蚊母草提取物對乳腺癌MDA-MB-231 細胞體外運動能力的影響

姜思琴，田會茹，傅蔚然，卓董良，呂紅，付劍江（.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 00069）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居首位，而且是主要的癌癥致死原因之一[1]。在乳腺癌死亡病例中，超過90%的患者死于癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤遠處轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞脫離原發(fā)病灶，通過各種方式到達繼發(fā)組織或器官，繼續(xù)增殖生長，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)性腫瘤的過程。它包括原發(fā)腫瘤細胞的侵出、進入脈管系統(tǒng)、侵入繼發(fā)組織、在繼發(fā)組織的克隆生長等諸多步驟，其中腫瘤細胞的遷移、侵襲等運動能力是其轉(zhuǎn)移能力的決定性因素之一[3]。尋找有效的抗轉(zhuǎn)移活性化合物對抗腫瘤治療具有重要意義[4]。

蚊母草（Veronica peregrinaL.）是玄參科婆婆納屬植物蚊母草帶蟲癭的全草，也稱為接骨仙桃草，具有活血、止血、清肺熱、和肝胃的功效。江西民間常將其用于骨折的治療，療效顯著[5]。研究[6-7]證實，蚊母草具有促進骨質(zhì)形成的作用。本課題組前期研究[8]表明，蚊母草可顯著抑制乳腺癌細胞誘導(dǎo)的破骨細胞活化，其機制與抑制骨形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2活化相關(guān)。Runx2 不僅在骨骼發(fā)育和骨形成中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，而且Runx2 基因還異位表達于乳腺細胞及乳腺癌細胞，參與乳腺發(fā)育和乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[9]。因此，本研究擬從乳腺癌細胞入手，觀察蚊母草對腫瘤細胞體外運動能力的影響，并初步探討其可能的作用機制，以期為蚊母草抗轉(zhuǎn)移藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞及其培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231 細胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞庫，由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室傳代、保管。細胞用含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3～4 d 傳代1 次，取30 代以內(nèi)細胞用于實驗。

1.2 藥物制備及試劑 蚊母草采自江西省九江市，經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院中藥室許妍主任藥師鑒定為玄參科婆婆納屬植物蚊母草（Veronica peregrinaL.）的干燥地上部分。蚊母草提取物（EVP）的制備方法：取帶蟲癭的蚊母草全草20 kg 粉碎成粗粉，用95%乙醇回流提取3 次，合并醇提液；減壓濃縮得浸膏，蒸餾水混懸后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和含水正丁醇萃取。其中，得到乙酸乙酯部位84 g，總黃酮鑒別反應(yīng)呈陽性，作為本課題的研究用藥。實驗中以二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，配制成濃度為總提物1.075 g·mL-1的母液（相當(dāng)于生藥濃度為256 g·mL-1），實驗前將母液以培養(yǎng)基稀釋為所需濃度。在細胞培養(yǎng)體系中，DMSO 的終體積分?jǐn)?shù)不超過0.5%。

BB-94（廣譜基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，批號：7155）、Calcein AM（批號：5975），均為美國Selleck公司；人纖維連接蛋白（批號：08953），德國Merck公 司； SensoLyte?570 Generic MMP Assay Kit（批號：131062），美國AnaSpec 公司；Platpus OrisTM細胞侵襲檢測試劑盒（批號：56455），安諾倫（北京）生物科技有限公司； Alexa Fluor488?鬼筆環(huán)肽（Phalloidin，批號：12379），美國ThermoFisher 公司；抗phospho-Runx2（Ser340）多克隆抗體（批號：119513），美 國Invitrogen 公 司；Anti-rabbit IgG，HRP- linked Antibody（批 號： 0753）， 美 國Cell Signaling Technology 公司；MTT 試劑盒（批號：21109）、抗Runx2 單克隆抗體（批號：10683）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體（批號：03126）、抗β-actin 抗體（批號：09705），均購自英國Abcam 公司。

1.3 主要儀器 AP48 Chamber system，美國Neuro Probe 公司；Victor3 型多功能酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司；EC3 型凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；ELx800 型酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；PowerPacTM通用電泳儀、Trans-Blot 轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad 公司；DMI 3000B 型熒光倒置顯微鏡，德國Leica 公司；BX63 型熒光正置顯微鏡，日本Olympus 公司。

1.4 MTT 法檢測細胞體外存活情況 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞，制成單細胞懸液，并接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞密度為每孔5×103個。經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)基，更換含終質(zhì)量濃度分別為生藥40、80、160、320、640 g·L-1（相當(dāng)于提取物濃度0.168、0.336、0.672、1.344、2.688 mg·mL-1）EVP 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將各孔中的培養(yǎng)基更換為含終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基，室溫下孵育4 h。隨后每孔加入200 μL DMSO，溶解甲臜顆粒，并采用酶標(biāo)儀測定在450 nm和570 nm 波長處的吸光度值。以空白組為100%生存率，計算各EVP 處理組的細胞相對存活率。

1.5 乳腺癌細胞體外遷移實驗 參考相關(guān)研究[10]方法檢測EVP 對MDA-MB-231 細胞體外遷移的影響。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，并將細胞懸液終濃度調(diào)整為2×106個·mL-1。在AP48 Chamber 的下孔內(nèi)，每孔加入30 μL 含0.1%纖維連接蛋白的無血清DMEM，蓋上PVDF 膜后裝好Chamber，上孔加入細胞懸液100 μL。將上述細胞分為空白組、陽性對照組（BB-94 組）、EVP 不同濃度組，每組3 個復(fù)孔，其中空白組加入等體積溶劑，陽性對照組加入終濃度為20 nmol·L-1的BB-94，EVP 組則分別加入終質(zhì)量濃度為生藥40、80、160 g·L-1的EVP。將上述AP48 Chamber 置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育16 h；拆下Chamber，取出PVDF 濾膜，甲醇固定10 min， 以50 mg·mL-1結(jié)晶紫溶液染色30 min。用棉簽小心擦除上層未穿膜的細胞，在顯微鏡下計數(shù)上、中、下、左、右5 個視野內(nèi)的細胞數(shù)，計算平均值。

1.6 乳腺癌細胞體外侵襲實驗 參考相關(guān)研究[11]方法利用OrisTM細胞侵襲試劑盒檢測EVP 對MDA-MB-231 細胞體外侵襲能力的影響。收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞，制備密度為6×105個·mL-1的單細胞懸液。取細胞懸液100 μL，在Stopper 的輔助下接種于細胞培養(yǎng)板。經(jīng)5 h 貼壁后，小心拔除培養(yǎng)板中的Stopper，并加入Calcein AM 終濃度為0.5 μg·mL-1的無血清培養(yǎng)基；37 ℃下孵育40 min 后，在熒光倒置顯微鏡下拍照，作為0 h 對照。細胞經(jīng)PBS 洗滌后，按照“1.5”項下的分組方法，更換含不同干預(yù)藥物的完全細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，各組細胞同前述方法采用Calcein AM 染色并拍照，以確定各組細胞的侵襲情況。

1.7 鬼筆環(huán)肽染色法檢測細胞F-actin 排列情況 收集對數(shù)生長期MDA-MB-231 細胞，制備密度為2×106個·mL-1的細胞懸液。取8 孔ChamberSlide 系統(tǒng)（美國NuncTM公司），每孔加入細胞懸液200 μL，37 ℃下培養(yǎng)24 h。按照“1.5”項下的分組方法，更換含不同干預(yù)藥物的完全細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，去除Chamber，在Slide 上滴加Alexa Fluor488?Phalloidin，避光孵育15 min；在熒光正置顯微鏡下拍照，觀察細胞骨架F-actin 的排列情況。

1.8 Western Blot 法檢測細胞Runx2、p-Runx2、MMP-9 蛋白表達 將MDA-MB-231 細胞按照“1.5”項下方法干預(yù)及培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，采用考馬斯亮藍法測定總蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入Runx2、p-Runx2、MMP-9 一抗（1∶500），4 ℃下孵育過夜；經(jīng)TTBS 洗膜后，加入二抗（1∶1 000），室溫下孵育2 h；洗膜，DAB 顯色劑顯色，采用EC3型凝膠成像系統(tǒng)拍照；采用ImagePro Plus 5 軟件分析條帶光密度值，以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.9 細胞MMPs 活性檢測 采用SensoLyte?570 Generic MMP 檢測試劑盒分析EVP 對MDA-MB-231細胞MMPs 活性的影響。收集對數(shù)生長期MDA-MB-231 細胞，制備密度為1×107個·mL-1的細胞懸液。在96 孔板中每孔加入100 μL 細胞懸液，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h。按照“1.5”項下分組方法，更換含不同干預(yù)藥物的完全細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，各組細胞經(jīng)乙酸-4-氨基苯汞處理1 h，隨后加入50 μL MMP 底物，小心混勻后在37 ℃下孵育50 min；隨后終止反應(yīng)，并采用Victor3 型多功能酶標(biāo)儀測定發(fā)射波長540 nm、吸收波長575 nm 的熒光強度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EVP 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞體外存活率的影響 結(jié)果見圖1。EVP 的終濃度分別為生藥40、80、160、320、640 g·L-1時，MDA-MB-231 細胞相對存活率分別為（105.63±4.62）%、（92.81±8.34）% 、（103.32 ± 17.47）% 、（69.08 ± 4.32）% 、（41.82±12.63）%。結(jié)果提示，低濃度EVP 對MDAMB-231 細胞的生存無明顯影響，而高濃度EVP 則對MDA-MB-231 細胞生存有一定抑制作用。因此，為了避免細胞死亡對遷移、侵襲結(jié)果的干擾，后續(xù)研究中采用生藥40、80、160 g·L-1作為各EVP 處理組的終濃度。

圖1 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞體外存活率的影響（±s，n=3）Figure 1 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the in vitro cell viability of MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

2.2 EVP 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞體外遷移能力的影響 結(jié)果見圖2、表1。與空白組相比，BB-94 組及EVP 生藥40、80、160 g·L-1濃度組的遷移細胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，不同濃度EVP 均可顯著抑制MDA-MB-231 細胞遷移。

表1 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞體外遷移能力的影響（±s，n=3）Table 1 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the in vitro cell migration of MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

表1 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞體外遷移能力的影響（±s，n=3）Table 1 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the in vitro cell migration of MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

注：EVP 濃度以生藥計。與空白組比較，**P＜0.01

遷移細胞數(shù)/個1 257.75±123.12 302.50±36.96**909.25±52.39**760.50±44.12**525.25±136.10**組別空白組BB-94 組EVP 組濃度/（g·L-1）-20 nmol·L-1 40 80 160

圖2 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞體外遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 2 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the in vitro cell migration of MDA-MB-231 cells（Crystallized purple staining，×200）

2.3 EVP 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞體外侵襲能力的影響 結(jié)果見圖3。0 h 時，各組細胞培養(yǎng)孔中均存在一個圓形無細胞區(qū)，無明顯差異。經(jīng)48 h 培養(yǎng)后，空白組的絕大多數(shù)細胞可突破基質(zhì)膠，侵襲至中央空白處，幾乎完全覆蓋中央圓形無細胞區(qū)域；而BB-94 組及EVP 各濃度組的MDA-MB-231 細胞侵襲則明顯被抑制，均不能完全侵襲至中央?yún)^(qū)域，且中央無細胞區(qū)域的大小呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖3 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞體外侵襲能力的影響（Calcein AM 染色，×40）Figure 3 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the in vitro cell invasion of MDA-MB-231 cells（Calcein AM staining，×40）

2.4 EVP 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞骨架的影響結(jié)果見圖4。空白組MDA-MB-231 細胞中，F(xiàn)-actin沿細胞長軸整齊排列，F(xiàn)-actin 在細胞周邊聚集成應(yīng)力纖維；而BB-94 組及EVP 各濃度組的MDA-MB-231 細胞內(nèi)，F(xiàn)-actin 均呈無規(guī)則的紊亂排列，應(yīng)力纖維明顯減少。結(jié)果表明，EVP 能夠干擾MDA-MB-231 細胞骨架F-actin 的排列。

圖4 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞F-actin 排列的影響（鬼筆環(huán)肽染色，×630）Figure 4 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on the arrangement of F-actin in MDA-MB-231 cells（Phalloidin staining，×630）

2.5 EVP 對乳腺癌細胞Runx2 活性的影響 結(jié)果見圖5。與空白組相比，EVP 生藥40、80、160 g·L-1濃度組MDA-MB-231 細胞的Runx2 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），而p-Runx2 蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果提示，EVP 可能可以通過抑制Runx2 的活化，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

圖5 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞Runx2、p-Runx2 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 5 Effects of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on protein expressions of Runx2 and p-Runx2 in MDA-MB-231 cells（± s，n=3）

2.6 EVP 對乳腺癌細胞MMPs 活性的影響 結(jié)果見圖6、表2。與空白組相比，EVP 生藥40、80、160 g·L-1濃度組MDA-MB-231 細胞的MMP-9 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01），MMPs 活性明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，EVP 能夠抑制MDAMB-231 細胞的MMPs 活性。

表2 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞MMPs活性的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on MMPs in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

表2 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞MMPs活性的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on MMPs in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

注：EVP 濃度以生藥計。與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

相對熒光強度2 453.67±407.77 1 526.00±179.85*838.33±31.09**636.33±116.42**組別空白組EVP 組濃度/（g·L-1）-40 80 160

圖6 蚊母草提取物（EVP）對MDA-MB-231 細胞MMP-9 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 6 Effects of extracts from Veronica peregrina L.（EVP）on protein expression of MMP-9 in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

3 討論

蚊母草最早記載于清代趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，《江西民間草藥驗方》[12]也有收錄：“蚊母草，別稱仙桃草、接骨仙桃草，是玄參科植物Veronica peregrinaL. 帶蟲癭的全草，生于原野及田野的潮濕地區(qū)?！蔽媚覆菪詼亍⑽犊?、無毒，具有活血、止血、清肺熱、和肝胃的功效，用于治療跌打損傷、咳嗽痰中帶血、咽喉腫痛、肝胃氣痛、疝痛、痛經(jīng)等病癥。在江西民間，蚊母草常用于傷科，特別是對骨折患者療效顯著[5]。另外，跳骨片、六味骨仙飲等含有蚊母草的中藥復(fù)方制劑也常用于骨折或骨質(zhì)疏松的治療?，F(xiàn)代藥理研究[7]表明，蚊母草可以促進骨折的愈合以及對骨缺損具有顯著的治療作用。蚊母草對于骨折以及骨質(zhì)疏松等以促進骨質(zhì)形成作為治療原則的疾病療效顯著，提示對于乳腺癌所導(dǎo)致的破骨性骨轉(zhuǎn)移，同樣需要促進骨形成、抑制骨破壞，蚊母草可能具有治療作用。本課題組前期研究[8]表明，蚊母草提取物（EVP）可顯著抑制乳腺癌細胞誘導(dǎo)的破骨性骨轉(zhuǎn)移，可能與抑制破骨細胞Runx2 活化有關(guān)。

Runx2 又稱核心結(jié)合因子α1（Core-binding factor α1，CBFA1），是一種屬于Runt 結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子。最初，Runx2 被發(fā)現(xiàn)在骨骼發(fā)育和骨形成中具有至關(guān)重要的作用，是骨發(fā)育中的一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[13]。近年來大量研究[14-15]表明，Runx2 基因還可異位表達于乳腺細胞和乳腺癌細胞，參與乳腺發(fā)育和乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等過程中，Runx2 參與了腫瘤細胞的局部侵潤和遠處傳播過程，是腫瘤細胞侵襲和遷移的重要調(diào)節(jié)蛋白。有證據(jù)[16]表明，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移性能與細胞內(nèi)Runx2 的活化程度密切相關(guān)，活化的Runx2 可刺激多種基質(zhì)蛋白、細胞外基質(zhì)信號因子以及基質(zhì)蛋白水解酶等的活性，使腫瘤細胞的組織侵襲和遠處遷移更加容易。研究[11]表明，乳腺癌MDA-MB-231 細胞中穩(wěn)定表達的MMP-13 是Runx2 的靶基因之一，其活性直接受Runx2 的影響。通過SiRNA 的方法敲除Runx2 基因，導(dǎo)致MDA-MB-231 細胞的MMP-9 表達明顯下調(diào)；而在低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MCF-7 中引入Runx2 基因后，則可上調(diào)包括MMP-2、MMP-9、MMP-13 在內(nèi)的多種蛋白水解酶[17]。由此可見，高轉(zhuǎn)移性的腫瘤細胞內(nèi)的多種基質(zhì)蛋白水解酶是Runx2 的靶基因，其活性受到Runx2 的嚴(yán)格調(diào)控。本研究在以往對破骨細胞的研究[8]基礎(chǔ)上，以乳腺癌MDA-MB-231 細胞為對象，觀察了EVP 對其體外遷移、侵襲等運動行為的影響。結(jié)果表明，EVP可顯著抑制MDA-MB-231 細胞的體外遷移、侵襲，并干擾細胞骨架F-actin 排列。提示蚊母草對于腫瘤細胞的體外運動能力具有明顯的抑制作用，通過進一步的機制研究證實其對乳腺癌MDA-MB-231 細胞的Runx2 活化同樣具有抑制作用。

綜上所述，EVP 可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞的體外運動能力，具有潛在的抗轉(zhuǎn)移作用，其機制可能與抑制Runx2 活化有關(guān)。因此，后續(xù)研究將以Runx2 活性抑制為方向，對蚊母草的有效成分進行分離、篩選，以期為新型作用機制的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療藥物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。