朱頂紅曼谷玫瑰-愈傷組織途徑再生體系的建立

楊維　劉心怡　曾晶玨　吳坤林 　房林　吳沙沙　翟俊文　曾宋君

關(guān)鍵詞：朱頂紅；試管苗葉片；植物生長調(diào)節(jié)劑；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

朱頂紅為石蒜科（Amaryllidaceae）朱頂紅屬（Hippeastrum Herb.）多年生球根花卉的總稱，原產(chǎn)南美洲。其品種繁多，花朵碩大，5～6 朵喇叭狀花著生在一個(gè)直徑3～4 cm 的中空花葶上，花色艷麗且豐富，常被用于園林綠化或盆栽于室內(nèi)，也可應(yīng)用于切花觀賞[1]。此外，朱頂紅屬植物含有大量的生物堿，藥用價(jià)值高，可應(yīng)用于多種醫(yī)藥產(chǎn)品[2-3]。近年來，我國從國外大量引種并進(jìn)行了市場銷售，但引種的朱頂紅種苗昂貴，嚴(yán)重地影響其產(chǎn)業(yè)化推廣。

朱頂紅鱗莖的自然繁殖率較低，特別是引種的品種極少長出仔球，難以進(jìn)行分球繁殖。朱頂紅的傳統(tǒng)繁殖方式可采用播種和扦插等[4]，但由于商品朱頂紅品種多為雜交種，自交后性狀會(huì)發(fā)生分離，不能保持母株的優(yōu)良性狀，只應(yīng)用于新品種的培育；特別是重瓣型的品種多沒有子房，不能獲得種子。而采用鱗片扦插進(jìn)行規(guī)?；敝?，需要大量的種球且所需時(shí)間長、受季節(jié)影響大，繁殖效率相對(duì)較低[5-6]。組織培養(yǎng)技術(shù)是植物快繁最有效的方法之一，繁殖過程不受病蟲和環(huán)境脅迫的危害[7-8]。目前國內(nèi)外對(duì)朱頂紅的組織培養(yǎng)研究已有一些報(bào)道[9-11]，大多以鱗莖為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，增殖效率普遍較低，本研究對(duì)100多個(gè)品種的以芽繁芽的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，大部分品種均存在這個(gè)問題，難以進(jìn)行規(guī)?；焖俜敝?。有關(guān)愈傷組織途徑再生體系的研究較少。植物愈傷組織再生體系的建立不僅可以達(dá)到快速繁殖的目的，還可獲得良好的基因轉(zhuǎn)化受體材料，具有高效轉(zhuǎn)化率、嵌合體少及無性系變異小等優(yōu)點(diǎn)[12]。張慧等[13]和于波等[14]分別以無菌苗小鱗莖和幼嫩花梗為外植體建立了胚性愈傷組織途徑的再生體系，DE ALMEIDA 等[15]以內(nèi)花被片為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為48%。但是，以這些器官作為外植體不可避免地存在資源和時(shí)間受限的問題。

本研究以白肋品種朱頂紅曼谷玫瑰鱗莖來源的無菌苗葉片基部為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化、生根及移栽研究，以期建立一種高效的愈傷組織途徑再生體系，為朱頂紅工廠化繁殖提供技術(shù)支撐，同時(shí)為其后續(xù)的分子育種提供優(yōu)良的受體材料。

1 材料與方法

1.1 材料

朱頂紅曼谷玫瑰的鱗片作為外植體在MS+6-BA 5.00 mg/L 培養(yǎng)基上經(jīng)不定芽途徑誘導(dǎo)出的不定芽，再經(jīng)二次繼代以上的無菌苗葉片基部為外植體。

1.2 方法

基本培養(yǎng)基均為MS 固體培養(yǎng)基，并添加蔗糖30 g/L、瓊脂4.8 g/L，滅菌前pH 調(diào)為5.80，在121 ℃、104 kPa 條件下滅菌20 min。接種后培養(yǎng)于（25±2）℃、光照周期為12 h/d、光照強(qiáng)度為2500～3000 Lux 的培養(yǎng)室中。

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 將繼代培養(yǎng)的生長健壯、長勢(shì)一致的試管苗取出置于無菌操作臺(tái)上，然后將葉片基部白色部分切成0.5 cm×0.5 cm 左右的方形小塊，置于添加不同濃度的2，4-D（0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/L）和TDZ（0.50 mg/L）的MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理10 瓶，每瓶10 個(gè)外植體，重復(fù)3 次。45 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=（每瓶誘導(dǎo)出愈傷組織的葉片數(shù)/每瓶接種的葉片數(shù)）×100%。

1.2.2 愈傷組織的增殖 將生長狀態(tài)一致的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm 小塊，轉(zhuǎn)接在添加不同濃度的6-BA（0、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L）的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每周觀察1 次其生長情況，培養(yǎng)20 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖指數(shù)及芽分化系數(shù)。生物增重倍數(shù)=培養(yǎng)20 d 時(shí)每瓶愈傷組織團(tuán)的重量/接種時(shí)每瓶愈傷組織的重量，愈傷組織增殖倍數(shù)=培養(yǎng)20 d 后每瓶愈傷組織的重量（去除不定芽后的愈傷組織重量）/接種時(shí)每瓶愈傷組織的重量，不定芽分化率=（每瓶分化出芽的愈傷組織數(shù)/每瓶接種的愈傷組織數(shù)）×100%。

1.2.3 愈傷組織的分化 將經(jīng)增殖后的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm 小塊，接種在添加不同濃度6-BA（0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L）、KT（0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L）、NAA（0、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L）及其組合的MS 培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種10 瓶，每個(gè)瓶5 個(gè)外植體，重復(fù)3 次。培養(yǎng)30 d 后，將愈傷組織對(duì)半切成2 份，轉(zhuǎn)接在相同培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。再培養(yǎng)30 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化系數(shù)。分化系數(shù)=每瓶分化出的不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)，成苗系數(shù)=每瓶長出的具有獨(dú)立小鱗莖并有2 片以上葉片的植株數(shù)/每瓶接種的愈傷組織數(shù)。

1.2.4 不定芽的生根與移栽 將經(jīng)分化后得到的株高約3～4 cm 的小苗去除植株上部分葉片，分別接種在不同濃度NAA（0、0.10、0.20 mg/L）和IBA（0、0.50、1.00、1.50 mg/L）組合的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個(gè)處理10 瓶，每瓶接種8 株小苗，重復(fù)3 次。30 d 后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、根長及株高。生根率=（每瓶生根的小鱗莖數(shù)/每瓶接種的小鱗莖數(shù)）×100%。平均根數(shù)=每瓶小鱗莖根總數(shù)/每瓶小鱗莖數(shù)。

將經(jīng)生根后的小植株從培養(yǎng)瓶中取出，用自來水洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至椰糠∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1 的基質(zhì)中培養(yǎng)。移栽苗數(shù)300 株，移栽后60 d 時(shí)觀察植株生長狀況并統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 和SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用鄧肯新復(fù)極差法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

無菌苗葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，1 周后，部分葉片逐漸膨大變厚，呈肉質(zhì)，2 周后，葉片切口處出現(xiàn)白毛狀愈傷組織，30～40 d 時(shí)，器官開始發(fā)生，部分葉片切口處開始分化出芽和淡黃色愈傷組織（圖1B），1 周內(nèi)將其愈傷組織與葉片切離，置于新鮮的相同培養(yǎng)基上，愈傷組織可膨大增殖（圖1C），如未及時(shí)與葉片分離，愈傷組織會(huì)隨后分化，60 d 時(shí)愈傷組織大部發(fā)會(huì)轉(zhuǎn)化為芽（圖1D）。由圖1A 可知，在培養(yǎng)基中加入0.50 mg/L TDZ，再添加2，4-D 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D 濃度的提高出現(xiàn)先增加后遞減的趨勢(shì)，且各處理之間呈現(xiàn)顯著性差異，在不添加2，4-D 的培養(yǎng)上未能誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片一直呈現(xiàn)初始狀態(tài)未啟動(dòng)。當(dāng)2，4-D 濃度達(dá)到2.00 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)39.67%。當(dāng)2，4-D5.00 mg/L 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為3.17%，大部分葉片黑化死亡。因此，朱頂紅曼谷玫瑰無菌苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.00 mg/L+TDZ 0.50 mg/L。

2.2 愈傷組織的增殖

為了保持愈傷組織曼谷玫瑰材料，設(shè)置不同6-BA 濃度的培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織增殖進(jìn)行培養(yǎng)，每7 d 觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的增殖狀態(tài)。前1 周愈傷組織處于受傷恢復(fù)期，表面稍褐化，增殖不明顯，第2 周時(shí)愈傷組織處于生長高峰期，體積迅速擴(kuò)大，質(zhì)地變得蓬松，第3 周愈傷組織增殖緩慢。15～20 d 時(shí)的體積沒有太大差別。由表1 可知，5 種處理下，愈傷組織均能增殖，增殖效果隨6-BA 濃度遞增呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)6-BA 濃度為2.00 mg/L 時(shí)，愈傷組織增殖倍數(shù)最大，達(dá)4.01 倍，未分化出芽，與其他濃度存在顯著性差異。當(dāng)6-BA 濃度在2.00 mg/L 以下時(shí)，愈傷組織的生物增重和不定芽分化率較高，尤其是沒有添加6-BA 時(shí)，愈傷組織分化率100%，只有極少一部分繼續(xù)保持為愈傷組織狀態(tài)。由此得出，6-BA 濃度過高過低都不利于愈傷組織增殖，低濃度6-BA 下，愈傷組織易分化，曼谷玫瑰愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.00 mg/L（圖2）。

2.3 愈傷組織分化

愈傷組織接入到不同濃度KT 和不同濃度KT+NAA 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d 時(shí)，大部分愈傷組織顏色由鮮黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榇渚G色，開始分化出芽點(diǎn)，30 d 時(shí)長成肉眼可見的不定芽，45 d 時(shí)不定芽明顯茁壯，60 d 時(shí)部分不定芽形成獨(dú)立的小植株，葉片健壯。而在不同濃度6-BA 和不同濃度6-BA+NAA 培養(yǎng)基上的愈傷組織，20 d 后，大部分愈傷組織依舊保持鮮黃色，與KT 處理組相比，只有少數(shù)有綠色小芽點(diǎn)，30 d 后有少數(shù)芽體出現(xiàn)，60 d 時(shí)形成小植株極少（圖3）。

由表2 可知，KT 處理組愈傷組織分化率顯著高于6-BA 處理組，當(dāng)KT 0.50 mg/L 時(shí)愈傷組織分化系數(shù)最高，達(dá)10.59，平均每團(tuán)愈傷組織出苗數(shù)為5.67，平均株高為6.83 cm；其次為KT0.75 mg/L 時(shí)，愈傷組織分化系數(shù)為8.33，平均每團(tuán)愈傷組織出苗數(shù)為2.58，平均株高為4.83 cm；當(dāng)6-BA 濃度為1.00 mg/L，NAA 濃度為1.00 mg/L時(shí)，愈傷組織分化系數(shù)最低，為1.30，平均每團(tuán)愈傷組織出苗數(shù)為0.17，平均株高2.07 cm。因此，本研究得出，NAA 對(duì)曼谷玫瑰愈傷組織的分化沒有顯著影響，KT 有利于愈傷組織分化，6-BA 對(duì)愈傷組織分化效果不顯著，最佳愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+KT 0.50 mg/L。

2.4 不定芽的生根培養(yǎng)和試管苗移栽

由表3 可知，在不同濃度IBA 和NAA 組合的MS 培養(yǎng)基上，朱頂紅的絕大部分不定芽能生根，但是不同處理間存在差異。NAA 濃度為0 時(shí)，不定芽生根率、平均根數(shù)、平均株高隨IBA 濃度增加呈現(xiàn)先上升后遞減趨勢(shì)，而后，在培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA，不定芽生根效果不顯著。在本研究中，雖然對(duì)照組生根率100%，平均根數(shù)4.3，平均根長最長2.63 cm，但是該處理下根細(xì)長，平均株高也只有3.89 cm，植株整體表現(xiàn)較為瘦弱矮小。當(dāng)愈傷組織在IBA 0.50 mg/L 和IBA1.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L 時(shí)出根效果最佳，二者生根率均為100%，前者平均根數(shù)為4.85，平均根長為1.48，平均株高為6 cm，后者平均根數(shù)為6.57，平均根長1.28，平均株高4.38（圖4）?？紤]到節(jié)約成本，推薦以MS+IBA 0.50 mg/L 作為曼谷玫瑰的最佳生根培養(yǎng)基。后將生根后植株轉(zhuǎn)入溫室，移栽至椰糠∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1 的基質(zhì)中培養(yǎng)，存活率達(dá)93.33%。

3 討論

朱頂紅愈傷組織離體再生體系的建立對(duì)其種苗的快繁和分子育種遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立具有重要價(jià)值。目前，朱頂紅的組織培養(yǎng)研究中，多以鱗莖為外植體建立再生體系，以不定芽進(jìn)行增殖難以獲得愈傷組織，繁殖周期長、繁殖率較低[16-18]，而以花蕾、子房[19]、幼嫩蒴果[20]、花梗[14]和花瓣[15]等進(jìn)行朱頂紅離體再生研究時(shí)，雖然可以獲得愈傷組織，但受取材時(shí)間、數(shù)量等的限制。本研究以朱頂紅曼谷玫瑰鱗莖來源繼代2 次以上的無菌苗葉片基部為外植體，不受取材數(shù)量和取材時(shí)間的限制，成本低且效率高[21]。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，由朱頂紅曼谷玫瑰溫室中栽培的幼嫩葉片或鱗莖來源的初代組培或第一次繼代的小植株葉片基部為材料難以誘導(dǎo)出愈傷組織，說明朱頂紅葉片直接誘導(dǎo)愈傷組織的難度大，需要在培養(yǎng)基上多次繼代幼化后才能誘導(dǎo)出愈傷組織。

植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[22-23]。人工合成的TDZ 作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠誘導(dǎo)外植體從愈傷組織形成到體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一些反應(yīng)[24]。近年來，TDZ 已被廣泛應(yīng)用于植物形態(tài)發(fā)生研究，在朱頂紅屬植物中常與6-BA和NAA搭配使用[25-26]。張慧等[13]認(rèn)為2，4-D 濃度變化對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著影響。AMANI 等[6]認(rèn)為2，4-D 2.00 mg/L時(shí)朱頂紅鱗片愈傷組織誘導(dǎo)率最高。本研究中，葉片在2，4-D 2.00 mg/L 和TDZ 0.50 mg/L 激素濃度組合下愈傷組織誘導(dǎo)率最佳，與于波等[14]的研究結(jié)果基本一致，但是誘導(dǎo)率要低，其原因可能是基因型和外植類型不同所導(dǎo)致。

誘導(dǎo)出的愈傷組織具有胚性能進(jìn)行快速繼代增殖和分化是建立高效愈傷組織再生體系的關(guān)鍵，朱頂紅的愈傷組織可直接分化出芽或形成體細(xì)胞胚。已知2，4-D 或TDZ 可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，但是對(duì)體胚的發(fā)育有抑制作用[27]，HUANG 等[28]研究認(rèn)為2，4-D 與TDZ 組合使用會(huì)抑制朱頂紅體細(xì)胞胚進(jìn)一步發(fā)育形成完整植株，我們?cè)陬A(yù)備實(shí)驗(yàn)中也獲得了這樣的結(jié)論。6-BA 在朱頂紅再生體系建立中使用頻率很高，很多研究表明，6-BA 是朱頂紅不定芽增殖的主要因子[29]。而2，4-D、TDZ常應(yīng)用于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖。本研究中，2，4-D 和TDZ 有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但在添加2，4-D、TDZ 或其組合的培養(yǎng)上，大部分愈傷組織會(huì)生長停滯或死亡，而將愈傷組織置于合適的6-BA 濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的有效增殖。本研究篩選得到6-BA 濃度為2.00 mg/L 時(shí)，愈傷組織的增殖效果最好，增殖倍數(shù)可達(dá)到4.01 倍，在20 d 的繼代周期內(nèi)，愈傷組織不會(huì)分化，但如果不及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，愈傷組織會(huì)分化。

6-BA 和KT 同屬嘌呤型細(xì)胞分裂素[30]，以往研究表明，6-BA 在朱頂紅不定芽誘導(dǎo)方面也具有較優(yōu)表現(xiàn)[10， 31]，AMIR 等[32]研究認(rèn)為6-BA 對(duì)朱頂紅不定芽的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于KT，且誘導(dǎo)所需時(shí)間更短，當(dāng)6-BA 濃度為4.00 mg/L 時(shí)，分生組織不定芽誘導(dǎo)率達(dá)84%。此外，不少學(xué)者將6-BA與NAA 結(jié)合進(jìn)行朱頂紅不定芽誘導(dǎo)均取得較好的結(jié)果[23， 33-35]。但是，魯嬌嬌等[25]研究表明，在6-BA 和NAA 兩種植物生長調(diào)節(jié)劑配合下，朱頂紅花孔雀和黑天鵝的鱗片啟動(dòng)率很低。當(dāng)培養(yǎng)基中含有合適濃度的細(xì)胞分裂素KT 時(shí)，可以提高分蘗的不定芽和不定根數(shù)[36]。本研究中，在不同濃度6-BA、KT 的MS 培養(yǎng)基中添加NAA，愈傷組織的分化效果并不明顯，使用單一的植物生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，KT 的分化效果顯著優(yōu)于6-BA，最佳愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+KT 0.50 mg/L 時(shí)，分化率可達(dá)100%，分化系數(shù)達(dá)10.59。由此可推斷，不同種或?qū)俚闹参飳?duì)細(xì)胞分裂素及與NAA 結(jié)合的分化效果不同。

本研究以朱頂紅曼谷玫瑰葉片為外植體，建立了愈傷組織途徑的高效再生體系，獲得的愈傷組織能夠快速增殖，每15～20 d 時(shí)間內(nèi)增殖倍數(shù)可達(dá)4.01，多次繼代后依舊能保持原始狀態(tài)，即質(zhì)地蓬松，顏色金黃，具有較強(qiáng)的分化能力。平均每0.5 cm×0.5 cm 的愈傷組織團(tuán)60 d 就可分化出5.67 株可直接生根的小苗。以朱頂紅曼谷玫瑰試管苗葉片為外植體建立的愈傷組織再生體系，不僅可以增加增殖倍數(shù)，縮短增殖周期，滿足種苗工廠化育苗生產(chǎn)的需求，還能為有效的轉(zhuǎn)基因體系的建立提供基礎(chǔ)并應(yīng)用于分子育種。