低氧環(huán)境下甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中期因子表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究

李吉 張建輝 謝中意 李君強(qiáng)

在中國，甲狀腺癌確診患者每年新增約20%。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺癌類型，占所有甲狀腺癌病例的75%～85%[1]，多發(fā)于女性，好發(fā)于20～55 歲年齡段。多數(shù)PTC進(jìn)展緩慢，患者預(yù)后良好，但仍有少數(shù)患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至血道傳播[2]。某些特定基因如鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 V600E 突變[3]、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）1-α 的異常激活等，可誘導(dǎo)PTC 發(fā)生且導(dǎo)致患者預(yù)后惡化[4]，因此明確腫瘤相關(guān)基因及其作用機(jī)制可為PTC 診療、預(yù)后評估提供有價值的信息。研究發(fā)現(xiàn)，HIF1-α 不僅能夠誘導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運蛋白等蛋白將化療藥物排出細(xì)胞，介導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性[5]，且能夠激活CD10、半乳糖凝集素3（galectin-3，gal3）等效應(yīng)分子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)PTC 細(xì)胞系的增殖和能量代謝途徑等[5-6]。低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞能夠分泌各種細(xì)胞因子，其中中期因子（Midkine）可誘發(fā)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制信號，增強(qiáng)癌細(xì)胞的血管生成和增殖活性[7]，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待明確。本研究旨在探討低氧環(huán)境下PTC 細(xì)胞中CD10、gal3 等蛋白的表達(dá)情況和相應(yīng)的分子生物學(xué)意義，闡述其對Midkine 表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)條件 人PTC 細(xì)胞系BCPAP 與TPC1 購于國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺，接種至含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。正常培養(yǎng)條件為37 ℃、5%氧氣（O2）、5%二氧化碳（CO2）。缺氧培養(yǎng)條件為37 ℃、1%O2、5%CO2。

1.1.2 主要試劑 lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（批號：11668030）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號：23225）購自美國ThermoFisher公司；HIF1-α、CD10、gal3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批號分別為ab179483、ab256494、ab209344 和ab9485）均購自美國abcam 公司；兔抗辣根過氧化物酶、鼠抗辣根過氧化物酶（批號為A0208 和A0216）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素報告酶試劑盒（批號：E1910）購自美國Promega 公司；ELISA 檢測試劑盒（批號：EH319RB）購自美國invitrogen 公司。HIF1-α小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列為5'-GAAACTCTTCCAAGCAATTTT-3'、CD-10 的編碼基因膜金屬肽內(nèi)切酶（membrane metalloendopeptidase endonuclide，MME）shRNA 序列為5'- CTAAGGTCTATCAAGTCAATC-3'、gal3 的編碼基因人可溶性半乳糖凝集素3（lectin galactoside binding soluble-3，LGALS3）shRNA 序列為5'-TGCCTCGCATGCTGATAACAA-3'，均由美國sigma 公司合成；HIF1-α cDNA、CD10 cDNA、gal3 cDNA、CD10 啟動子、gal3 啟動子均由華大基因公司合成。二甲基乙二酰氨基乙酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）購自美國selleckchem 公司，批號：S7483。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國sigma 公司，批號：67-68-5。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。取BCPAP 和TPC1 分為常氧組與缺氧組，常氧組正常培養(yǎng)，缺氧組缺氧培養(yǎng)。兩組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h 后使用RIPA 裂解液冰上裂解30 min，根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒方法檢測總蛋白；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，并使用5% BSA 室溫封閉1 h，4 ℃過夜；標(biāo)記相應(yīng)的一抗，抗體稀釋比例均為1∶1 000；室溫孵育30 min 后標(biāo)記相應(yīng)的二抗，稀釋比例為1∶5 000；使用ECL 發(fā)光液檢測蛋白灰度值。以GAPDH 為對照，檢測細(xì)胞中HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.2 DMOG 對缺氧組細(xì)胞HIF1-α、CD10 與gal3 表達(dá)的影響 取缺氧培養(yǎng)的BCPAP 和TPC1 分為DMOG 組和對照組，DMOG 組加入5 μl/孔1 mmol/L DMOG，對照組每孔使用等體積DMSO，培養(yǎng)24 h。參照1.2.1 采用Western blot 法計算兩組細(xì)胞HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3 不同缺氧時間下細(xì)胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達(dá)的檢測 BCPAP 和TPC1 細(xì)胞分別在低氧環(huán)境下培養(yǎng)0、2、4、6、12 與24 h。取出細(xì)胞，參照1.2.1 采用Western blot 法計算各組HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4 轉(zhuǎn)染HIF1-α shRNA 對CD10 與gal3 蛋白表達(dá)的影響 取正常培養(yǎng)的BCPAP 和TPC1，各分為實驗組和對照組，實驗組轉(zhuǎn)染HIF1-α shRNA，對照組轉(zhuǎn)染HIF1-α shRNA 的亂碼序列，培養(yǎng)48 h。參照1.2.1 采用Western blot 法檢測各組細(xì)胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 HIF1-α 與CD10、gal3 靶向性預(yù)測及驗證 取正常培養(yǎng)的BCPAP 和TPC1 細(xì)胞各分為4 組。MME 沉默實驗中，空白組轉(zhuǎn)染不含啟動子序列的空載質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染攜CD10 啟動子質(zhì)粒，HIF1-α 組共轉(zhuǎn)染攜CD10 啟動子和HIF1-α cDNA 質(zhì)粒，實驗組共轉(zhuǎn)染攜CD10 啟動子和CD10 cDNA 質(zhì)粒。LAGLS3 沉默實驗中，空白組轉(zhuǎn)染不含啟動子序列的空載質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染攜gal3 啟動子質(zhì)粒，HIF1-α 組共轉(zhuǎn)染攜gal3啟動子和HIF1-α cDNA 質(zhì)粒，實驗組共轉(zhuǎn)染攜gal3啟動子和gal3 cDNA 質(zhì)粒。各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。采用雙熒光素報告酶法。取各組細(xì)胞用PBS 清洗2 次，加入裂解緩沖液常溫?fù)u床震蕩裂解15 min；依次加入加入熒光素報告酶反應(yīng)液Ⅱ和stop&glo 液，測定各質(zhì)粒熒光值，進(jìn)行HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性驗證。

1.2.6 基因相關(guān)性分析 使用GEOmetadb 包完成GEO數(shù)據(jù)庫的檢索，確定備選數(shù)據(jù)集為GSE60542（n=92），使用GEOquery 包下載該數(shù)據(jù)集，經(jīng)log2 轉(zhuǎn)換進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；使用cor.test（）函數(shù)計算HIF1-α 和MME、LGALS3 之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，并使用plot（）函數(shù)繪制散點圖。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的檢測 取正常培養(yǎng)的BCPAP 和TPC1 各分為4 組，對照組轉(zhuǎn)染空載體，MME 敲低組轉(zhuǎn)染攜MME shRNA 質(zhì)粒，LGALS3 敲低組轉(zhuǎn)染攜LGALS3 shRNA 質(zhì)粒，實驗組共轉(zhuǎn)染MME shRNA 和LGALS3 shRNA 質(zhì)粒，低氧條件下培養(yǎng)48 h。采用Western blot 法檢測各組細(xì)胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8 不同缺氧時間和轉(zhuǎn)染細(xì)胞Midkine 表達(dá)的檢測 采用ELISA 法。BCPAP 和TPC1 細(xì)胞分別在低氧環(huán)境下培養(yǎng)0、2、4、6、12 與24 h。1.2.7 中各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h。取細(xì)胞上清液500 μl，4℃、6 000 r/min 離心5～10 min ，取上清液。參照ELISA 檢測試劑盒說明書方法，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 下的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液Midkine 水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用R（4.0.5）統(tǒng)計軟件。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。使用Pearson 相關(guān)分析計算基因間的關(guān)聯(lián)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的比較 相比常氧組，缺氧組細(xì)胞HIF1-α、CD10與gal3 蛋白相對表達(dá)量均顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1A。相比對照組，DMOG 組HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達(dá)水平也顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1B。

圖1 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的比較（A：缺氧對蛋白表達(dá)的影響；B：DMOG 對蛋白表達(dá)的影響）

2.2 不同缺氧時間下細(xì)胞HIF1-α、CD10 與gal3 蛋白表達(dá)的變化 細(xì)胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)總量呈現(xiàn)時間依賴性，均隨著低氧誘導(dǎo)時間增加而增加，見圖2。

圖2 不同缺氧時間下細(xì)胞HIF1-α、CD10與gal3蛋白表達(dá)總量的變化（A：BCPAP；B：TPC1）

2.3 轉(zhuǎn)染HIF1-α shRNA 細(xì)胞CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的比較 相比對照組，實驗組細(xì)胞中CD10 和gal3 蛋白相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染HIF1-α shRNA 細(xì)胞CD10 與gal3 蛋白表達(dá)的比較（A：蛋白電泳圖；B：CD10、gal3 蛋白表達(dá)的比較）

2.4 HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性檢測 相比空白組，其他各組熒光素酶相對活性均顯著提高（均P＜0.01）；提示HIF1-α cDNA 可通過直接與CD10 和gal3啟動子結(jié)合增強(qiáng)兩者的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，見圖4。

圖4 HIF1-α 與CD10、gal3 的靶向性檢測（A：BCPAP；B：TPC1）

2.5 HIF1-α 與MME、LGALS3 mRNA 的相關(guān)性分析在mRNA 水平上可觀察到HIF1-α 與MME 和LGALS3表達(dá)的相關(guān)系數(shù)分別為0.43 和0.58，均呈正相關(guān)（均P＜0.01），見圖5。

圖5 基因相關(guān)性分析（A：HIF1-α 與LGALS3 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性；B：HIF1-α 與MME mRNA 表達(dá)的相關(guān)性）

2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的比較 相比對照組，MME 敲低組CD10 蛋白相對表達(dá)量顯著下降，LGALS3 敲低組gal3 蛋白相對表達(dá)量顯著下降，實驗組CD10 和gal3 蛋白相對表達(dá)量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表達(dá)的比較（A：BCPAP 蛋白電泳圖；B：各組BCPAP 中蛋白表達(dá)的比較；C：TPC1 蛋白電泳圖；D：各組TPC1 中蛋白表達(dá)的比較）

2.7 不同缺氧時間和轉(zhuǎn)染細(xì)胞Midkine 表達(dá)的比較隨缺氧時間延長，細(xì)胞中Midkine 表達(dá)水平升高，見圖7A。低氧培養(yǎng)48 h 后，MME 敲低組、LGALS3 敲低組細(xì)胞中Midkine 表達(dá)水平相比對照組顯著降低，實驗組Midkine 表達(dá)水平進(jìn)一步下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖7B。

圖7 不同缺氧時間和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Midkine 表達(dá)水平的比較（A：不同缺氧時間下細(xì)胞Midkine 表達(dá)水平；B；不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞Midkine表達(dá)水平）

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)實體腫瘤呈現(xiàn)缺氧微環(huán)境，在實體腫瘤中，缺氧環(huán)境主要表現(xiàn)為脈管系統(tǒng)70～150 μm范圍內(nèi)O2由于腫瘤增殖而被快速消耗，因此腫瘤組織中的缺氧與內(nèi)部異常的血管增生、腫瘤細(xì)胞對O2需求的大幅增加高度相關(guān)[8]。缺氧帶來的影響主要為糖酵解途徑的改變，包括HIF1-α、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter-1，GLUT-1）、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶表達(dá)、磷酸甘油酸激酶1 等糖酵解途徑酶表達(dá)的異常，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)高糖酵解率，在這一過程中HIF1-α發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。HIF1-α 廣泛參與PTC 中的多條關(guān)鍵信號通路，如通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進(jìn)血管生成[9]，通過GLUT-1 介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的厭氧代謝[10]，通過碳酸酐酶IX（Carbonic anhydrase IX，CA-9）調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH[11]，通過p21、p27 等蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[12]。近年來，HIF1-α 對細(xì)胞外基質(zhì)的重塑以及對細(xì)胞遷移能力的調(diào)節(jié)日趨成為研究熱點，低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞能夠通過調(diào)節(jié)特定蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、MMP-9 的表達(dá)[13]，或是特定細(xì)胞因子如Midkine 的表達(dá)來激活免疫抑制信號，阻斷免疫微環(huán)境中CD8+、M1 巨噬細(xì)胞等效應(yīng)性免疫細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而誘發(fā)“冷腫瘤”的形成，嚴(yán)重削弱抑癌藥物作用[14]。因此明確低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵效應(yīng)分子，對尋找腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的潛在診療靶點十分必要。

DMOG 是具有細(xì)胞滲透和競爭性的脯氨酰羥化酶抑制劑，可導(dǎo)致HIF1-α 的積聚和穩(wěn)定，本研究使用缺氧與DMOG 模擬缺氧相結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCPAP 與TPC1 細(xì)胞系受DMOG 刺激后，gal3、CD10 的表達(dá)均顯著上升，且對低氧環(huán)境呈現(xiàn)時間依賴性。在PTC 患者中，gal3 與Midkine 表達(dá)相關(guān)，且與患者預(yù)后、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。Midkine 是一種肝素結(jié)合生長因子，最初由于在小鼠胚胎發(fā)生過程中高度表達(dá)而受到關(guān)注[16]，作為一種在腫瘤中大幅上升的可溶性分泌蛋白，Midkine 不僅可通過肉瘤家族基因（sarcoma family of genes，Src）/有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/ 磷脂肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖，缺氧狀態(tài)下，Midkine 還可與HIF1-α 結(jié)合介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下的血管生成[17-18]。已有報道表明CD10廣泛參與免疫抑制因子如IL-6、IL-8 的分泌[19-20]，在大多數(shù)惡性腫瘤中CD10 表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤分期呈現(xiàn)正相關(guān)[21]，腫瘤微環(huán)境中的缺氧條件被認(rèn)為是CD10表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵原因之一[22]。gal3 是一種結(jié)構(gòu)獨特的糖蛋白，廣泛參與纖維化、炎癥、癌癥等多種疾病背景，在細(xì)胞表面的免疫突觸中結(jié)合T 細(xì)胞抗原受體，抑制T 細(xì)胞的早期激活[23-24]，而在細(xì)胞內(nèi)gal3 可通過結(jié)合B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）結(jié)合抑制細(xì)胞凋亡[25]，但尚無相關(guān)研究證實CD10 與Midkine 之間的關(guān)聯(lián)。本研究雙熒光素報告酶實驗證實HIF1-α 可結(jié)合到CD10 與gal3 的啟動子上，并直接調(diào)節(jié)CD10 與gal3 的轉(zhuǎn)錄水平，檢測CD10、gal3敲低細(xì)胞系中Midkine 表達(dá)量變化可知，隨著CD10、gal3 的表達(dá)沉默，Midkine 的表達(dá)亦顯著下降，表明CD10、gal3 可在低氧環(huán)境下，誘導(dǎo)PTC 細(xì)胞系中Midkine 的表達(dá)。即在低氧環(huán)境中，HIF1-α 可通過直接調(diào)控CD10、gal3 表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)Midkine 的表達(dá)[26]。但小分子抑制劑或抗體阻斷HIF1-α 誘導(dǎo)的CD10、gal3的表達(dá)，及Midkine 的表達(dá)抑制以及相應(yīng)的細(xì)胞功能變化等，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HIF1-α 可通過調(diào)控CD10、gal3 影響Midkine 表達(dá)，為進(jìn)一步的診療靶點開發(fā)構(gòu)筑了生物學(xué)基礎(chǔ)。