滋膵通脈飲對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制

吳剛強(qiáng)，袁春云，毛 葉，陳 琪，溫小鳳，譚 軍，卜獻(xiàn)春，李 非

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院老干科/全國(guó)名老中醫(yī)藥專家卜獻(xiàn)春傳承工作室,湖南 長(zhǎng)沙 410006;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

目前,糖尿病呈全球蔓延趨勢(shì),是造成世界范圍內(nèi)人類死亡和疾病負(fù)擔(dān)的主要原因之一,已成為全球人類共同面對(duì)的一個(gè)重大健康問(wèn)題。糖尿病心肌病是糖尿病的一種常見血管并發(fā)癥,以心肌結(jié)構(gòu)和功能異常為特征。目前,關(guān)于糖尿病心肌病的治療涉及降糖、降脂、控制血壓、改善心肌重構(gòu)等,有效地控制血糖仍是治療糖尿病心肌病的基本手段。然而,多種降糖藥物存在一定的不良反應(yīng),如噻唑烷二酮類、二肽基肽酶-4抑制劑沙格列汀和阿格列汀均可增加心力衰竭住院風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。近年來(lái),關(guān)于糖尿病心肌病新的治療手段不斷涌現(xiàn),但糖尿病心肌病的高發(fā)病率和高病死率仍然困擾著廣大臨床醫(yī)務(wù)工作者;因此,仍需開發(fā)新的治療糖尿病和糖尿病心肌病的藥物。中醫(yī)藥治療糖尿病療效確切,具有毒副作用小、價(jià)格低廉、患者依從性好的優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期研究表明,應(yīng)用益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的滋膵通脈飲治療糖尿病心肌病可取得顯著的療效[3-4]。自噬可消除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,是維持細(xì)胞器功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵生物過(guò)程。自噬的影響因素很多,包括高血糖、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等,這些影響因素可通過(guò)相關(guān)的信號(hào)通路導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[5-6]。研究顯示,自噬參與糖尿病心肌病的病理生理過(guò)程[7-9]?；诖?本研究通過(guò)觀察滋膵通脈飲對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響,探討滋膵通脈飲含藥血漿對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制,以期為滋膵通脈飲治療糖尿病心肌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞20只無(wú)特定病原體級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)公司,體質(zhì)量 200～280(250±20)g,飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),溫度23 ℃,濕度60%,每12 h 交替照明,自由飲食、飲水。大鼠H9c2心肌細(xì)胞由長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司提供。

1.2 藥物、主要試劑與儀器滋膵通脈飲由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房提供,由黃芪、生地、麥冬、玄參、山茱萸、天花粉、地龍、生蒲黃、丹參、川芎、鬼箭羽、全蝎、水蛭、僵蠶、山楂等藥物組成,藥物質(zhì)量濃度為4 400 g·L-1;恩格列凈購(gòu)自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20201008)。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8) 購(gòu)自上海滬震有限公司,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源業(yè)生物科技有限公司,p62、微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3( microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗及山羊抗小鼠 IgG二抗、辣根過(guò)氧化氫酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司,Beclin-1抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司,轉(zhuǎn)膜緩沖液、10× 麗春紅染液、脫脂奶粉、放射免疫沉淀裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑、胰蛋白酶消化液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、細(xì)胞凍存液均購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)沙Abiowell公司,蛋白酶抑制劑購(gòu)自北京金泰宏達(dá)公司,顯影液、定影液購(gòu)自上海佳信公司,達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,雙抗(青鏈霉素)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Rapamycin購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自瑞士Nest公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京亞泰隆公司,直熱式CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海三藤儀器公司,倒置生物顯微鏡購(gòu)自北京中顯恒業(yè)儀器公司,低速離心機(jī)購(gòu)自上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司,WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 滋膵通脈飲含藥血漿的制備按隨機(jī)數(shù)字表法將20只SD大鼠分為空白血漿組和滋膵通脈飲組,每組10只。2組大鼠均按照臨床70 kg成人劑量的5倍給藥,滋膵通脈飲組大鼠每天給予10 mL·kg-1滋膵通脈飲灌胃,空白血漿組大鼠給予等劑量的滅菌超純水灌胃,連續(xù)灌胃 7 d。末次灌胃1 h 后,予以100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉,然后采集腹主動(dòng)脈血,乙二胺四乙酸二鈉抗凝,3 000 r·min-1離心15 min分離血漿,0.22 μm 濾膜過(guò)濾,56 ℃恒溫水浴鍋中滅活30 min,然后分裝至無(wú)菌EP管中,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)將H9c2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜,用預(yù)冷的培養(yǎng)液將細(xì)胞同步化處理,然后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組,分別加入稀釋后的胎牛血清、空白血漿組血漿及滋膵通脈飲組血漿,每組設(shè)置體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%的濃度梯度;干預(yù)24 h后,吸棄上清,各孔中滴加10 μL CCK-8,繼續(xù)置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,然后檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度值,以吸光度值表示細(xì)胞的增殖能力,吸光度值越高表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3.4 細(xì)胞毒性比色法檢測(cè)LDH釋放率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞鋪板在96孔板中,待細(xì)胞貼壁后分為正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組。正常對(duì)照組細(xì)胞不加任何藥物干預(yù);高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和體積分?jǐn)?shù)10%空白血漿組血漿;高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組細(xì)胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和體積分?jǐn)?shù)10%滋膵通脈飲組血漿;高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組細(xì)胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和0.01 μmol·L-1恩格列凈,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h;分別加入60 μL的LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑,混勻,室溫下使用水平搖床避光孵育30 min,應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算LDH釋放率,LDH釋放率=[(實(shí)驗(yàn)組A值-總自然釋放A值)/(最大釋放組A值-總自然釋放A值)]×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞,按“1.3.4”項(xiàng)分組培養(yǎng)24 h后,用不含乙二胺四乙酸胰酶消化,收集細(xì)胞;PBS洗滌細(xì)胞2次,每次2 000 r·min-1離心5 min,收集約3.2×105個(gè)細(xì)胞;加入500 μL的Binding buffer 懸浮細(xì)胞,然后加入5 μL人膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)混勻后,再加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,充分混勻,室溫避光反應(yīng)10 min;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)H9c2細(xì)胞中p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞,按“1.3.4”項(xiàng)分組培養(yǎng)24 h后,用冰預(yù)冷PBS洗滌1次,加入200 μL 放射免疫沉淀裂解液冰上裂解10 min;4 ℃下12 000 r·min-1離心 15 min,取上清液1.5 mL,應(yīng)用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度;取100 μL蛋白上清,加入25 μL 5×loading buffer混勻,沸水煮5 min,放入冰盒中速冷備用;應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,恒定電壓75 V電泳130 min,然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜;用脫脂奶粉封閉,室溫放置90 min;滴加p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗(滴度均為15 000),4 ℃孵育過(guò)夜;然后,使用HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG二抗(滴度為15 000)或HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(滴度為16 000)室溫孵育90 min,用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution with tween-20,PBST)清洗3次,每次約15 min;使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯色;應(yīng)用WD-9413A型凝膠系統(tǒng)成像,Image J 軟件分析灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖情況比較結(jié)果見表1。體積分?jǐn)?shù)5%、15%濃度時(shí),正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.741、6.041,P<0.05);滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力顯著低于正常對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);正常對(duì)照組與空白對(duì)照組H9c2細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 10%濃度時(shí),正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.110,P>0.05),說(shuō)明體積分?jǐn)?shù)10%含藥血漿對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響最小,故選用體積分?jǐn)?shù)10%含藥血漿作為含藥血漿干預(yù)濃度。

表1 正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力比較 Tab.1 Comparison of proliferation ability of H9c2 cells among the normal control group,blank control group and Zicui Tongmai Yin group

2.2 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率分別為(2.63±0.29)%、(42.89±2.60)%、(14.35±0.27)%、(17.56±2.26)%。 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.527、23.836、21.617,P<0.01);高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組和高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組H9c2細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 14.933、11.723,P<0.05);高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.995,P>0.05)。

A:正常對(duì)照組;B:高糖誘導(dǎo)組;C:高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組;D:高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組。圖1 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡情況 Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

2.3 常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞LDH釋放率比較正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞LDH 釋放率分別為(4.54±0.85)%、(44.33±1.72)%、(16.28±0.85)%、(18.71±2.20)%。正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞LDH 釋放率顯著低于高糖誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=58.660、31.408、26.557,P<0.01);高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組和高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組H9c2細(xì)胞LDH 釋放率顯著高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.167、11.740,P<0.05);高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞LDH 釋放率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.801,P>0.05)。

2.4 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見圖2和表2。正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞中p62、Bax表達(dá)顯著低于高糖誘導(dǎo)組,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2顯著高于高糖誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高糖誘導(dǎo)組H9c2細(xì)胞中Bcl-2/Bax顯著低于正常對(duì)照組和高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高糖誘導(dǎo)組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞中Bcl-2/Bax比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組和高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組H9c2細(xì)胞中p62、Bax顯著高于正常對(duì)照組,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2/Bax顯著低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表達(dá)水平及Bcl-2/ Bax比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:正常對(duì)照組;B:高糖誘導(dǎo)組;C:高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組;D:高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組。圖2 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of p62,Bax,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2 protein in H9c2 cells in the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

表2 正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組、高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞中p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression levels of p62,Bax,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2 protein in H9c2 cells among the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

3 討論

糖尿病是一種以慢性高血糖為特點(diǎn)的代謝性疾病,近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。糖尿病心肌病是糖尿病常見并發(fā)癥,氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和晚期糖基化產(chǎn)物的堆積是糖尿病心肌病的早期特征。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展,逐步出現(xiàn)左心室肥厚和收縮功能不全,最后導(dǎo)致心力衰竭。糖尿病心肌病常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的變性壞死、細(xì)胞凋亡,以及心肌細(xì)胞重建和心功能減退。目前,針對(duì)糖尿病心肌病治療措施主要包括降糖、降脂、控制血壓、改善心肌重構(gòu)等,而有效地控制血糖是治療的基本手段;然而,多種降糖藥物存在一定的不良反應(yīng)。中醫(yī)藥治療糖尿病療效確切,具有毒副作用小、價(jià)格低廉、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)。滋膵飲出自于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,原方由黃芪、生地、山藥、山萸肉、生豬胰組成,用于治療消渴。中藥復(fù)方滋膵通脈飲為湖南省名中醫(yī)卜獻(xiàn)春教授在原方基礎(chǔ)上加減而成,功效為益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)。該方在臨床應(yīng)用了多年,療效滿意,得到了患者的一致好評(píng)。前期研究顯示,該方不僅能改善糖脂代謝和氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、減輕胰島素抵抗,而且還能改善糖尿病心肌病心肌纖維化,改善心肌重構(gòu)[3-4,10-12];但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。因此,本研究應(yīng)用大鼠H9c2心肌細(xì)胞探討中藥復(fù)方滋膵通脈飲對(duì)糖尿病心肌病治療的效果和機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,5%、15%濃度時(shí),滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力顯著低于正常對(duì)照組、空白對(duì)照組;10%濃度時(shí),正常對(duì)照組、空白對(duì)照組和滋膵通脈飲組H9c2細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明10%含藥血漿對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響最小,故選用10%含藥血漿作為含藥血漿干預(yù)濃度。LDH是存在于細(xì)胞質(zhì)的一種酶,當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí),LDH即釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。因此檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的量可以作為測(cè)定受損細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)組H9c2細(xì)胞凋亡率和LDH 釋放率顯著高于正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組,高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率和LDH 釋放率顯著高于正常對(duì)照組,高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞凋亡率和LDH 釋放率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說(shuō)明,高糖刺激下的H9c2心肌細(xì)胞凋亡率和LDH釋放率明顯上升,提示心肌細(xì)胞損傷;而滋膵通脈飲和恩格列凈可抑制H9c2細(xì)胞凋亡和LDH 釋放,減輕心肌細(xì)胞損傷,且滋膵通脈飲和恩格列凈作用相當(dāng)。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制,通過(guò)吞噬受損的細(xì)胞器而形成自噬體,然后與溶酶體融合并降解其包裹的內(nèi)容物,在應(yīng)激條件下對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有極其重要的作用[13]。自噬在維持心臟的結(jié)構(gòu)、功能和心肌細(xì)胞完整性中發(fā)揮極其重要的作用。適度的自噬對(duì)心臟正常功能的維持尤其重要[14],但過(guò)度自噬可能引發(fā)心臟結(jié)構(gòu)、功能和心肌細(xì)胞完整性的異常。研究顯示,自噬紊亂與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),恢復(fù)正常的自噬水平對(duì)糖尿病心肌病有明顯的保護(hù)作用[15]。泛素連接蛋白 p62是反映自噬活性的蛋白,為自噬特異性降解底物,存在于多種細(xì)胞中,參與各種信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。當(dāng)自噬被激活時(shí),自噬體與溶酶體融合,溶酶體酶降解自噬囊泡中的p62,導(dǎo)致其水平下降;當(dāng)自噬被抑制時(shí)可以導(dǎo)致自噬體堆積,使p62 水平升高,出現(xiàn)自噬障礙。研究顯示,p62蛋白水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,p62的積累在自噬障礙中起著重要的作用[16]。LC3是p62的受體,為自噬小體的標(biāo)志蛋白,可作為自噬標(biāo)志物;LC3有LC3-I 和 LC3-Ⅱ 2種形式,通常以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值和p62表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值越高,表示自噬活性越強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)組H9c2細(xì)胞中p62表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組,高糖誘導(dǎo)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著低于正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組;高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明,高糖刺激可引起H9c2心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62顯著升高和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯下降,提示H9c2心肌細(xì)胞自噬發(fā)生障礙并加重了心肌細(xì)胞損傷;恩格列凈和滋膵通脈飲可通過(guò)抑制自噬相關(guān)蛋白p62和提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平而抑制心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞損傷。

Bax 是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白,可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。研究顯示,Bax水平與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系密切[19]。正常情況下,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax處于平衡狀態(tài),但在應(yīng)激狀態(tài)下,Bcl-2/Bax比值可發(fā)生轉(zhuǎn)變。因此,Bcl-2/Bax比值可用來(lái)評(píng)估細(xì)胞凋亡水平[20]。本研究結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)組H9c2細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組, Bcl-2及Bcl-2/Bax顯著低于正常對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組;高糖誘導(dǎo)組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組H9c2細(xì)胞中Bcl-2/Bax比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組和高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組Bax顯著低于正常對(duì)照,Bcl-2及Bcl-2/Bax顯著高于正常對(duì)照組;高糖誘導(dǎo)+中藥含藥血漿組與高糖誘導(dǎo)+恩格列凈組Bax、Bcl-2表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示,高糖刺激可引起H9c2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax明顯下降,導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞凋亡增加,從而引發(fā)H9c2心肌細(xì)胞損傷;恩格列凈和滋膵通脈飲可通過(guò)抑制Bax和促進(jìn)Bcl-2表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述,滋膵通脈飲可通過(guò)激活高糖誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞自噬,抑制H9c2細(xì)胞凋亡,從而減輕心肌細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路有關(guān),具體有待進(jìn)一步研究。