熱處理香榧種子油中美拉德產(chǎn)物的生成及其對(duì)兩種總酚測(cè)定方法的影響

許曉君，羅 凡，方學(xué)智，杜孟浩，胡立松，龍奇志，鐘海雁

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

酚類物質(zhì)可清除或減少自由基、螯合過渡金屬離子、抑制氧化應(yīng)激酶活性并促進(jìn)抗氧化劑發(fā)揮作用，具有抗氧化和抗癌等功效[1]，是植物油等食品中的功能活性成分之一，也是維持油脂氧化穩(wěn)定性的關(guān)鍵成分。目前酚化合物的測(cè)定主要基于分光光度法、光譜法、比色法、酶法、電化學(xué)法和色譜技術(shù)等，其中基于分光光度法的福林-酚法在總酚測(cè)定中應(yīng)用廣泛。福林-酚法測(cè)定總酚的基本原理是：在堿性條件下，福林-酚試劑（磷鉬酸-磷鎢酸）被酚羥基還原，生成藍(lán)色化合物，后者在堿性環(huán)境中可被氧化成醌類化合物，該物質(zhì)在765 nm波長處可被紫外-可見分光光度計(jì)檢出[2]。由于福林-酚法操作簡單且反應(yīng)迅速，橄欖油[3]、葵花籽油[4]、花生油[5]及茶油[6]等植物油的總酚定量多采用該法進(jìn)行。然而，該法選擇性較差，試樣中除酚化合物外的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、不飽和脂肪酸、維生素、醛、酮等物質(zhì)都可能會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。Kanzler等[7]發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn) 物——二羰基化合物具有還原福林-酚試劑的潛力，但目前針對(duì)活性美拉德產(chǎn)物干擾植物油總酚含量及方法改良的研究尚少。

研究[8-9]發(fā)現(xiàn)固藍(lán)BB鹽（fast blue BB，F(xiàn)BBB）的重氮基團(tuán)與帶活性羥基的芳香環(huán)可耦合生成穩(wěn)定的偶氮衍生物，該物質(zhì)在420 nm波長處可被紫外-可見分光光度計(jì)檢出，由此開發(fā)出了一種新的酚化合物定量方 法——FBBB法?；谠摲ǖ臏y(cè)定原理，食品基質(zhì)中VC和還原糖等物質(zhì)的存在不會(huì)對(duì)總酚定量造成干擾，說明FBBB法的選擇性更優(yōu)、定量準(zhǔn)確可靠。Nowak[10]和López-Froilán[11]等的研究結(jié)果皆證實(shí)了FBBB法不受VC干擾的觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了該法在水果飲料總酚測(cè)定上的應(yīng)用潛力。Lester等[12]在測(cè)定添加了VC和果葡糖漿飲料的總酚時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BBB法測(cè)得的沒食子酸當(dāng)量值高于福林-酚法，體現(xiàn)了FBBB法測(cè)定總酚的高靈敏度。Pico等[13]比較了兩法在豆類、谷物、水果、堅(jiān)果和植物種子的總酚測(cè)定中受干擾的程度，發(fā)現(xiàn)FBBB法不易受影響。然而，目前FBBB法主要應(yīng)用于水相基質(zhì)的總酚測(cè)定中，Siano等[14]研究了FBBB法直接測(cè)定不同橄欖油總酚的可能性，發(fā)現(xiàn)相較于福林-酚法，F(xiàn)BBB法的測(cè)定結(jié)果更接近于液相色譜法，但該法在其他食用植物油中的應(yīng)用研究仍有欠缺。

香榧籽是紅豆杉科榧屬常綠喬木香榧（Torreya grandiscv.Merrilli）的果實(shí)，其含油率高且油脂的營養(yǎng)和活性成分豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。熱處理是香榧種子油制備工藝中必不可少的加工環(huán)節(jié)，不僅可以降低水分還可以提高出油率并賦予油脂特征風(fēng)味。Shi Longkai等[15]還發(fā)現(xiàn)熱壓香榧種子油比冷壓油具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

本研究以分析兩種方法（福林-酚法與FBBB法）在測(cè)定相同熱預(yù)處理香榧種子油總酚時(shí)存在差異的原因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，通過測(cè)定油脂褐變指數(shù)及3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）、丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和5-羥甲基糠醛（5-(hydroxymethyl)furfural，5-HMF）3 種常見美拉德產(chǎn)物含量驗(yàn)證美拉德反應(yīng)的發(fā)生，隨后進(jìn)一步考察3 種產(chǎn)物對(duì)福林-酚法和FBBB法測(cè)定總酚的影響，為美拉德產(chǎn)物對(duì)福林-酚法測(cè)定油脂中總酚的影響研究提供依據(jù)，也為總酚測(cè)定方法的科學(xué)選擇提供一定支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧籽購自杭州富陽洪鑫農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)自然晾干后置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，分別在0、60、90、120、150 ℃加熱0、30、60、90、120 min后取出。冷卻、脫殼后液壓制油，香榧種子油經(jīng)過濾后于4 ℃貯藏備用。

福林-酚試劑、MGO（純度98%）、鄰苯二胺（純度99.5%）上海麥克林生化科技有限公司；FBBB、沒食子酸（純度99%）、5-HMF（純度98%）美國Sigma-Aldrich公司；3-DG（純度75%）加拿大Toronto Research Chemicals公司；正己烷、甲醇（均為色譜純）、冰醋酸（分析純）、碳酸鈉、氫氧化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；源豐液壓榨油機(jī) 洛陽市佳源機(jī)械有限公司；S-114電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；XW-80A旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津 公司；Q-101平行蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；V-500多管真空固相萃取裝置、LC-10AT型液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測(cè)器和CDS A.02.19色譜工作站）美國 安捷倫公司；二醇基固相萃取柱（500 mg，3 mL）美國Agela公司；有機(jī)相針式濾器（13 mm，0.22 μm）上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香榧種子油總酚的提取與測(cè)定

1.3.1.1 香榧種子油總酚提取液的制備

參考Flores等[16]的方法并略作修改。用10 mL甲醇和10 mL正己烷先后淋洗二醇基固相萃取柱，活化后備用。分別稱取2 g不同加熱條件所制香榧種子油（1.1節(jié)）溶于5 mL正己烷中，混合均勻后過已活化的二醇基固相萃取柱，用10 mL正己烷過柱清洗后再用10 mL甲醇洗脫固相萃取柱。收集洗脫液，于40 ℃蒸干，用50%甲醇復(fù)溶后得香榧種子油總酚提取液。

1.3.1.2 福林-酚法測(cè)定總酚

參考Huang Zhiting等[17]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1節(jié)中制備的香榧種子油總酚提取液，加入0.5 mL福林-酚試劑，反應(yīng)3 min后加入1 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL后顯色90 min，于765 nm波長處測(cè)定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以每克樣品中沒食子酸當(dāng)量表示（μg/g）。

1.3.1.3 FBBB法測(cè)定總酚

參考Medina[9]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1節(jié)中制備的香榧種子油總酚提取液，加入8 mL去離子水與0.5 mL 0.1% FBBB試劑，充分混合后加入0.5 mL 5%氫氧化鈉溶液，混勻后顯色90 min，于420 nm波長處測(cè)定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以每克樣品中沒食子酸當(dāng)量表示（μg/g）。

1.3.2 香榧種子油褐變指數(shù)與美拉德產(chǎn)物的測(cè)定

1.3.2.1 褐變指數(shù)測(cè)定

參考Zhang Nana等[18]的方法并略作修改。分別稱取0.5 g不同預(yù)熱條件所制香榧種子油，用正己烷（1∶10，g/mL）溶解稀釋，分別于294、420 nm波長處測(cè)定吸光度。

1.3.2.2 3-DG、MGO測(cè)定

參考楊楠等[19]的方法并略作修改。分別稱取0.5 g不同加熱條件所制香榧種子油，用甲醇萃取3 次后定容至10 mL得美拉德產(chǎn)物提取液，冷藏備用。取2 mL美拉德產(chǎn)物提取液與1 mL 0.25 mg/mL的鄰苯二胺溶液混合，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH值至9后置于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h，衍生處理樣液過0.45 μm濾膜后應(yīng)用高效液相色譜儀測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇后的處理與測(cè)定同上。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.8 mL/min；流動(dòng)相：A為0.1%冰醋酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0.01～15 min，72%～57% A、28%～43% B；15.01～31 min，57%～25% A、43%～75% B；31.01～38 min，25%～72% A、75%～28% B；38.01～60 min，72% A、28% B；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長314 nm。

1.3.2.3 5-HMF測(cè)定

取2 mL 1.3.2.2節(jié)所制備的美拉德產(chǎn)物提取液，過0.45 μm濾膜后應(yīng)用高效液相色譜儀測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇后的處理與測(cè)定同上。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；以50%甲醇溶液為流動(dòng)相；洗脫時(shí)間15 min；流速0.7 mL/min；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長280 nm。

1.3.3 美拉德產(chǎn)物對(duì)總酚測(cè)定的影響

1.3.3.1 福林-酚法、FBBB法測(cè)定3-DG、MGO及5-HMF溶液

用甲醇分別溶解MGO、3-DG和5-HMF，配制成質(zhì)量濃度梯度為0、42.4、84.8、127.2、169.6、212 μg/mL的溶液，分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節(jié)中的總酚提取液進(jìn)行福林-酚法與FBBB法的總酚測(cè)定。

1.3.3.2 3-DG的存在對(duì)沒食子酸溶液總酚測(cè)定的影響

3-DG對(duì)不同質(zhì)量濃度沒食子酸溶液總酚測(cè)定的影響：配制100 μg/mL 3-DG甲醇溶液，分別與0、40、80、100、160、200、300 μg/mL沒食子酸溶液等體積混合，配制成不同質(zhì)量濃度比（沒食子酸∶3-DG＝0～3）的復(fù)合溶液。將復(fù)配溶液分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節(jié)中的總酚提取液進(jìn)行福林-酚法與FBBB法的總酚測(cè)定。

不同質(zhì)量濃度3-DG對(duì)沒食子酸溶液總酚測(cè)定的影響：配制100 μg/mL沒食子酸甲醇溶液，分別與0、20、50、100、200、300、500、600 μg/mL 3-DG甲醇溶液等體積混合，配制成不同質(zhì)量濃度比（3-DG∶沒食子酸＝0～6）的復(fù)合溶液備用。將復(fù)配溶液分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節(jié)中的總酚提取液進(jìn)行福林-酚法與FBBB法的總酚測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)平均值。分別采用Microsoft Excel 2010軟件與Origin Pro 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱處理對(duì)香榧種子油總酚含量的影響

圖1A顯示，福林-酚法測(cè)定下，香榧籽在60 ℃與120 ℃處理60～90 min、150 ℃處理時(shí)間超過60 min時(shí)，油樣中總酚含量顯著升高（P＜0.05），這與羅凡等[20]對(duì)油茶籽油的研究結(jié)果一致。一些酚類物質(zhì)往往與蛋白質(zhì)結(jié)合，加熱條件下蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性，導(dǎo)致這部分結(jié)合酚釋放[21]；還可能是因?yàn)榧訜嵋种屏酥鹾厦傅幕钚?，減少了自由基的生成，從而延緩了酚含量的下降。除上述原因外，香榧籽加熱引發(fā)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的某些還原性物質(zhì)可能參與酚類物質(zhì)和福林-酚試劑的反應(yīng)導(dǎo)致總酚測(cè)定結(jié)果偏大。與未經(jīng)熱處理香榧種子油相比，加熱引起油樣中總酚含量普遍下降，最大降幅為67%（60 ℃、120 min）。這可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)具有熱不穩(wěn)定性，高溫破壞羥基酸等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，造成總體含量下降[22]；還可能與還原性美拉德產(chǎn)物發(fā)生降解，而降解產(chǎn)物不具有還原酮等抗氧化基團(tuán)結(jié)構(gòu)[23]有關(guān)。

圖1 福林-酚法（A）、FBBB法（B）測(cè)定熱處理香榧種子油的總酚含量Fig.1 Total phenolic contents of heat-treated Torreya grandis cv.Merrilli seed oil determined by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

圖1B顯示，F(xiàn)BBB法測(cè)定中，香榧籽在150 ℃熱處理90～120 min時(shí)，總酚含量隨加熱時(shí)間的延長顯著減?。≒＜0.05），這與相同條件下福林-酚法的測(cè)定結(jié)果相反，該差異可能與美拉德產(chǎn)物對(duì)兩法的干擾程度不同有關(guān)。多數(shù)美拉德產(chǎn)物不具有帶活性羥基的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，無法與FBBB試劑的重氮基團(tuán)耦合生成穩(wěn)定的偶氮衍生物，F(xiàn)BBB法不受這類美拉德產(chǎn)物的干擾。此外，還發(fā)現(xiàn)采用兩種方法測(cè)定相同的酚提取液，F(xiàn)BBB法測(cè)得的沒食子酸當(dāng)量值總體高于福林-酚法，這與Lester等[12]的研究結(jié)果一致，可能與沒食子酸在不同反應(yīng)體系中的響應(yīng)存在差異有關(guān)。

2.2 熱處理香榧種子油中美拉德產(chǎn)物的測(cè)定

2.2.1 加熱處理對(duì)香榧種子油褐變指數(shù)的影響

圖2A顯示，在294 nm波長處，相同預(yù)處理時(shí)間下香榧種子油的吸光度總體隨加熱溫度的升高而增大。低溫（60、90 ℃）預(yù)處理下，90 min后香榧種子油在294 nm波長處的吸光度明顯增大；而在高溫（120、150 ℃）預(yù)處理下，香榧種子油的吸光度更早地開始逐步升高，表明低溫長時(shí)熱處理及高溫處理皆會(huì)促進(jìn)美拉德中間產(chǎn)物的形成。Haase等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)溫度改變會(huì)顯著影響二羰基化合物等美拉德中間產(chǎn)物的形成和積累。圖2B顯示，在420 nm波長處，60 ℃低溫下香榧種子油吸光度隨加熱時(shí)間的延長變化不顯著（P＞0.05），經(jīng)90 ℃處理油脂在加熱60 min后吸光度顯著升高（P＜0.05），而在120、150 ℃油脂吸光度升高的時(shí)間點(diǎn)皆有所提前，分別為30 min和0 min。此外，油脂在90、120 ℃下加熱超過90 min后吸光度顯著下降（P＜0.05），這可能與長時(shí)熱處理下美拉德產(chǎn)物的降解速率大于生成速率有關(guān)。150 ℃高溫處理下，香榧種子油的吸光度在加熱超過60 min后持續(xù)升高，推測(cè)有美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物大量形成。上述現(xiàn)象表明，對(duì)香榧籽進(jìn)行一定程度的熱處理會(huì)促進(jìn)油脂中美拉德產(chǎn)物的形成，且其濃度受加熱溫度和時(shí)間的影響。

圖2 不同熱處理香榧種子油在294（A）、420 nm（B）波長處的吸光度Fig.2 Absorbance at 294 (A) and 420 nm (B) of heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil

2.2.2 熱處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的測(cè)定

課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)在經(jīng)二醇基小柱萃取所得的總酚提取液中有多種美拉德產(chǎn)物的存在。因此對(duì)不同溫度、時(shí)間預(yù)處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算其在總酚提取液中的質(zhì)量濃度，如表1所示。

表1 不同熱處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量及其在 酚提取液中的質(zhì)量濃度Table 1 Contents of 3-DG,MGO and 5-HMF in heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil and concentrations of 3-DG,MGO and 5-HMF in phenolic extract from the oil

MGO是活性C6-α-二羰基化合物裂解形成的短鏈α-二羰基化合物[24]，在各加熱條件的香榧油樣中皆有檢出，含量范圍為0.67～1.73 μg/g，略高于同條件下油茶籽油[25]中檢出的MGO含量，這可能與不同油料種子中糖類與氨基酸的組成與含量存在差異、MGO前體物質(zhì)的積累等因素有關(guān)。3-DG屬于二羰基類化合物，是影響食品基質(zhì)中美拉德產(chǎn)物組成的重要前體物質(zhì)[26-27]，5-HMF是其主要降解產(chǎn)物[28]。兩種物質(zhì)僅在經(jīng)150 ℃熱處理的油樣中檢出，且含量隨加熱時(shí)間的延長而不斷增加，含量范圍分別為0.21～0.47、0.06～0.40 μg/g，這可能是因?yàn)檫m當(dāng)提高加熱強(qiáng)度能促進(jìn)3-脫氧半乳糖等同類二羰基化合物向3-DG轉(zhuǎn)化[29]；還能加速糖類物質(zhì)的脫水或同質(zhì)異構(gòu)化，促進(jìn)了5-HMF的產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，香榧種子中的3-DG或同類活性二羰基化合物主要裂解形成了短鏈α-二羰基化合物，而在高溫長時(shí)下還會(huì)發(fā)生降解，產(chǎn)物經(jīng)榨油工藝轉(zhuǎn)移至香榧種子油中。

2.3 美拉德產(chǎn)物對(duì)總酚測(cè)定的影響

2.3.1 美拉德產(chǎn)物對(duì)福林-酚法及FBBB法測(cè)定總酚的影響

圖3A顯示，在0～212 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，福林-酚法測(cè)定下3-DG組的吸光度隨質(zhì)量濃度增大呈線性升高（相關(guān)系數(shù)（R2）＝0.998），且在765 nm波長處的響應(yīng)強(qiáng)于其他兩組。MGO組的吸光度雖隨質(zhì)量濃度增大呈線性升高（R2＝0.966），但升高幅度不大，說明α-二羰基化合物及其復(fù)合物解聚后還原能力減弱。5-HMF 組的吸光度隨質(zhì)量濃度增大變化不顯著（P＞0.05），表明α-二羰基化合物降解后基本失去對(duì)福林-酚試劑的還原能力。結(jié)果表明，MGO和3-DG的存在會(huì)對(duì)福林-酚法測(cè)定樣品總酚造成一定的干擾，且3-DG的影響最大，而5-HMF的影響不明顯。圖3B顯示，在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)BBB法測(cè)定下3 種美拉德產(chǎn)物在420 nm波長處測(cè)得的吸光度變化不顯著（P＞0.05）。結(jié)合2.2.2節(jié)中3-DG、MGO分別在150 ℃油樣、所有油樣中檢出，圖1中兩法在150 ℃、90 min后總酚測(cè)定結(jié)果的差異可能與MGO和3-DG的存在對(duì)福林-酚法的干擾有關(guān)，但由于兩種產(chǎn)物在香榧種子油總酚提取液中濃度較低，其對(duì)測(cè)定的干擾程度仍有待探究。

圖3 3 種美拉德產(chǎn)物對(duì)福林-酚法（A）、FBBB法（B）測(cè)定總酚的影響Fig.3 Effects of three MRPs on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

2.3.2 3-DG對(duì)總酚測(cè)定的影響

2.3.1 節(jié)的研究結(jié)果表明，3 種美拉德產(chǎn)物中3-DG對(duì)福林-酚法測(cè)定樣品總酚的影響最大，進(jìn)一步考察該物質(zhì)對(duì)不同質(zhì)量濃度沒食子酸體系總酚測(cè)定的影響及其質(zhì)量濃度變化對(duì)兩種總酚測(cè)定方法的干擾，結(jié)果分別如 圖4、5所示。

圖4 3-DG對(duì)福林-酚法（A）、FBBB法（B）測(cè)定不同質(zhì)量濃度 沒食子酸體系總酚的影響Fig.4 Effects of 3-DG on the quantification of total phenolics in gallic acid systems by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

圖4顯示，在兩法測(cè)定下，單一組和復(fù)合組的總酚含量與沒食子酸質(zhì)量濃度線性關(guān)系均良好，福林-酚法R2分別為0.997和0.995，F(xiàn)BBB法R2分別為0.989和0.996。相同沒食子酸添加質(zhì)量濃度下福林-酚法測(cè)定復(fù)合組總酚含量高于單一組，測(cè)定差值隨沒食子酸質(zhì)量濃度變化差異不顯著（P＞0.05），表明3-DG的存在會(huì)造成福林-酚法測(cè)定結(jié)果偏大且干擾程度與樣品總酚含量無關(guān)，樣品中總酚含量越低，測(cè)定結(jié)果誤差越大。此外，福林-酚法對(duì)兩組總酚的測(cè)定差值大于FBBB法，說明3-DG對(duì)前者的影響較大，該發(fā)現(xiàn)與2.3.1節(jié)的研究結(jié)果一致。因此，針對(duì)鷹嘴豆[30]、燕麥[31]及植物油[32]等這類加工過程可能經(jīng)歷膨化、焙烤及熱預(yù)處理等工藝而總酚含量又相對(duì)較低的食品，選擇FBBB法進(jìn)行總酚定量可有效減小因美拉德產(chǎn)物存在而引起的誤差。

圖5A顯示，添加3-DG質(zhì)量濃度不小于25 μg/mL情況下，福林-酚法測(cè)定復(fù)合組的總酚含量顯著大于沒食子酸組（P＜0.05），且隨著3-DG質(zhì)量濃度的增大，總酚含量呈線性增大趨勢(shì)（R2＝0.998），表明3-DG對(duì)該法測(cè)定總酚的影響具有濃度依賴性。Nederal等[33]研究發(fā)現(xiàn)，南瓜籽經(jīng)加熱后榨取的油脂中美拉德活性產(chǎn)物濃度與總酚含量提升明顯，并將后者歸因于結(jié)合態(tài)酚向游離態(tài)酚的轉(zhuǎn)變；本研究結(jié)果說明，該現(xiàn)象還可能與美拉德活性產(chǎn)物引起福林-酚法定量誤差有關(guān)。圖5B顯示，F(xiàn)BBB法測(cè)定下，隨著3-DG質(zhì)量濃度的增大，復(fù)合組的總酚含量與沒食子酸組相比皆無顯著變化（P＞0.05），表明在此實(shí)驗(yàn)體系下3-DG質(zhì)量濃度改變對(duì)FBBB法的干擾有限。

圖5 3-DG質(zhì)量濃度變化對(duì)福林-酚法（A）、FBBB法（B）測(cè)定總酚的影響Fig.5 Effect of 3-DG concentration on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

3 結(jié)論

香榧籽在150 ℃熱處理90～120 min時(shí)，福林-酚法測(cè)得油脂總酚含量上升，而FBBB法測(cè)定結(jié)果與之相反。對(duì)香榧種子油褐變指數(shù)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)低溫長時(shí)熱處理及高溫處理皆會(huì)引起香榧種子油在294 nm波長處吸光度上升，指示美拉德中間產(chǎn)物的形成。在經(jīng)高溫（150 ℃）處理的油樣中檢出了3-DG（0.21～0.47 μg/g）與5-HMF（0.06～0.40 μg/g），在各預(yù)熱條件的油樣中皆檢出了MGO（0.67～1.73 μg/g）。進(jìn)一步考察3 種美拉德產(chǎn)物對(duì)兩種方法測(cè)定總酚的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，福林-酚法測(cè)定下3-DG、MGO在765 nm波長處的吸光度皆隨質(zhì)量濃度增大呈線性升高，同質(zhì)量濃度3-DG、MGO與5-HMF在此波長處的響應(yīng)排序?yàn)?-DG＞MGO＞5-HMF，3-DG的存在會(huì)造成福林-酚法測(cè)定結(jié)果偏大且干擾程度與樣品總酚含量無關(guān)，而與其本身質(zhì)量濃度呈正相關(guān)；FBBB法測(cè)定下，3 種美拉德中間產(chǎn)物在420 nm波長處的吸光度變化皆不顯著。因此，針對(duì)加工過程中易形成3-DG、MGO的食品基質(zhì)，選擇FBBB法替代福林-酚法測(cè)定總酚可降低這兩種物質(zhì)對(duì)定量的干擾。