三種游離核酸提取試劑盒對血漿cfDNA提取性能的比較

應(yīng)超 蔡燕寧， 郝淑文，5 王婷 劉沅賀 趙立芳

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院1神經(jīng)生物學(xué)研究室，4臨床樣本中心（北京 100053）；2教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100053）；3國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京 100053）；5河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（石家莊 050031）

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）指體液中游離于細(xì)胞外的高度片段化DNA，其來源，包括核基因組（cell-free nuclear DNA，cf-nDNA）、線粒體基因組（cell-free mitochondrial DNA，cf-mtDNA）等［1］。cfDNA 片段大小分布可能提示其來源。例如，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生160～180 bp DNA，而大于200 bp 的DNA 片段則通常來自壞死［2］。在一些病理狀態(tài)下，如腫瘤、炎癥等，血液中cfDNA 濃度會異常增加［3］。在癌癥研究中，cfDNA 是一種具有很大潛力的生物標(biāo)志物，尤其是其包含從腫瘤中脫落的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），而ctDNA 攜帶與癌細(xì)胞相同的突變和甲基化模式［4-5］，這使得微創(chuàng)地進(jìn)行腫瘤早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及治療藥物反應(yīng)成為了可能［6-8］。

cfDNA 的低濃度和高度片段化限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的發(fā)展［9-10］。為了最大程度提高cfDNA產(chǎn)量并減少異常疾病信號的損失，有效地提取方法至關(guān)重要。商業(yè)化的cfDNA 提取試劑盒通常基于硅膠膜離心柱法以及磁珠法兩種原理。然而不同品牌之間的差異導(dǎo)致提取效果良莠不齊，因此我們需要對不同試劑盒進(jìn)行評價(jià)。在本研究中，我們采用了Agilent 2100 生物芯片分析儀、微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qPCR）等常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從提取效率、片段大小分布、回收率等方面評價(jià)了德國Qiagen 公司的Circulating Nucleic Acid Kit（硅膠膜離心柱法）以及兩種基于磁珠法的國產(chǎn)試劑盒，旨在找到一種操作簡單、省時(shí)、成本低、提取效率和回收率均較高的cfDNA提取試劑盒，以期為cfDNA 的臨床應(yīng)用提供實(shí)用選擇。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究于2022 年4 - 5 月在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院招募了10 名健康參與者，其中5 名為男性，5 名為女性。在參與研究之前，每個(gè)參與者都簽署了書面知情同意書。將血液樣本收集到10 mL EDTA-K2 抗凝管中，并在2～8 ℃條件下存儲。在1 h 內(nèi)對血液樣本進(jìn)行兩步法離心（1 600 ×g，10 min，4 ℃；16 000 ×g，10 min，4 ℃），血漿充分混勻并分成3 個(gè)1 mL 的等分試樣，立即儲存在-80 ℃直至cfDNA 提取，所有血漿只凍融一次，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2 cfDNA 提取采用3 種不同品牌的游離核酸提取試劑盒，分別為Circulating Nucleic Acid Kit（以下簡稱Kit A）、FineMag 大體積磁珠法血漿游離DNA 提取試劑盒（以下簡稱Kit B）以及核酸提取或純化試劑（以下簡稱Kit C）。根據(jù)不同廠商說明書，以1 mL 血漿樣本作為起始，利用上述3 種游離核酸提取試劑盒分別進(jìn)行cfDNA 的提取。使用65 μL ddH2O 進(jìn)行洗脫，分裝cfDNA 以避免多次凍融。采用Qubit Fluorometer 4.0（美國Thermo Fisher Scientific 公司）對提取出的cfDNA 進(jìn)行濃度檢測。同時(shí)，使用Agilent 2100 生物芯片分析儀（美國Agilent 公司）分析樣本的cfDNA 的片段大小和豐度信息［11］。

1.3 cfDNA 中ND1、ND4、RPP30 基因拷貝數(shù)的檢測使用MicroDrop-100 液滴數(shù)字PCR 儀（廣州永諾公司）對線粒體基因ND1、ND4 以及核基因RPP30 拷貝數(shù)進(jìn)行分析，計(jì)算ND1 與ND4 拷貝數(shù)比值以評估cfDNA 中線粒體DNA 相對缺失情況；計(jì)算ND1/RPP30 拷貝數(shù)比值以分析cfDNA 中線粒體DNA 相對于細(xì)胞核DNA 的含量［12-13］。ddPCR 檢測在20 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中含有10 μL ddPCR Supermix 探針預(yù)混液（廣州永諾公司）、4 μL 的引物探針混合液、0.3 μL 的Hind-Ⅲ（日本Takara 公司）、3.7 μL ddH2O 以及2 μL DNA 模板。根據(jù)制造商的說明，使用MicroDrop100A 液滴生成器（廣州永諾公司）生成液滴，并將生成的液滴移入96 孔板中。PCR擴(kuò)增采用以下條件：95 ℃10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃30 s，64 ℃1 min，45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，將96 孔板放入MicroDrop-100B 檢測器（廣州永諾公司）中的液滴讀取器并測量熒光信號，使用QuantDrop分析軟件（廣州永諾公司）進(jìn)行分析，ddPCR 結(jié)果以copy number/mL 血漿表示。空白對照樣本要求≤3 個(gè)陽性液滴。引物以及探針由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 本研究中使用的引物和探針序列Tab.1 Primer and Probe Sequences used in this Study

1.4 cfDNA 濃度及完整性的檢測使用qPCR 檢測血漿cfDNA 中ALU 115 和ALU 247 兩個(gè)片段的濃度，其中，ALU 115 的qPCR 結(jié)果代表樣本的總cfDNA 濃度，ALU 247 的qPCR 結(jié)果用于測量壞死細(xì)胞所貢獻(xiàn)的大片段cfDNA 含量，并通過ALU 247/ALU 115 的比值來評估cfDNA 片段的完整性［14-15］。每個(gè)20 μL 反應(yīng)體系由10 μL LightCycler 480 SYBR Green I Master（瑞士Roche 公司）、4 μL DNA 模板、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、4 μL ddH2O 組成。PCR 熱循環(huán)條件如下：95 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃30 s，60 ℃1 min，共40 循環(huán)。在擴(kuò)增后，進(jìn)行熔融曲線分析以及瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確認(rèn)PCR 產(chǎn)物的特異性。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（5.2 × 100至5.2 × 10-5ng/μL）計(jì)算cfDNA 中ALU 115 和ALU 247 片段的濃度，qPCR 結(jié)果以ng/mL 血漿表示。每次運(yùn)行時(shí)都包括cfDNA 樣本以及空白對照，反應(yīng)一式兩份。ALU 115 以及ALU 247 引物的序列可見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 試劑盒對不同大小DNA 片段回收率及提取偏好性的檢測在9 mL 健康人混合血漿中摻入終濃度為500 ng/mL 的Low Molecular Weight DNA Ladder（美國New England Biolabs 公司，該Ladder 包含11 條不同大小的DNA 片段，從25 bp 到766 bp），混勻并等量分成9 份，使用上述3 種試劑盒分別進(jìn)行cfDNA 提取。如前所述［16］，取1 μL 樣本進(jìn)行Agilent 2100 生物芯片分析儀檢測，并用2100 Expert 軟件計(jì)算Low Molecular Weight DNA Ladder 中50～766 bp 范圍內(nèi)10 條特定大小片段的DNA 濃度，以比較3 種試劑盒對不同大小DNA 片段的回收率和提取偏好性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 以及R（version 4.2.1）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料使用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)評估數(shù)據(jù)正態(tài)性，使用Levene＇s 方差齊性檢驗(yàn)評估數(shù)據(jù)的方差齊性，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用（）形式表示并用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey-Kramer 檢驗(yàn)或Games-Howell 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示并用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner 檢驗(yàn)。定性資料采用Fisher 精確概率法進(jìn)行比較。此外，采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析，并使用R中的“corrplot”、“cocor”包來比較相關(guān)系數(shù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同游離核酸提取試劑盒的基本特征對比見表2。

表2 3 種游離核酸提取試劑盒的基本特征Tab.2 Basic characteristics of the three cell-free DNA extraction kits

2.2 不同試劑盒提取的cfDNA 濃度及片段大小分布使用Agilent 2100 生物芯片分析儀評估了3 種試劑盒提取到的cfDNA 片段大小及濃度。如表3以及圖1A 所示，3 種試劑盒提取到的cfDNA 在100～300 bp 范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的濃度差異（P= 0.006）。其中，Kit A 及Kit B 提取到的cfDNA 濃度顯著高于Kit C（P=0.008、P=0.024）。另外，如圖1B 所示，我們比較了3 種試劑盒提取的cfDNA 中單核小體主峰的檢出率。其中，Kit A 及Kit B 檢測到了60%的cfDNA 樣本中的標(biāo)志性單核小體主峰，Kit C 只檢測到了30%的cfDNA 樣本中的標(biāo)志性單核小體主峰，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.467）。

圖1 基于Agilent 2100 生物芯片分析儀分析3 種游離核酸提取試劑盒的提取效率Fig.1 The extraction efficiency of the three cell-free nucleic acid extraction kits determined by Agilent 2100 bioanalyzer analysis

表3 本研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總Tab.3 Summary of experimental results in this study ±s

表3 本研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總Tab.3 Summary of experimental results in this study ±s

注：與Kit A 比較，*P＜0.05；與Kit B 比較，#P＜0.05

測量指標(biāo)cfDNA 單核小體主峰檢出率（%）100～300 bp cfDNA 濃度（ng/mL）RPP30（copy number /mL）ND1（copy number /mL）ND4（copy number /mL）mtDNA 相對缺失（ND1/ND4）mtDNA 相對含量（ND1/RPP30）50～766 bp 平均回收率（%）ALU 115 濃度（ng/mL）ALU 247 濃度（ng/mL）cfDNA 完整性（ALU247/ALU115）Kit A（n = 10）60 5.10 ± 1.99 2 353.98 ± 1 298.96 325 134.72 ± 171 119.64 332 079.91 ± 183 103.57 1.00（0.98，1.01）148.73（115.55，162.05）70.83（67.09，76.83）8.11 ± 4.25 2.59 ± 1.20 0.33 ± 0.05 Kit B（n = 10）60 4.64 ± 3.09 1 903.92 ± 1 072.09 359 090.85 ± 193 365.34 360 081.90 ± 193 102.92 1.00（0.99，1.00）201.84（180.69，277.91）51.84（47.57，57.17）*5.43 ± 3.25 1.78 ± 0.93 0.35 ± 0.05 Kit C（n = 10）30 1.82 ± 1.29*#897.29 ± 590.27*33 015.91 ± 19 198.16*#32 562.32 ± 19 608.87*#1.00（0.98，1.10）36.95（34.95，61.30）*#44.98（26.92，49.42）*#2.87 ± 1.65*0.83 ± 0.44*#0.30 ± 0.04 χ2/F/H 值-6.21 6.92 26.71 25.77 0.69 15.94 61.99 7.63 11.72 2.72 P 值0.467 0.006 0.007＜0.001＜0.001 0.708＜0.001＜0.001 0.005＜0.001 0.084

2.3 ddPCR 測定cf-nDNA 以及cf-mtDNA 濃度為了檢測不同試劑盒所提取的cfDNA 中cf-nDNA和cf-mtDNA 濃度是否存在差異，采用ddPCR 分析了cfDNA 中具有代表性的相關(guān)基因拷貝數(shù)，并比較了使用不同試劑盒對cf-mtDNA 相對含量以及相對缺失的影響。如表3 以及圖2A-E 所示，3 種試劑盒提取的cf-nDNA（RPP30）和cf-mtDNA（ND1、ND4）濃度均存在顯著差異（P= 0.007、P＜0.001、P＜0.001）。對于cf-nDNA，Kit A 的提取效率顯著高于Kit C（P= 0.018）；對于cf-mtDNA，Kit A 及Kit B 的提取效率顯著高于Kit C（P= 0.001、P= 0.001、P= 0.001、P= 0.001）。此外，我們發(fā)現(xiàn)使用不同試劑盒導(dǎo)致了cf-mtDNA 相對含量（ND1/RPP30）出現(xiàn)假陽性差異（P＜0.001），但cf-mtDNA 相對缺失（ND1/ND4）在3 種試劑盒之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.708）。

圖2 基于ddPCR 分析的3 種游離核酸提取試劑盒比較Fig.2 Comparison of three cell-free nucleic acid extraction kits based on ddPCR analysis

2.4 qPCR檢測血漿cfDNA濃度以及片段完整性采用qPCR 比較了3 種試劑盒提取的cfDNA 中多拷貝基因片段的濃度，并探究使用不同試劑盒進(jìn)行提取是否會導(dǎo)致cfDNA 片段的完整性存在差異。如表3 及圖3A-C 所述，3 種試劑盒所提取的cfDNA 中ALU 115 以及ALU 247 的濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.005、P＜0.001），但據(jù)此計(jì)算的cfDNA完整性無顯著差異（P= 0.084）。具體而言，對于cfDNA 總濃度（ALU 115），Kit A 的提取效率顯著高于Kit C（P= 0.009）；對于壞死細(xì)胞來源的大片段cfDNA（ALU 247），Kit A 和Kit B 的提取效率均顯著高于Kit C（P= 0.003、P= 0.030）。

圖3 基于qPCR 分析的3 種游離核酸提取試劑盒比較Fig.3 Comparison of three cell-free nucleic acid extraction kits based on qPCR analysis

2.5 不同游離核酸提取試劑盒對DNA Ladder 的回收率及提取偏好性的影響采用Agilent 2100生物芯片分析儀評估了3 種試劑盒對50～766 bp范圍內(nèi)10 個(gè)不同大小DNA 片段的回收率及提取偏好性的差異。如圖4A 所示，所有試劑盒都不同程度地回收了75～766 bp 范圍內(nèi)的所有DNA 片段。我們比較3 種試劑盒對這些DNA 片段的回收率發(fā)現(xiàn)，除了766 bp 片段外，Kit A 對其他各片段回收率均顯著高于Kit B（均P＜0.05）以及Kit C（均P＜0.05）。Kit A 對766 bp 片段的回收率顯著高于Kit C（P= 0.007），但與Kit B 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.058）。值得注意的是，Kit B對75 bp以及100 bp 片段的回收率顯著高于Kit C（P= 0.007，P＜0.001）。同時(shí)，Kit B對150、200 bp以及350 bp片段的回收率也存在高于Kit C 的趨勢（P= 0.072，P= 0.062，P= 0.073）。對于50 bp 片段的回收，Kit A 的回收率約為59.51%，Kit B 的回收率僅為1.08%，而Kit C未能回收到該片段。就平均回收率而言，如表3 及圖4B 所示，在50～766 bp 范圍內(nèi)，3 種試劑盒的平均回收率存在顯著差異（P＜0.001），Kit A 的平均回收率顯著高于Kit B（P＜0.001）以及Kit C（P＜0.001）。同時(shí)，Kit B 的平均回收率顯著高于Kit C（P= 0.002）。提取偏好性方面，在50～766 bp 范圍內(nèi)，Kit A 不存在明顯的片段大小回收偏好性，而另外兩種試劑盒在50～100 bp 范圍內(nèi)的回收率較低。但隨著回收片段長度的增加，兩種試劑盒回收率逐漸提升并趨于穩(wěn)定。

圖4 3 種游離核酸提取試劑盒對外源性DNA Ladder 的回收效率比較Fig.4 Comparison of the recovery efficiency of the three cell-free nucleic acid extraction kits for the spiked-in DNA ladder

2.6 不同游離核酸提取試劑盒的cfDNA 提取相關(guān)性分析為了比較3 種試劑盒在ddPCR 以及qPCR 實(shí)驗(yàn)中所得到結(jié)果的相關(guān)性，進(jìn)行了基于Kit A 的相關(guān)矩陣分析。如圖5A-B 所示，在ddPCR方面，Kit A 與Kit B 在RPP30、ND1、ND4 拷貝數(shù)方面均顯示出顯著正相關(guān)（P＜0.05），其Rho 值分別為0.96、0.73、0.74。同時(shí)，Kit C 也取得了類似的顯著正相關(guān)（P＜0.05），其Rho 值分別為0.91、0.80、0.76，且Kit C 與Kit A 的相關(guān)系數(shù)和Kit B 與Kit A的相關(guān)系數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在qPCR 方面，Kit A 分別與Kit B 在ALU 115 及ALU 247片段濃度方面也呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)（P＜0.05），相應(yīng)的Rho 值分別為0.95、0.96。同時(shí)，Kit C 也表現(xiàn)出類似的顯著正相關(guān)性（P＜0.05），其Rho 值分別為0.84、0.89，且Kit C 與Kit A 的相關(guān)系數(shù)和Kit B與Kit A 的相關(guān)系數(shù)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，P=0.055）。此外，由于RPP30、ALU115以及ALU247均來自于細(xì)胞核基因組，我們也探究了利用三種游離核酸提取試劑盒獲得的cf-nDNA 拷貝數(shù)和濃度之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，Kit A 的RPP30拷貝數(shù)與Kit B 的ALU115 及ALU247 濃度均呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，相應(yīng)的Rho 值分別為：0.95、0.97（P＜0.05），而Kit A 的RPP30 拷貝數(shù)與Kit C 的ALU115 及ALU247 的Rho 值分別為：0.94、0.90（P＜0.05），兩種試劑盒與Kit A 的相關(guān)系數(shù)比較無顯著差異（P＞0.05）；同樣地，Kit A 的ALU115及ALU247與Kit B 的RPP30 也均呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，相應(yīng)的Rho 值分別為：0.96、0.89（P＜0.05），Kit A 的ALU115 及ALU247 與Kit C 的RPP30 的Rho 值分別0.89、0.78（P＜0.05），兩種試劑盒與Kit A 的相關(guān)系數(shù)比較同樣無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 3 種游離核酸提取試劑盒實(shí)驗(yàn)參數(shù)相關(guān)系數(shù)矩陣分析Fig.5 Analysis of the correlation coefficient matrix of the experimental parameters for the three cell-free nucleic acid DNA extraction kits

3 討論

自1948年MANDEL和MéTAIS首次描述cfDNA［17］以來，cfDNA 逐漸成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［18-22］。傳統(tǒng)的穿刺活檢不僅具有侵入性，而且難以完全獲得腫瘤異質(zhì)性和疾病進(jìn)展等信息。基于cfDNA的液體活檢提供了一種可重復(fù)評估患者癌癥基因組特征的非侵入性方法，因?yàn)閏fDNA 具有與同源組織相同的序列特征（例如染色體重排、基因突變、甲基化等）［23］。然而，cfDNA 含量低以及高度片段化的性質(zhì)給下游實(shí)驗(yàn)分析帶來了挑戰(zhàn)。最大限度提高cfDNA 的回收效率有助于確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，特別是針對ctDNA 的相關(guān)分析，因?yàn)閏tDNA 通常只占總cfDNA 的一小部分［24］。此外，部分ctDNA通常較短（132～145 bp，甚至＜100 bp），且攜帶更多的癌癥相關(guān)突變［25-27］。若無法最大程度地回收這部分cfDNA，將嚴(yán)重影響cfDNA 作為癌癥或其他疾病生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。因此，有必要在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，考慮提取方法的不同以及試劑盒選擇所帶來的局限性。

不同cfDNA 提取試劑盒在提取效率以及回收率等方面存在巨大差異。已有研究比較了各種商業(yè)試劑盒對cfDNA 的提取效率，認(rèn)為Qiagen 的Circulating Nucleic Acid Kit 是性能較好的試劑盒之一［28-29］。然而，進(jìn)口試劑盒往往價(jià)格昂貴、貨期長、提取過程耗時(shí)。本研究將Qiagen 的Circulating Nucleic Acid Kit 試劑盒納入了本次實(shí)驗(yàn)中，并與兩種基于磁珠法的國產(chǎn)試劑盒進(jìn)行對比。在成本方面，Qiagen試劑盒單人次價(jià)格遠(yuǎn)高于另外兩種，且在操作時(shí)間上存在劣勢。Agilent 2100 生物芯片分析儀結(jié)果表明，Kit A 及Kit B 所提取的100～300 bp 大小的cfDNA 濃度顯著高于Kit C。在ddPCR 和qPCR的定量分析實(shí)驗(yàn)中，無論是cf-nDNA 的擴(kuò)增還是cf-mtDNA的擴(kuò)增，Kit B取得了與Kit A類似的結(jié)果。最后，我們比較了3 種試劑盒在50～766 bp 范圍內(nèi)的回收率。與之前研究報(bào)告的回收率相似［16］，在50～766 bp 范圍內(nèi)，基于硅膠膜離心柱法的Kit A 取得了71.01%的平均回收率，顯著高于基于磁珠法的兩種國產(chǎn)試劑盒；考慮到ctDNA 通常小于150 bp，我們比較了3 種試劑盒對50、75、100 bp 和150 bp 這4 個(gè)片段的回收率。同樣，Kit A 表現(xiàn)最佳，取得了60%～81%不等的回收率，顯著高于Kit B 以及Kit C；而Kit B 對75 bp、100 bp 片段的回收表現(xiàn)也顯著優(yōu)于Kit C，但Kit B 和Kit C 對50 bp以及150 bp 片段的回收表現(xiàn)類似。因此，在提取偏好方面，兩種基于磁珠法的試劑盒對小片段cfDNA，特別是＜100 bp 的cfDNA 回收率不高，但隨著所回收片段長度的增加，其回收率趨于穩(wěn)定。

綜上所述，本研究利用qPCR、ddPCR 和Agilent 2100 生物芯片分析儀對3 種試劑盒所提取的cfDNA 進(jìn)行全面評估，并分析比較各試劑盒的提取效率、回收率以及偏好性。結(jié)果表明，Kit A 在以上幾項(xiàng)結(jié)果的表現(xiàn)均優(yōu)于Kit B 和Kit C；若考慮時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本，Kit B 可能是Kit A 的一種替代選擇。