miR-27a靶向調(diào)節(jié)TLR4減輕糖尿病妊娠大鼠氧化應(yīng)激和炎癥損傷

張翠翠 孫文萍 謝玲

青海紅十字醫(yī)院產(chǎn)一科（西寧 810099）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）與早期和晚期胚胎死亡、胎兒生長障礙和胎盤異常有關(guān)［1］。在GDM 中檢測(cè)到胎盤組織中較高的炎癥反應(yīng)［2］。MicroRNA（miRNA）在GDM 中存在異常表達(dá)，是GDM 的有效診斷標(biāo)志物［3］。據(jù)報(bào)道，miR-27a 是治療肥胖和糖尿病胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的新靶點(diǎn)，其過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路抑制炎癥反應(yīng)［4-5］。通過對(duì)miR-27a 的靶基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-27a 有多個(gè)靶基因，包括TLR4［6］。在眾多靶基因中，TLR4 在GDM 女性臍帶血和胎盤中表達(dá)增加［7］；且TLR4/MyD88/NF-κB 通路在GDM 中被激活，與氧化應(yīng)激和炎癥密切相關(guān)［8］。miR-27a 能否通過TLR4 介導(dǎo)GDM 發(fā)生、發(fā)展尚未明確。因此，本研究探討miR-27a 在GDM 中的表達(dá)及潛在機(jī)制，為GDM 的診斷和機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物70 只雌性和35 只雄性SD 大鼠（6～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g）購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（豫）2017-0001］，飼養(yǎng)在受控環(huán)境條件下：溫度（23 ± 1）℃、濕度（50 ± 10）%和12 h∶12 h 光暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：S8050）；miR-27a agomir 和miR-27a agomir 陰性對(duì)照（agomir-NC）由廣州RiboBiotech 公司合成；脂多糖（LPS，TLR4激活劑）（S1732）、HE 染色液（C0105S）、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光，C1088）（碧云天生物科技公司）；兔源一抗TLR4（bs-20595R）、MyD88（bs-1047R）、NF-κB p65（bs-23216R）、β-actin（bs-0061R）、Lamin B1（bs-55118R）和二抗山羊抗兔IgG（H+L）/HRP（bs-40295G）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

Accu-Chek Active 型羅氏活力血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.3 模型制備將發(fā)情期的雌性與雄性大鼠以2∶1 的比例合籠交配過夜。第2 天早上，對(duì)雌性大鼠進(jìn)行陰道涂片，光學(xué)顯微鏡下觀察到出現(xiàn)陰道栓（黏液栓）或精子，證實(shí)懷孕，被視為妊娠的第0 天。每只懷孕的大鼠都被放置在一個(gè)單獨(dú)的籠子里，并一直跟蹤到懷孕結(jié)束。

將獲得的64 只懷孕大鼠，隨機(jī)選取12 只為對(duì)照組（control 組），剩余52 只大鼠一次性腹腔注射65 mg/kg STZ 溶液（妊娠第1 天），并給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，復(fù)制GDM 模型［9］；control 組給予普通飼料喂養(yǎng)，并注射等量檸檬酸緩沖液。注射STZ 后第3 天（妊娠第4 天），出現(xiàn)糖尿病狀態(tài)，表現(xiàn)為多尿、煩渴、多食等體征；使用血糖儀測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平，若FBG＞16.7 mmol/L 即為糖尿病。共48 只大鼠造模成功。

1.4 動(dòng)物分組及給藥將造模成功的48 只大鼠分為模型組（model 組）、agomir-NC 組、miR-27a agomir 組、miR-27a agomir+LPS 組，每組12 只。分組完成后，agomir-NC 組和miR-27a agomir 組大鼠每3 天靜脈內(nèi)（尾靜脈）注射相應(yīng)的agomir-NC 或miR-27a agomir（10 μmol/L），miR-27a agomir+LPS組大鼠在尾靜脈注射miR-27a agomir 的同時(shí)腹腔注射LPS（100 μg/kg），control 組和model 組大鼠注射等量生理鹽水，直到妊娠第19 天。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 FBG 和FINS 水平檢測(cè)禁食10 h 后，取各組大鼠尾靜脈血，血糖儀檢測(cè)FBG 水平；另取腹主動(dòng)脈血樣，分離血清，ELISA 法檢測(cè)FINS 水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：［FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）］/22.5。

1.5.2 妊娠結(jié)局和胎盤質(zhì)量檢測(cè)妊娠第19天時(shí)，對(duì)孕鼠行剖宮產(chǎn)，取出胎鼠并觀察窩產(chǎn)仔數(shù)、活胎率及胎鼠體質(zhì)量，并剝離胎盤，稱取胎盤質(zhì)量。

1.5.3 炎癥因子水平檢測(cè)取適量胎盤組織，剪碎后加入預(yù)冷的生理鹽水，制成10%的組織勻漿，在4 ℃下以2 000 ×g離心10 min，取上清，采用ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α 水平。

1.5.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)使用檢測(cè)試劑盒通過紫外-可見分光光度法測(cè)定胎盤組織勻漿上清液中SOD、CAT 活性以及MDA 含量。分別在560、405或532 nm 處檢測(cè)各組的OD值，計(jì)算SOD 活性、CAT 活性和MDA 含量。

1.5.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察胰腺和胎盤組織病理學(xué)變化將胰腺和胎盤組織在4%甲醛溶液中固定后，石蠟包埋，切片（5 μm 厚）行HE 染色，光鏡下觀察胰腺和胎盤組織的病理學(xué)變化。

1.5.6 TUNEL 檢測(cè)胰腺和胎盤組織細(xì)胞凋亡取石蠟包埋的胎盤和胰腺組織切片，在37 ℃下與TUNEL 染色液孵育1 h，DAPI 染核。在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算TUNEL 陽性細(xì)胞百分比。綠色表示凋亡細(xì)胞。

1.5.7 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)胎盤組織miR-27a與TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平用TRIzol 試劑提取胎盤組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在RT-qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。U6、GAPDH作為參考基因以標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達(dá)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量。

表1 用于RT-qPCR 的引物序列Tab.1 Primer sequence for RT qPCR

1.5.8 Western blot 分析RIPA 裂解液分離胎盤組織總蛋白，并提取細(xì)胞核蛋白。10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜：TLR4（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶500）和Lamin B1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）。膜與二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。顯影，使用Image J 軟件分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 軟件（第8 版）分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示為（）。多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組FBG、FINS 水平和HOMA-IR與control 組比，model 組FBG、FINS 和HOMA-IR 升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組上述指標(biāo)降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+LPS 組上述指標(biāo)升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠FBG、FINS 水平和HOMA-IR 比較Tab.2 Comparison of FBG，F(xiàn)INS levels and HOMA-IR in rats of each group ±s

表2 各組大鼠FBG、FINS 水平和HOMA-IR 比較Tab.2 Comparison of FBG，F(xiàn)INS levels and HOMA-IR in rats of each group ±s

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control組model組agomir-NC組miR-27a agomir組miR-27a agomir+LPS組F值P值FBG（mmoL/L）7.34±1.01 16.69±2.12#17.04±2.36#9.52±1.48#*14.39±1.55#*Δ 72.733＜0.001 FINS（mU/L）4.25±0.63 13.18±1.49#12.64±1.25#7.52±0.86#*10.61±1.32#*Δ 126.141＜0.001 HOMA-IR 1.39±0.22 9.78±1.35#9.57±1.24#3.18±0.50#*6.79±0.86#*Δ 193.587＜0.001

2.2 各組妊娠結(jié)局和胎盤質(zhì)量與control 組比，model 組大鼠窩產(chǎn)仔數(shù)、活胎率降低，胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組大鼠窩產(chǎn)仔數(shù)、活胎率升高，胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir + LPS 組大鼠窩產(chǎn)仔數(shù)、活胎率降低，胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠妊娠結(jié)局和胎盤質(zhì)量比較Tab.3 Comparison of pregnancy outcome and placenta quality of rats in each group ±s

表3 各組大鼠妊娠結(jié)局和胎盤質(zhì)量比較Tab.3 Comparison of pregnancy outcome and placenta quality of rats in each group ±s

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control 組model 組agomir-NC 組miR-27a agomir 組miR-27a agomir + LPS 組F 值P 值窩產(chǎn)仔數(shù)（只）8.92 ± 1.51 6.75 ± 0.97#6.58 ± 1.08#8.33 ± 1.37*6.83 ± 1.11#Δ 9.128＜0.001活胎率（%）96.53 ± 5.18 84.89 ± 2.21#86.28 ± 7.79#93.38 ± 8.03*85.38 ± 6.37#Δ 8.573＜0.001胎鼠體質(zhì)量（g/只）5.12 ± 0.70 6.34 ± 0.65#6.29 ± 0.74#5.36 ± 0.61*6.18 ± 0.82#Δ 7.877＜0.001胎盤質(zhì)量（g）0.50 ± 0.07 0.69 ± 0.08#0.64 ± 0.09#0.55 ± 0.07*0.67 ± 0.08#Δ 12.997＜0.001

2.3 各組大鼠胎盤組織IL-1β、TNF-α 水平與control 組比，model 組IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與model 組相比，miR-27a agomir 組上述指標(biāo)降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+ LPS 組上述指標(biāo)升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠胎盤組織IL-1β、TNF-α 水平比較Tab.4 In placental tissue of rats in each group IL-1β，TNF-α Horizontal comparison ±s，pg/mL

表4 各組大鼠胎盤組織IL-1β、TNF-α 水平比較Tab.4 In placental tissue of rats in each group IL-1β，TNF-α Horizontal comparison ±s，pg/mL

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control 組model 組agomir-NC 組miR-27a agomir 組miR-27a agomir+LPS 組F 值P 值IL-1β 21.39 ± 3.24 65.08 ± 6.12#63.62 ± 6.45#39.59 ± 5.36#*52.28 ± 6.27#*Δ 126.787＜0.001 TNF-α 30.53 ± 4.18 94.25 ± 7.20#90.86 ± 7.34#55.01 ± 6.52#*79.45 ± 8.06#*Δ 188.268＜0.001

2.4 各組大鼠胎盤組織SOD、CAT 活性和MDA含量與control 組比，model 組SOD 和CAT 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組SOD 和CAT 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir組比，miR-27a agomir+LPS 組SOD 和CAT 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠胎盤組織SOD、CAT 活性和MDA 含量比較Tab.5 Comparison of SOD，CAT activity and MDA content in placental tissue of rats in each group ±s

表5 各組大鼠胎盤組織SOD、CAT 活性和MDA 含量比較Tab.5 Comparison of SOD，CAT activity and MDA content in placental tissue of rats in each group ±s

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control 組model 組agomir-NC 組miR-27a agomir 組miR-27a agomir+LPS 組F 值P 值SOD（U/mgprot）19.58 ± 2.24 5.23 ± 1.17#5.18 ± 1.06#13.42 ± 1.54#*7.09 ± 1.21#*Δ 208.724＜0.001 CAT（U/gprot）0.61 ± 0.07 0.27 ± 0.05#0.24 ± 0.04#0.49 ± 0.06#*0.36 ± 0.05#*Δ 95.483＜0.001 MDA（nmol/mgprot）1.14 ± 0.20 4.20 ± 0.53#4.25 ± 0.48#2.37 ± 0.35#*3.45 ± 0.41#*Δ 125.215＜0.001

2.5 各組大鼠胰腺和胎盤組織病理學(xué)變化control組胰腺組織形態(tài)正常；model 組病理改變明顯，胰島明顯萎縮，細(xì)胞數(shù)量減少，分布稀疏，排列無序，部分大鼠胰腺腺泡細(xì)胞出現(xiàn)液泡變性并伴有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤；與model 組比，miR-27a agomir 組胰腺組織病變減少，胰島輕度萎縮，部分胰島可見少量炎性細(xì)胞浸潤；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+LPS 組胰腺病理損傷程度增加，炎癥細(xì)胞浸潤更嚴(yán)重。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺和胎盤組織病理學(xué)變化（HE，× 100）Fig.1 Histopathological changes of pancreas and placenta of rats in each group（HE，× 100）

control 組胎盤細(xì)胞分布均勻致密，毛細(xì)血管分布均勻；model 組大鼠胎盤組織分層邊界不明顯，細(xì)胞分布松散無序，間隙變大，毛細(xì)血管分布減少；與model 組比，miR-27a agomir 組大鼠的胎盤損傷減少，細(xì)胞排列較為有序，間隙變小，毛細(xì)血管分布增多；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+LPS 組大鼠的胎盤上述損傷加重。見圖1。

2.6 各組大鼠胰腺和胎盤組織細(xì)胞凋亡與control組比，model 組胰腺和胎盤組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組上述指標(biāo)降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+LPS 組上述指標(biāo)升高（P＜0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠胰腺和胎盤組織的細(xì)胞凋亡（TUNEL，×100）Fig.2 Apoptosis of pancreatic and placental tissues of rats in each group（TUNEL，×100）

表6 各組大鼠胰腺和胎盤組織細(xì)胞凋亡率比較Tab.6 Comparison of apoptosis rates of pancreatic and placental tissues of rats in each group ±s，%

表6 各組大鼠胰腺和胎盤組織細(xì)胞凋亡率比較Tab.6 Comparison of apoptosis rates of pancreatic and placental tissues of rats in each group ±s，%

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control 組model 組agomir-NC 組miR-27a agomir 組miR-27a agomir+LPS 組F 值P 值胰腺組織細(xì)胞凋亡率2.04 ± 0.25 21.36 ± 2.48#20.85 ± 2.32#8.23 ± 1.89#*14.65 ± 2.07#*Δ 212.984＜0.001胎盤組織細(xì)胞凋亡率1.23 ± 0.20 12.46 ± 1.59#12.38 ± 1.47#4.51 ± 0.62#*8.27 ± 1.30#*Δ 213.637＜0.001

2.7 各組大鼠胎盤組織miR-27a與TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平與control 組比，model組miR-27a 水平降低，TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組miR-27a 水平升高，TLR4、MyD88、NFκB p65 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir+LPS 組miR-27a 水平降低，TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平升高（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠胎盤組織miR-27a 與TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平比較Tab.7 MiR-27a，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group Comparison of mRNA level ±s

表7 各組大鼠胎盤組織miR-27a 與TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平比較Tab.7 MiR-27a，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group Comparison of mRNA level ±s

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

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2.8 各組大鼠胎盤組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 的蛋白水平與control 組比，model 組TLR4、MyD88 和核NF-κB p65 蛋白水平升高（P＜0.05）；與model 組比，miR-27a agomir 組上述指標(biāo)降低（P＜0.05）；與miR-27a agomir 組比，miR-27a agomir + LPS 組上述指標(biāo)升高（P＜0.05）。見圖3、表8。

圖3 各組大鼠胎盤組織TLR4、MyD88 和核NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.3 TLR4，MyD88 and nuclear NF-κB p65 in placental tissue of rats in each groupprotein expression

表8 各組大鼠胎盤組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平比較Tab.8 TLR4，MyD88，NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group protein level comparison ±s

表8 各組大鼠胎盤組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平比較Tab.8 TLR4，MyD88，NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group protein level comparison ±s

注：與control 組比，#P＜0.05；與model 組比，*P＜0.05；與miR-27a agomir 組比，Δ P＜0.05

組別control 組model 組agomir-NC 組miR-27a agomir 組miR-27a agomir+LPS 組F 值P 值TLR4/β-actin 0.21 ± 0.04 0.50 ± 0.06#0.46 ± 0.05#0.33 ± 0.04#*0.41 ± 0.05#*Δ 67.475＜0.001 MyD88/β-actin 0.15 ± 0.03 0.43 ± 0.05#0.42 ± 0.06#0.23 ± 0.04#*0.34 ± 0.05#*Δ 80.162＜0.001 NF-κB p65/Lamin B1 0.12 ± 0.02 0.30 ± 0.04#0.29 ± 0.03#0.16 ± 0.03*0.22 ± 0.04#*Δ 69.111＜0.001

3 討論

本研究結(jié)果顯示，miR-27a 的過表達(dá)可通過降低FBG、FINS 和HOMA-IR 以及改善GDM 大鼠的胰腺和胎盤組織損傷和細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。此外，miR-27a 過表達(dá)后促炎和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平顯著降低，抗氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平升高，這表明miR-27a 的過表達(dá)可以減輕GDM 大鼠胎盤炎癥和氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕IR，改善妊娠結(jié)局。提示miR-27a 可能在GDM 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

TLR4 在受到刺激后，會(huì)激活MyD88，誘導(dǎo)NFκB 易位至細(xì)胞核，觸發(fā)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，包括IL-6、IL-1β、TNF-α，從而促進(jìn)GDM 發(fā)展［10］。抑制GDM 小鼠TLR4/NF-κB 通路激活，可改善胎盤氧化應(yīng)激和炎癥以及胎兒結(jié)局［11］。TLR4 是miR-27a 的直接靶點(diǎn)，據(jù)報(bào)道，miR-27a 可通過靶向TLR4 減弱LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的炎癥反應(yīng)［12］。本研究觀察到，在GDM 大鼠胎盤中TLR4、MyD88 和NF-κB p65 的表達(dá)均增加，表明TLR4/MyD88/NFκB 通路被激活；而miR-27a 的過表達(dá)阻止了NF-κB p65 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核；此外，使用TLR4 激活劑LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 通路可減弱miR-27a 過表達(dá)對(duì)GDM 大鼠胎盤炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制作用。提示miR-27a 過表達(dá)可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路，減輕GDM 大鼠胎盤炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

綜上所述，miR-27a 過表達(dá)可減輕GDM 大鼠胎盤炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕IR，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路激活有關(guān)。表明miR-27a 可能是GDM 的潛在靶點(diǎn)，對(duì)GDM 的診斷和治療具有重要的意義。但由于GDM 中miR-27a 的研究相對(duì)較少，本研究結(jié)論尚需更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。