富馬酸二甲酯對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響

王賽 高靜

勝利油田中心醫(yī)院心內(nèi)科（山東東營(yíng) 257000）

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是最常見(jiàn)的心律失常之一，多見(jiàn)于器質(zhì)性心臟病或其他器質(zhì)性疾病患者［1］。AF 引起的血栓栓塞并發(fā)癥（尤其是腦栓塞）是AF 患者致死、致殘的最主要原因之一［1］。近年來(lái)隨著對(duì)AF 的生理及病理研究的深入，發(fā)現(xiàn)AF 患者存在內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，且與AF的預(yù)后相關(guān)［2］。過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷已被證實(shí)在AF 中發(fā)揮重要作用，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷可作為AF 治療的潛在干預(yù)措施，因此揭示AF 患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制、尋找有效的改善藥物具有重要臨床意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)AF 的治療集中在抗凝、控制心室率、并發(fā)癥處理等，并且藥物與導(dǎo)管消融策略大多數(shù)是經(jīng)驗(yàn)性的［3］，治療手段局限、手術(shù)并發(fā)癥及術(shù)后復(fù)發(fā)等一系列因素仍存在較大的爭(zhēng)議［4］。富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）是FDA 自1994 年以來(lái)批準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重銀屑病和復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥的藥物。DMF 主要通過(guò)激活核因子紅細(xì)胞2（Nrf2）抗氧化途徑發(fā)揮保護(hù)作用［5］。已有研究［6-8］報(bào)道DMF 具有保護(hù)心肌梗死、缺血再灌注損傷和膿毒癥引起的心功能不全的作用。DMF 還能夠減輕小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［9］，但截至目前，并未有研究探索DMF 對(duì)AF 患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及其可能機(jī)制。因此，本研究使用DMF 干預(yù)H2O2處理的內(nèi)皮細(xì)胞，探索DMF 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的潛在機(jī)制，為DMF 治療AF 提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HCMEC）（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；DMF（上海MCE公司）；H2O2（上海阿拉丁公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、CCK-8試劑盒（上海MCE公司）；Nrf2、HO-1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、GPX4、ACSL4 和GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；ML385 均購(gòu)自上海MCE 公司；Western bolt 相關(guān)試劑、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ELX-808，美國(guó)BioTek 公司）；Western blot 電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad 公司）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)HCMEC 培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素（100 U/L）/鏈霉素（100 mg/L）的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶按1∶3 的比例進(jìn)行傳代。

1.3.2 細(xì)胞分組取10 μg 的DMF，用DMEM 培養(yǎng)基溶解為10 mg/mL 的母液，置于-80 ℃冰箱中保存。使用時(shí)稀釋為10、100、1 000 ng/mL 的DMF，分別干預(yù)HCMEC 細(xì)胞24 h 和48 h，評(píng)估DMF 對(duì)HCMEC 細(xì)胞的毒性作用，篩選最佳藥物濃度。

參考先前的文獻(xiàn)，使用DMEM培養(yǎng)配置10 mmol/L的H2O2，干預(yù)HCMEC 細(xì)胞24 h［10］，設(shè)為Control 組、H2O2組、H2O2+1 μmol/L DMF、H2O2+10 μmol/L DMF和H2O2+ 20 μmol/L DMF 組，評(píng)估DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

使用Nrf2 抑制劑ML385（10 μmol/L）干預(yù)HCMEC 細(xì)胞24 h，隨后再加入相應(yīng)的干預(yù)因素，分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+ DMF 組和H2O2+ DMF +ML385 組，檢測(cè)細(xì)胞通路和鐵死亡的改變，評(píng)估Nrf2 通路在DMF 保護(hù)內(nèi)皮損傷中的作用。

1.3.3 CCK-8 法測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCMEC，每孔5 × 103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)加入不同的干預(yù)因素干預(yù)相應(yīng)的時(shí)間。待檢測(cè)時(shí)每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，將96 孔板放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度（OD）值，以表示細(xì)胞增殖能力的改變。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)量各組細(xì)胞干預(yù)后提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行定量，分別取30 μg 蛋白行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)法90 min 將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm 孔徑的PVDF 上。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3 次，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入Nrf2、HO-1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、GPX4、ACSL4 和GAPDH 抗體（濃度均為1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST 洗膜，加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h（濃度1∶5 000）。采用底物化學(xué)發(fā)光法，凝膠成像系統(tǒng)分析。以目的蛋白與相應(yīng)非磷酸化蛋白的灰度值比表示相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 ELISA 測(cè)炎癥指標(biāo)的改變收集干預(yù)后的各組細(xì)胞上清5 mL，按照ELISA 說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清中TNF-α、IL-1β 和IL-18 的表達(dá)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算炎癥因子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 損傷的影響體外成功培養(yǎng)HCMEC，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈長(zhǎng)梭形（圖1）。低濃度（1～20 μmol/L）DMF 對(duì)HCMEC 活力無(wú)明顯影響，高濃度（50 μmol/L）DMF降低了細(xì)胞活力，具有一定細(xì)胞毒性。于是選擇1～20 μmol/L 的DMF 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 DMF 對(duì)HCMEC 增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of DMF on cell proliferation of HCME ±s

表1 DMF 對(duì)HCMEC 增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of DMF on cell proliferation of HCME ±s

注:與0 μmol/L 組比較，*P＜0.05

時(shí)間24 h 48 h DMF 0 μmol/L 0.26 ± 0.03 0.44 ± 0.05 1 μmol/L 0.24 ± 0.04 0.53 ± 0.06 10 μmol/L 0.29 ± 0.03 0.48 ± 0.05 20 μmol/L 0.31 ± 0.05 0.50 ± 0.04 50 μmol/L 0.19 ± 0.03*0.37 ± 0.04*F 值7.223 8.114 P 值0.009 0.005

圖1 光鏡下HCMEC生長(zhǎng)狀態(tài)（200×）Fig.1 Growth state of HCMEC under light microscope（200×）

10 mmol/L 的H2O2干預(yù)HCMEC 細(xì)胞24、48、72 h 后，細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H2O2組相比，不同濃度DMF 處理組HCMEC 增殖能力增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMECs 增殖的影響Tab.2 The role of different concentration of DMF on H2O2-induced cell proliferation of HCMECs ±s

表2 不同濃度DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMECs 增殖的影響Tab.2 The role of different concentration of DMF on H2O2-induced cell proliferation of HCMECs ±s

注：與Control 組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05

組別Control組H2O2組H2O2+1 μmol/L DMF組H2O2+10 μmol/L DMF組H2O2+20 μmol/L DMF組F值P值24 h 0.49±0.05 0.31±0.02*0.35±0.04 0.42±0.06#0.48±0.07#12.02＜0.001 48 h 0.86±0.08 0.44±0.04*0.61±0.05#0.78±0.07#0.82±0.12#25.60＜0.001 72 h 1.22±0.10 0.53±0.06*0.63±0.08#0.85±0.08#1.09±0.11#55.87＜0.001

表3 DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 炎癥因子的影響Tab.3 The influence of DMF on the content of TNF-α，IL-1β，and IL-18 in cell supernatant of HCMECs damaged by H2O2 ±s，pg/mL

表3 DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 炎癥因子的影響Tab.3 The influence of DMF on the content of TNF-α，IL-1β，and IL-18 in cell supernatant of HCMECs damaged by H2O2 ±s，pg/mL

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.01；與H2O2組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別Control組H2O2組H2O2+1 μmol/L DMF組H2O2+10 μmol/L DMF組H2O2+20 μmol/L DMF組F值P值TNF-α 25.23±4.03 46.39±10.68#41.39±10.68 35.75±6.89**25.55±9.60**6.952＜0.001 IL-1β 14.65±3.20 37.37±6.40#34.14±2.54 25.57±2.28**19.91±3.14**27.35＜0.001 IL-18 32.37±6.40 72.88±6.28#62.96±8.00**50.94±4.16**41.49±2.84**46.48＜0.001

2.2 不同濃度DMF 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 炎癥因子的影響ELISA 結(jié)果顯示，H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平顯著增加（P＜0.05）；使用不同濃度的DMF 干預(yù)細(xì)胞，上述炎癥因子的水平較H2O2組具有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 DMF 對(duì)H2O2處理的HCMECs 細(xì)胞鐵死亡的影響Western blot結(jié)果顯示，H2O2處理HCMECs后，GPX4 較對(duì)照組顯著下降，ACSL4 蛋白水平較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），表明H2O2可誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生鐵死亡。不同濃度的DMF 干預(yù)細(xì)胞后，DMF組的細(xì)胞中GPX4 表達(dá)下降，ACSL4 蛋白的水平較H2O2組逐漸上升，成濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度DMF 對(duì)H2O2處理的HCMEC 中GPX4 和ACSL4 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of different concentrations of DMF on the protein expression of GPX4 and ACSL4 in H2O2 treated HCMEC

2.4 DMF 干預(yù)對(duì)Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 通路的影響H2O2處理引起Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平下降，不同濃度DMF 組中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)較H2O2組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A，P＜0.05）。H2O2組JAK2 和STAT1 磷酸化水平的下降（P＜0.05），不同濃度IGF1 可刺激HCMEC 細(xì)胞內(nèi)JAK2 和STAT1 的磷酸化水平的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B，P＜0.05）。

圖3 DMF 對(duì)H2O2處理的HCMEC 中Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 通路的影響Fig.3 The effect of DMF on Nrf2/HO-1 and JAK2/STAT1 pathways in H2O2-treated HCMEC

2.5 Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 通路在DMF 改善HCMECs 損傷中的作用與H2O2+ DMF 組比較，H2O2+DMF+ML385 組中鐵死亡蛋白GPX4 蛋白下降，ACSL4蛋白升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 使用Nrf2 抑制劑后DMF 對(duì)GPX4 和ACSL4 蛋白表達(dá)的影響。Fig.4 The effects of DMF on GPX4 and ACSL4 protein expression after using an Nrf2 inhibitor

24、48 和72 h 時(shí)，與H2O2+DMF 組比較，H2O2+DMF + ML385 組的HCMECs 細(xì)胞增殖水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 JAK2/STAT1 通路在H2O2介導(dǎo)的HCMEC 細(xì)胞增殖中的作用Tab.4 The role of JAK2/STAT1 signaling pathway in H2O2-induced cell proliferation in HCMEC ±s

表4 JAK2/STAT1 通路在H2O2介導(dǎo)的HCMEC 細(xì)胞增殖中的作用Tab.4 The role of JAK2/STAT1 signaling pathway in H2O2-induced cell proliferation in HCMEC ±s

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與H2O2組比較，bP＜0.05；與H2O2+DMF 組比，cP＜0.05

組別Control 組H2O2組H2O2+DMF 組H2O2+DMF+ML385 組F 值P 值24 h 0.51 ± 0.03 0.27 ± 0.03a 0.44 ± 0.06b 0.31 ± 0.05c 31.62＜0.001 48 h 0.87 ± 0.09 0.42 ± 0.06a 0.91 ± 0.07b 0.66 ± 0.09c 41.05＜0.001 72 h 1.17 ± 0.12 0.67 ± 0.05a 1.14 ± 0.07b 0.87 ± 0.10c 36.36＜0.001

3 討論

AF 最大的危害是左心房形成附壁血栓，血栓脫落后導(dǎo)致腦栓塞和外周血管栓塞。內(nèi)皮損傷后暴露的膠原激活凝血因子引起血小板聚集，引發(fā)凝血過(guò)程，導(dǎo)致機(jī)體促凝/抗凝失衡，誘導(dǎo)血栓形成［11］。因此，尋找有效的AF 治療藥物迫在眉睫。本研究以AF 內(nèi)皮細(xì)胞損傷為切入點(diǎn)，細(xì)胞鐵死亡和Nrf2 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，揭示內(nèi)皮損傷的機(jī)制并尋找有效的干預(yù)措施。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以誘導(dǎo)HCMEC 炎癥和鐵死亡，DMF 干預(yù)可通過(guò)激活Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 通路，減輕H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 損傷。

鐵死亡是一種鐵離子依賴的由脂質(zhì)過(guò)氧化引起的程序性細(xì)胞壞死形式；被描述為一種自噬性細(xì)胞死亡過(guò)程［12-13］。鐵死亡在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷和心律失常中發(fā)揮著重要作用［14-15］。然而，目前有關(guān)鐵死亡與AF 發(fā)生發(fā)展的研究較少。FANG 等［16］發(fā)現(xiàn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的鐵死亡通過(guò)惡化鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失調(diào)參與脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥相關(guān)新發(fā)AF 的發(fā)生。在快速心房起搏構(gòu)建的犬AF 動(dòng)物模型中，心臟成纖維細(xì)胞起源的外泌體能夠通過(guò)分泌miR-23a-3p 來(lái)調(diào)控SLC7A11 促進(jìn)鐵死亡，參與AF 的持續(xù)發(fā)展［17］。本研究首次報(bào)道H2O2可以誘導(dǎo)HCMEC 鐵死亡。H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 細(xì)胞TNF-α、IL-1β 和IL-18 等炎癥因子升高的同時(shí)，引起GPX4 下降和ACSL4 上升。細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)引起GPX4 下降，ACSL4 上升［18］。心血管保護(hù)性多肽Elabela 也能夠抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的HCMEC 鐵死亡，減輕高血壓心肌結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙［19］。上述研究均提示內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用。因此靶向改善HCMEC 鐵死亡可作為AF 潛在治療的干預(yù)靶點(diǎn)。

DMF 可作為Nrf2 通路的調(diào)節(jié)劑在多種疾病中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用［20-21］。DMF 有緩解心肌缺血再灌注損傷，改善動(dòng)脈粥樣硬化等作用［22-23］，但是并未有研究報(bào)道DMF 對(duì)H2O2介導(dǎo)的HCMEC 損傷的作用及潛在機(jī)制。本研究首次發(fā)現(xiàn)DMF 可顯著改善H2O2誘導(dǎo)的HCMEC 鐵死亡。DMF 在抑制彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤中JAK/STAT 信號(hào)通路的同時(shí)，還誘導(dǎo)了細(xì)胞的鐵死亡［24］。JAK2/STAT1 通路已被報(bào)道具有改善細(xì)胞衰老和抑制炎癥的作用，且我們的前期研究證實(shí)TNFSF18 蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)STAT1 的磷酸化改善冠脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［25］。為明確DMF 在H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和鐵死亡中的作用，使用Nrf2 抑制劑ML385 干預(yù)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)ML385 可有效逆轉(zhuǎn)DMF 對(duì)H2O2介導(dǎo)HCMEC 的細(xì)胞增殖和鐵死亡，表面DMF 通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1和JAK2/STAT1 通路保護(hù)HCMEC 鐵死亡的發(fā)生。

同時(shí)本研究也存在一定局限性。只對(duì)HCMEC細(xì)胞進(jìn)行造模，沒(méi)有直接從AF 患者心臟中獲得組織來(lái)提取原代細(xì)胞，這一定程度上限制了我們細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證據(jù)的可靠性。此外，我們使用了Nrf2 的抑制劑來(lái)下調(diào)Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 的表達(dá)。盡管也能證明DMF 通過(guò)Nrf2 來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用，但仍可能需要對(duì)Nrf2 基因進(jìn)行敲除［26］，或者動(dòng)物模型中來(lái)進(jìn)一步明確DMF 對(duì)AF 內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)激活Nrf2 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H2O2通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥和鐵死亡介導(dǎo)HCMEC 損傷，而DMF 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 和JAK2/STAT1 通路改善H2O2介導(dǎo)HCMEC 的細(xì)胞鐵死亡，可能是潛在的治療AF 的藥物。后續(xù)可進(jìn)一步探索DMF 是否具有改善AF電生理機(jī)制的作用。