高效分子排阻色譜法測(cè)定涉藥品不良反應(yīng)注射用曲克蘆丁中多糖和蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)

張 琪，于德志，高 倩，李會(huì)輕，楊 釗

（山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局海洋中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

曲克蘆丁是在槐米等植物部位提取的蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮類(lèi)化合物，常用于抑制紅細(xì)胞和血小板凝聚，防止血栓形成，改善微循環(huán)，增加血氧含量，促進(jìn)新血管形成及側(cè)支循環(huán)建立，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低毛細(xì)血管通透性［1-2］等，也常用于治療缺血性腦血管靜脈炎及血管通透性增高所致水腫、骨關(guān)節(jié)炎等癥［3-4］。臨床應(yīng)用時(shí)監(jiān)測(cè)到3 批注射用曲克蘆丁的藥品不良反應(yīng)（ADR）聚集性信號(hào)，患者均有寒戰(zhàn)、發(fā)熱（體溫最高39.3 ℃）等臨床表現(xiàn)，并偶見(jiàn)血壓降低等過(guò)敏性休克。監(jiān)管部門(mén)懷疑該品種存在熱原反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，但按其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［5］檢驗(yàn)，細(xì)菌內(nèi)毒素低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度，且其他質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目均符合規(guī)定。故對(duì)3 批涉ADR和3 批正常注射用曲克蘆丁制劑進(jìn)行了一系列質(zhì)量安全性再評(píng)價(jià)。先進(jìn)行了內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法研究，3 批涉ADR 樣品中有2 批的內(nèi)毒素含量高于同測(cè)的3 批正常樣品的10 倍，且接近限值，質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)差異明顯［6］。在此基礎(chǔ)上，基于ADR 報(bào)告提及的過(guò)敏性休克及呼吸困難癥狀，進(jìn)行了2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》豚鼠主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)研究［7］，結(jié)果均為陰性?？紤]到該方法靈敏度較差，又采用了較高靈敏度的直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)（DPRA）［8］對(duì)本次涉ADR 制劑進(jìn)行了致敏性預(yù)測(cè)研究，結(jié)果均為陰性。DPRA 多用于預(yù)測(cè)小分子致敏，存在一定局限性，且有研究報(bào)道中藥注射劑在輸液過(guò)程中有微粒增加嫌疑，而微粒異物也是熱原樣反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)等發(fā)生的原因［9-11］。曲克蘆丁的制備具有天然產(chǎn)物來(lái)源特性，使其易殘留大分子物質(zhì)，故本研究中建立了高效分子排阻色譜（HPSEC）法對(duì)涉ADR 注射用曲克蘆丁中多糖和蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)進(jìn)行篩查，以分析ADR 發(fā)生原因?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 series 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配有示差折光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器；BT125D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；CF16RXⅡ型多用途離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

1.2 試藥

注射用曲克蘆丁（規(guī)格為每支0.1 g，涉ADR 批號(hào)分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407，正常批號(hào)分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207），曲克蘆丁原料藥（批號(hào)為YL-417），四羥乙基蘆丁（單獨(dú)制備，批號(hào)為4Q-016），均由國(guó)內(nèi)A 公司提供；曲克蘆丁原料藥（國(guó)內(nèi)B公司，批號(hào)為XD-081）；右旋糖酐對(duì)照品［批號(hào)為140637 - 646 - 201203，D6（Mp 64 650），D7（Mp 135 350），D8（Mp 300 600）］，核糖核酸酶A（批號(hào)為140653 - 201806，Mp 13 700），人胰島素（批號(hào)為140654-201806，Mp 5 808），胸腺肽α1（批號(hào)為140655-201806，Mp 3 108），生長(zhǎng)抑素（批號(hào)為140656-201806，Mp 1 638），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（BSA，Solar Life Science，批號(hào)為929F052，相對(duì)分子質(zhì)量為66 000）；乙腈、三氟乙酸（美國(guó)Thermo Fisher公司）；甘露醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖檢測(cè)

2.1.1 色譜條件

色譜柱：TSKgel G4000PWXL 凝膠柱（300 mm ×7.8 mm，10 μm）；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：純化水；流速：0.5 mL/ min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL（對(duì)照品溶液），50 μL（供試品溶液）。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取右旋糖酐對(duì)照品（D6，D7，D8）適量，精密稱(chēng)定，分別加水制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，備用。

供試品溶液：取樣品1支，加水3 mL使溶解，取1 mL，置3 000 Da 超濾離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為7 450 r/ min，溫度為19 ℃）40 min，取出離心管，去除下層液體，上層液體用3～5 mL水沖洗（用移液槍吹打混勻），再離心35～40 min，重復(fù)2～3次，直至下層液體Molish反應(yīng)呈陰性，將上層超濾管中的殘留液體用水定容至5 mL，待測(cè)。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取2.1.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果右旋糖酐對(duì)照品（D6，D7，D8）保留時(shí)間（tR）分別為17.690，16.481，15.473 min。以對(duì)照品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)、tR（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= - 3.316 3X+ 33.594，R2= 0.994 5。結(jié)果表明，右旋糖酐的相對(duì)分子質(zhì)量在64 650～300 600 范圍內(nèi)與tR線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限確定：取右旋糖酐對(duì)照品（D6）適量，精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為0.102 mg/mL 的溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)?.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3∶1時(shí)的進(jìn)樣量確定檢測(cè)限。結(jié)果檢測(cè)限為0.102 μg。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下右旋糖酐對(duì)照品（D6）溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄tR。結(jié)果的RSD為1.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下右旋糖酐對(duì)照品（D6）溶液適量，分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄tR。結(jié)果的RSD為1.76%（n=6），表明待測(cè)溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 樣品中多糖測(cè)定

分別取涉ADR（批號(hào)分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407）和正常（批號(hào)分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207）樣品，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄tR和峰面積。結(jié)果6批制劑均在15.5 min出現(xiàn)1個(gè)吸收峰，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)該樣品峰與右旋糖酐對(duì)照品（D8）吸收峰（tR=15.473 min，峰面積為223 345.0）的位置基本一致，表明樣品中所含多糖類(lèi)大分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為300 000。從樣品的tR和峰面積看（表1），涉ADR 樣品與正常樣品的數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異，表明涉ADR樣品發(fā)生質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)的原因與多糖類(lèi)大分子物質(zhì)無(wú)關(guān)。同法測(cè)定甘露醇，發(fā)現(xiàn)于15.5 min出現(xiàn)1個(gè)吸收峰，與樣品峰基本重合，可見(jiàn)該峰很有可能由輔料甘露醇引入。涉ADR 樣品（批號(hào)為ADR-206）、正常樣品（批號(hào)為NORM-106）、甘露醇、右旋糖酐對(duì)照品（D8）的HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖1 涉ADR樣品（批號(hào)為ADR-206）、正常樣品（批號(hào)為NORM-106）、甘露醇及右旋糖酐對(duì)照品（D8）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ADR-related samples（batch number：ADR-206），normal samples（batch number：NORM-106），dannitol and dextran（D8）reference substance

表1 涉ADR樣品、正常樣品的保留時(shí)間和峰面積Tab.1 Retention time and peak area of ADR - related and normal samples

2.2 蛋白檢測(cè)

2.2.1 色譜條件

色譜柱：TSKgel G2000SWXL 凝膠柱（300 mm ×7.8 mm，10 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.05，V/V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；進(jìn)樣量：10 μL（對(duì)照品溶液），50 μL（供試品溶液）。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別取生長(zhǎng)抑素、胸腺肽α1、人胰島素、核糖核酸酶A 各1 mg，精密稱(chēng)定，分別置5 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得。取BSA 1 mg，精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液。

供試品溶液：取樣品1支，加水3 mL使溶解，取1 mL，置3 000 Da 超濾離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為7 450 r/ min，溫度為19 ℃）40 min，上層液體約剩余400 μL，加水3～5 mL 沖洗（用移液槍吹打混勻），棄去下層液體，再離心35～40 min，重復(fù)2～3 次，直至下層液體Molish 反應(yīng)陰性，將上層超濾管中的殘留液體定容至5 mL，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，加水稀釋成一定濃度的系列對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果BSA、核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺肽α1、生長(zhǎng)抑素的tR分別為6.927，8.141，9.003，9.811，10.252 min。以對(duì)照品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)、tR為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= - 2.129 3X+ 17.100 1，R2= 0.991 7。結(jié)果表明，蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在1 638～66 000范圍內(nèi)與tR線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限確定：取生長(zhǎng)抑素對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為0.177 mg/ mL 的溶液，混勻，逐級(jí)稀釋?zhuān)?.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）為3∶1時(shí)的進(jìn)樣量確定檢測(cè)限。結(jié)果檢測(cè)限為0.003 6 μg。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的核糖核酸酶A 對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄tR。結(jié)果的RSD為0.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的人胰島素對(duì)照品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄tR。結(jié)果的RSD為0.42%（n=6），表明待測(cè)溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 樣品中蛋白測(cè)定

分別取涉ADR（批號(hào)分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407）和正常（批號(hào)分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207）樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖2），涉ADR的3批樣品的吸收峰面積均顯著高于3批正常樣品，核糖核酸酶A對(duì)照品的tR為8.141 min，峰面積為3 139.041 3。由表2 可知，涉ADR 樣品中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的含量為正常樣品的3倍，樣品中所含蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的吸收峰與核糖核酸酶A對(duì)照品峰tR相近，推測(cè)涉ADR 樣品中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為13 700。

S. 核糖核酸酶A對(duì)照品溶液 A - F. 供試品溶液（批號(hào)分別為ADR - 007，ADR-206，ADR-407，NORM-106，NORM-107，NORM-207）圖2 高效液相色譜圖S.Ribonuclease A reference solution A-F.Test solution（batch numbers：ADR - 007，ADR-206，ADR-407，NORM-106，NORM-107，and NORM-207，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

表2 涉ADR樣品、正常樣品的保留時(shí)間和峰面積Tab.2 Retention time（tR）and peak area of ADR - related and normal samples

為進(jìn)一步考察注射用曲克蘆丁制劑原輔料中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的含量，取2 批（批號(hào)分別為YL - 417，XD-081）原料藥、1批四羥乙基蘆?。ㄅ?hào)為4Q-016），加入甘露醇和BSA 對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖3）、tR及峰面積（表3）。可見(jiàn)，制劑對(duì)應(yīng)原料廠家的曲克蘆丁原料藥中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于同測(cè)第三方廠家的20 倍；四羥乙基蘆丁中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的含量遠(yuǎn)低于曲克蘆丁原料藥，可能與單獨(dú)小批量生產(chǎn)質(zhì)量控制嚴(yán)格有關(guān)；甘露醇同條件下蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的含量也極低，此處無(wú)參考價(jià)值。從吸收峰tR來(lái)看，2 批曲克蘆丁原料藥及四羥乙基蘆丁中吸收峰位置的蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量均小于BSA的66 000，大于核糖核酸酶A的13 700。

A.BSA B. 核糖核酸酶A對(duì)照品 C，D. 曲克蘆丁原料藥（批號(hào)分別為YL-417，XD-081） E. 甘露醇 F. 四羥乙基蘆?。ㄅ?hào)為4Q-016）圖3 原輔料與對(duì)照品溶液高效液相色譜圖A.BSA B.Ribonuclease A reference substance C，D.Raw material of troxerutin（batch number：YL-417，XD-081） E.Mannitol F.Tetrahydroxyethyl rutin（batch number：4Q-016）Fig.3 HPLC chromatograms of raw materials and reference solution

表3 原輔料與對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積Tab.3 Retention time（tR）and peak area of materials and reference materials

3 討論

注射用曲克蘆丁為中藥注射劑，其主成分曲克蘆丁有天然產(chǎn)物來(lái)源特性，制備過(guò)程中易引入大分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)通過(guò)靜脈直接進(jìn)入體內(nèi)后有足夠時(shí)間與免疫細(xì)胞直接接觸而激活免疫反應(yīng)，形成抗原，且分子量越大，抗原性越強(qiáng)。注射用曲克蘆丁制劑有效成分曲克蘆丁相對(duì)分子質(zhì)量為742.69，輔料甘露醇相對(duì)分子質(zhì)量為182.172，均小于1 000，而該品種現(xiàn)行法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)大分子物質(zhì)質(zhì)控指標(biāo)，不排除涉ADR 批次注射用曲克蘆丁過(guò)敏性休克等為致敏作用引發(fā)的可能性，故本研究中對(duì)該制劑及其原輔料中大分子物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定與分析。

首先，采用HPSEC 法測(cè)得注射用曲克蘆丁涉ADR樣品中所含蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)明顯高于正常樣品，其相對(duì)分子質(zhì)量大于13 700，遠(yuǎn)大于主成分和輔料的相對(duì)分子質(zhì)量，按峰面積算約為正常樣品含量的3 倍。進(jìn)一步對(duì)原輔料大分子物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，涉ADR 樣品對(duì)應(yīng)原料廠家提供的曲克蘆丁原料藥蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于第三方廠家提供原料藥的20 倍，且其相對(duì)分子質(zhì)量在13 700～66 000 范圍內(nèi)。綜合考慮，可基本確認(rèn)注射用曲克蘆丁制劑發(fā)生ADR 的原因?yàn)楫a(chǎn)品中蛋白類(lèi)大分子物質(zhì)含量偏高所致，且含量偏高可能由其原料藥導(dǎo)致，同時(shí)生產(chǎn)中活性炭及微孔濾芯等關(guān)鍵環(huán)節(jié)大分子物質(zhì)去除工藝也存在缺陷。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是很好的抗原［12］，但大分子蛋白可升高組胺等活性介質(zhì)水平而誘發(fā)過(guò)敏［13-14］。結(jié)合前期研究涉ADR 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量偏高，不排除樣品中測(cè)得大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能類(lèi)似內(nèi)毒素，引發(fā)熱原或類(lèi)熱原效應(yīng)。

藥品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制和驗(yàn)證都是極關(guān)鍵的步驟。大分子物質(zhì)的控制必須保證入廠原輔料質(zhì)量把關(guān)、生產(chǎn)工藝品控關(guān)鍵點(diǎn)應(yīng)有效。注射劑大分子物質(zhì)臨床應(yīng)用時(shí)直接進(jìn)入血液，極可能導(dǎo)致速發(fā)型超敏反應(yīng)［15］，但高分子雜質(zhì)具有高度不均一性和不確定性，且其本身不穩(wěn)定，去除和定量均存在難度。針對(duì)產(chǎn)生該狀況的原因，原輔料入廠質(zhì)量把關(guān)及生產(chǎn)工藝中各環(huán)節(jié)關(guān)鍵點(diǎn)的質(zhì)量控制至關(guān)重要。原輔料入廠時(shí)應(yīng)建立適宜大分子物質(zhì)的測(cè)試方法，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)；實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，活性炭吸附［16］或兩級(jí)微孔超濾系統(tǒng)［17］是去除大分子物質(zhì)的主要環(huán)節(jié)，故應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)環(huán)節(jié)活性炭吸附率是否達(dá)標(biāo)或去除干凈［18］，超濾是否及時(shí)更換或有無(wú)漏點(diǎn)，驗(yàn)證工作是否滿足質(zhì)控要求。著力改進(jìn)、優(yōu)化生產(chǎn)工藝流程對(duì)去除大分子物質(zhì)、減少注射劑過(guò)敏反應(yīng)有積極意義［19］，生產(chǎn)中宜對(duì)中間產(chǎn)品和終端產(chǎn)品就大分子物質(zhì)建立適宜的測(cè)試方法進(jìn)行質(zhì)量把控或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。