至pH值中性且無醇味，加入3% HCl水溶液室溫下浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值中性，徹底去除殘留的酸性物質(zhì)；加入3% NaOH溶液室溫下浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值中性，備用。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能研究

分別稱取2 g預處理好的XAD-7HP、AB-8、DM21大孔樹脂放入150 mL錐形瓶中，加入10 mL越橘花青素粗提液（吸光度值為A0），并封口置于搖床中，25 ℃恒溫振蕩12 h，測定溶液吸光度值A(chǔ)1，并計算3種大孔樹脂對越橘花青素的飽和吸附率。

分別取一定量已飽和的大孔樹脂，加入50 mL 80%酸性乙醇溶液，于25 ℃下振蕩解吸12 h，使吸附在大孔樹脂中的越橘花青素逐漸解吸，測定解吸后的溶液吸光度值A(chǔ)2，并計算3種大孔樹脂對越橘花青素的解吸率。

以大孔樹脂對越橘花青素的飽和吸附率和解吸率為指標，考察大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能，篩選出最佳的大孔樹脂。吸附率和解吸率計算如式（1）和式（2）所示。

1.2.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸試驗

稱取最佳大孔樹脂2 g，濾紙拭干表面水分，置于錐形瓶中，加入50 mL越橘花青素粗提液，封口振蕩，測定24 h溶液吸光度，計算吸附率，繪制靜態(tài)吸附平衡曲線。

取上述已吸附飽和的大孔樹脂于錐形瓶中，加入80%酸性乙醇溶液50 mL，封口振蕩，測定24 h溶液吸光度，計算解吸率，繪制靜態(tài)解吸平衡曲線。

1.2.6 大孔樹脂動態(tài)吸附、解吸試驗

（1）上樣液濃度的研究。分別取5份越橘花青素粗提液，加蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.4 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1，控制吸附流速相同，測定動態(tài)吸附試驗前后溶液吸光度值A(chǔ)，計算吸附率。

（2）上樣液pH值的研究。分別取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，調(diào)節(jié)溶液pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，控制流速相同，測定動態(tài)吸附試驗前后溶液吸光度值A(chǔ)，計算吸附率。

（3）吸附流速的研究。分別取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，控制溶液吸附流速分別為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1，測定動態(tài)吸附試驗前后溶液吸光度值A(chǔ)，計算吸附率。

（4）洗脫液濃度的研究。分別稱取5份2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，控制洗脫流速相同，加蒸餾水沖洗，另取相同用量的50%、60%、70%、80%、90%乙醇沖洗柱子，測定動態(tài)解吸試驗前后溶液吸光度值A(chǔ)，計算解吸率。

（5）洗脫液用量的研究。稱取2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，控制洗脫流速相同，加蒸餾水沖洗，另取乙醇沖洗柱子，每使用1 BV乙醇時收集1次洗脫液，進行動態(tài)解吸試驗，記錄溶液吸光度值A(chǔ)的變化。

（6）洗脫流速的研究。分別稱取5份2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，加蒸餾水沖洗，另取乙醇沖洗柱子，分別控制5個柱子洗脫流速為1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1、3.0 mL·min-1，測定動態(tài)解吸試驗前后溶液吸光度值A(chǔ)，計算解吸率。

1.2.7 最佳純化工藝參數(shù)驗證

根據(jù)試驗篩選出的最佳純化工藝參數(shù)，進行3次驗證試驗，以吸附率和解吸率為指標，進行純化工藝驗證，并測定花青素含量。

1.2.8 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

80只SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，隨機均分為對照組，越橘花青素低、中、高劑量組（1 g·kg-1、2 g·kg-1、4 g·kg-1）4組，低、中、高劑量組大鼠摻飼料喂食上述純化工藝而得的越橘花青素，對照組給予正常飲食，連續(xù)30 d。記錄各組大鼠一般情況、中毒及死亡情況。試驗結(jié)束后禁食16 h，取血測定血液指標、血清生化指標；處死大鼠，稱量肝、腎、脾、睪丸，計算臟器系數(shù)，取對照組和越橘花青素高劑量組大鼠主要臟器，進行病理學觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能分析

如表1結(jié)果顯示，吸附率、解吸率均為XAD-7HP＜AB-8＜DM21，其中DM21大孔樹脂對越橘花青素的吸附率、解吸率均在80%以上，故選DM21作為純化樹脂。

表1 3種大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能比較表

2.2 DM21大孔樹脂對越橘花青素的靜態(tài)試驗結(jié)果分析

2.2.1 越橘花青素靜態(tài)吸附平衡曲線

由圖1可知，2.5 h時吸附率達到81.54%，3 h時吸附率達到81.88%，3～24 h吸附率基本恒定?？紤]到生產(chǎn)效率，選擇最佳吸附時間為2.5 h。

圖1 靜態(tài)吸附平衡曲線圖

2.2.2 越橘花青素靜態(tài)解吸平衡曲線

由圖2可知，2 h時解吸率最大（93.45%），選擇最佳解吸時間為2 h。

圖2 靜態(tài)解吸平衡曲線圖

2.3 DM21大孔樹脂對越橘花青素的動態(tài)試驗結(jié)果

2.3.1 上樣液濃度對大孔樹脂吸附率的影響

由圖3可知，上樣液濃度為1.0 mg·mL-1時吸附率最大。上樣液濃度繼續(xù)增加，部分雜質(zhì)被大孔樹脂吸附，影響大孔樹脂吸附花青素能力，降低了吸附率。因此，最佳上樣液濃度為1.0 mg·mL-1。

圖3 上樣液濃度對大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.2 上樣液pH值對大孔樹脂吸附率的影響

由圖4可知，當pH值為1.0～3.0時，大孔樹脂吸附率逐漸增加，增加趨勢較小，當pH值超過3.0時，吸附率顯著下降，可能由于酸性環(huán)境減弱，樣液中部分花青素在吸附前已分解，導致花青素含量減少，吸附率降低[3-4]。故調(diào)節(jié)上樣液pH值為3.0后再進行吸附。

圖4 上樣液pH值對大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.3 吸附流速對大孔樹脂吸附率的影響

由圖5可知，當吸附流速到達1.5 mL·min-1時，吸附率最高。吸附流速繼續(xù)增加，吸附率降低，可能是吸附流速過快，上樣液中花青素與大孔樹脂接觸不充分，易出現(xiàn)過早泄露情況，導致吸附率降低[5]。因此，選擇流速為1.5 mL·min-1進行吸附。

圖5 吸附流速對大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.4 洗脫液濃度對大孔樹脂解吸率的影響

由圖6可知，當乙醇濃度為80%時，解吸率出現(xiàn)最大值。研究顯示，花青素與乙醇溶液、大孔樹脂之間均存在分子間作用力，兩個作用力處于平衡狀態(tài)時，大孔樹脂吸附的花青素易被洗脫至乙醇溶液中[4]。因此，選擇80%乙醇作為洗脫液。

圖6 洗脫液濃度對大孔樹脂解吸率的影響圖

2.3.5 洗脫液用量對大孔樹脂解吸率的影響

由圖7可知，從3 BV起始，隨著洗脫液用量繼續(xù)增加，溶液吸光度值趨向平穩(wěn)狀態(tài)。因此，選擇洗脫液用量為3 BV。

圖7 洗脫液用量對大孔樹脂解吸率的影響圖

2.3.6 洗脫流速對大孔樹脂解吸率的影響

由圖8可知，隨著洗脫流速的增加，解吸率先升高后降低。主要因為洗脫流速過快，洗脫液無法充分接觸大孔樹脂，花青素析出量減少，導致解吸率降低[5]。因此，選擇2.0 mL·min-1作為洗脫速率。

圖8 洗脫流速對大孔樹脂解吸率的影響圖

2.4 最佳純化工藝參數(shù)驗證

選用DM21大孔樹脂進行吸附，上樣液濃度為1.0 mg·mL-1，pH值為3.0，吸附流速為1.5 mL·min-1，吸附2.5 h；選擇80%乙醇作為洗脫液，洗脫流速為2.0 mL·min-1，洗脫液用量為3 BV（即60 mL），洗脫2 h。在此基礎(chǔ)上進行工藝驗證，并測定花青素含量，結(jié)果見表2。

表2 工藝驗證試驗結(jié)果表

2.5 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗結(jié)果

2.5.1 大鼠一般情況、中毒及死亡情況

試驗期間，各組大鼠生長發(fā)育良好，未見異常體征，行為活動正常，攝食攝水如常，無中毒及死亡情況。

2.5.2 大鼠血液、血清指標及主要臟器系數(shù)結(jié)果

與對照組相比，給予大鼠不同劑量越橘花青素30 d后，越橘花青素各劑量組大鼠血液學指標（紅細胞數(shù)、血紅蛋白、血小板、血細胞數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞和其他細胞）、血清生化指標（谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血糖、肌酐和尿素氮）及臟器系數(shù)（肝重、肝/體重、腎重、腎/體重、脾重、脾/體重、睪丸重和睪丸/體重）均無顯著性差異。

2.5.3 病理學組織檢查結(jié)果

各組大鼠主要臟器外形、體積、色澤、構(gòu)造均未見異常；顯微鏡下觀察，各組大鼠主要臟器組織未見明顯病理變化。

3 結(jié)論與討論

大孔樹脂是一種經(jīng)濟、可持續(xù)和環(huán)保的分離純化技術(shù)，對不同種類的花青素具有選擇性吸附，可以在純化過程中達到高效、高選擇性和高質(zhì)量的目標[6]。本試驗選用最佳吸附樹脂DM21進行越橘花青素純化試驗，得到最佳純化工藝：上樣液濃度1.0 mg·mL-1、上樣液pH=3.0、吸附流速1.5 mL·min-1、吸附2.5 h；洗脫劑濃度80%、洗脫液用量為3 BV（60 mL）、洗脫流速2.0 mL·min-1、洗脫2 h。經(jīng)驗證，純化工藝穩(wěn)定，越橘花青素含量最高可達27.1%。經(jīng)大鼠30 d喂養(yǎng)試驗，越橘花青素各劑量組與對照組比較，各檢驗項目均無顯著性差異，主要臟器組織無明顯損傷性病理變化，說明越橘花青素無毒性作用。越橘花青素是目前發(fā)現(xiàn)最有效的植物抗氧化劑，應用前景廣闊，值得進一步深入研究。