依維莫司聯(lián)合RSL3 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制研究

劉永洋 焦德敏 劉翔 唐夏莉 陳君 陳清勇

肺癌是癌癥患者死亡的常見(jiàn)原因，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前肺癌患者的治療方法包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療、免疫治療、光動(dòng)力或激光治療等[2]，盡管晚期肺癌的治療已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但患者的5 年總生存率仍較低（約19%）[3]。鐵死亡是一種鐵依賴的、由脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基大量累積、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝障礙所致的程序性細(xì)胞死亡[4]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4 通過(guò)將過(guò)氧化物還原為相應(yīng)的醇，限制鐵依賴的有毒自由基的形成，從而抑制脂質(zhì)ROS 的生成[5]。（1S, 3R）-2-（2-氯乙?；?1-[4-（甲氧羰基）苯基]-2, 3, 4, 9-四氫-1H-吡啶（3, 4-B）吲哚-3-羧酸甲酯（RSL3）最初是在化學(xué)篩選中發(fā)現(xiàn)的一種鐵死亡誘導(dǎo)劑，可共價(jià)結(jié)合并抑制GPX4 活性導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物聚集，從而誘導(dǎo)鐵死亡[6]。RSL3 可誘導(dǎo)多種肺腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[7-9]，且通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）絲氨酸2 448 位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)一步降低癌細(xì)胞中的GPX4 蛋白水平[10]。但并非所有的肺癌細(xì)胞都對(duì)RSL3 敏感，聯(lián)合用藥是提高RSL3 療效的有效途徑[11]。依維莫司（everolimus，EVE）是一種選擇性的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）抑制劑，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑制mTORC1 可使癌細(xì)胞對(duì)GPX4 抑制誘導(dǎo)的鐵死亡敏感[12]。提示EVE 可能提高RSL3 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞鐵死亡的能力，兩者聯(lián)合治療肺腺癌可能是一種有前景的治療策略。本研究探討EVE 聯(lián)用RSL3 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞鐵死亡的作用及機(jī)制，為臨床治療肺腺癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人肺腺癌細(xì)胞系PC9 和H1299 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，添加100 U/ml 青霉素和100 mg/L 鏈霉素。所有細(xì)胞在37 ℃、5%二氧化碳（CO2）的濕化細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3 d 正常傳代。

1.2 主要試劑 FBS（批號(hào)：2437694）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640（批號(hào)：2022102404）培養(yǎng)基購(gòu)自南京森瑞生物；噻唑藍(lán)溴化四唑（thiazolyl blue bromide tetrazolium，MTT）（批號(hào)：E26688D183）購(gòu)自武漢博士德生物公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號(hào)：22102134）購(gòu)自廣州Biosharp 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：061919191015）、WB/IP 裂解液（批號(hào)：080922220930）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（批號(hào)：22041739）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：050222220908）購(gòu)自上海碧云天公司；酶抑制劑cOmplete Mini（批號(hào)：41410100）購(gòu)自德國(guó)Roche 公司；鐵比色分析試劑盒（批號(hào)：32564-32569）購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；鐵抑制素1（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）（批號(hào)：120086）、RSL3（批號(hào)：122224）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；EVE（批號(hào)：M1709-12）購(gòu)自美國(guó)Abmole 公司；GPX4 抗體（批號(hào)：GR3438547-3）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylatemammalian target of rapamycin，p-mTOR）（批號(hào)：7）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號(hào)：GR194633-9）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.3 方法

1.3.1 各組細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT 法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9 和H1299 接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/孔，培養(yǎng)24 h。兩種細(xì)胞分別分對(duì)照組（藥物濃度為0），不同濃度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）EVE 組，不同濃度（H1299 使用0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L濃度；PC9 使用1.000、2.000、4.000、8.000 μmol/L 濃度）RSL3 組，RSL3+EVE 組（上述不同濃度RSL3 加10.0 μmol/L EVE）。在檢測(cè)Fer-1 效果時(shí)，在上述各組處理基礎(chǔ)上加2 μmol/L Fer-1，每組重復(fù)5 次，并設(shè)置對(duì)照孔、調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入20 μl/孔5 g/L 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄MTT，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的吸光度。使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.2 各組細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）相對(duì)水平檢測(cè) 根據(jù)鐵比色分析試劑盒說(shuō)明書(shū)配制不同濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)品、還原試劑及反應(yīng)工作試劑。H1299 分別用10.0 μmol/L EVE（EVE組）、1.000 μmol/L RSL3（RSL3組）、10.0 μmol/L EVE+1.000 μmol/L RSL3（EVE+RSL3 組）處理，PC9 分別用10.0 μmol/L EVE（EVE 組）、8.000 μmol/L RSL3（RSL3 組）、10.0 μmol/L EVE+8.000 μmol/L RSL3（EVE+RSL3 組）處理，以不作處理的細(xì)胞為對(duì)照組。12 h 后收集細(xì)胞并與鐵檢測(cè)緩沖液按體積比1∶4 在冰上混合勻漿裂解，4 ℃、11 600 r/min 離心10 min，收集上清液；將緩沖液、還原劑、樣本反應(yīng)劑按93∶2∶5 的體積比配制鐵檢測(cè)試劑，再將上清液樣品與等體積的還原劑混合后11 600 r/min 離心5 min，留取上清液作為待測(cè)樣本。在96 微孔板中加入50 μl 上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本（均設(shè)兩組復(fù)孔），加入200 μl/孔的鐵反應(yīng)工作試劑，25 ℃暗室內(nèi)孵育30 min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各待測(cè)樣本中的Fe2+相對(duì)水平。

1.3.3 各組細(xì)胞中MDA 相對(duì)水平檢測(cè) MDA 是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化后分解的產(chǎn)物，可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平。取H1299 和PC9，參照1.3.2 分組。培養(yǎng)12 h 后收集細(xì)胞，根據(jù)MDA 檢測(cè)試劑盒方法用WB/IP 裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、11 200 r/min 離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣本。根據(jù)BCA 蛋白濃度檢測(cè)方法檢測(cè)樣本總蛋白濃度；分別取待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品，加入MDA 檢測(cè)工作液，混勻后100 ℃金屬浴加熱15 min，水浴冷卻至室溫，3 200 r/min 離心10 min；取上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定532 nm 處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品組所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本中的MDA 相對(duì)水平。

1.3.4 各組細(xì)胞內(nèi)mTOR/GPX4 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。取H1299 和PC9 接種于6孔板，參照1.3.2 分組。培養(yǎng)24 h 后每孔加適量細(xì)胞裂解液及酶抑制劑，冰上裂解30 min，提取總蛋白，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣本。根據(jù)BCA 蛋白定量計(jì)算樣品蛋白濃度，根據(jù)樣品蛋白濃度用裂解液調(diào)整各組總蛋白量，加入1/5 體積的上樣緩沖液后，100 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白、電轉(zhuǎn)膜、三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液（Tris buffer solution+Tween，TBST）+5% FBS 封閉液封閉1 h，聚偏氟乙烯膜條帶分別加入p-mTOR、GPX4 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，10 min/次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST 再次洗滌后，加入ECL 顯影液在暗室內(nèi)曝光顯影。使用Image J 軟件計(jì)算各個(gè)條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算p-mTOR、GPX4 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 8 和SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件測(cè)定數(shù)據(jù)并畫(huà)圖。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率的比較 與對(duì)照組比較，不同濃度EVE 組細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖1A（插頁(yè)）。與RSL3 組比較，EVE+RSL3 組細(xì)胞存活率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖1B（插頁(yè)）。與未加Fer-1 的RSL3 組、RSL3+EVE 組比較，加入Fer-1 后的RSL3 組和RSL3+EVE 組細(xì)胞存活率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖1C-F（插頁(yè)）。

圖1 各組細(xì)胞存活率的比較（A：不同濃度EVE 處理下，細(xì)胞存活率比較；B：RSL3 聯(lián)合EVE 處理，細(xì)胞存活率比較；C：Fer-1 干預(yù)下，各組H1299 細(xì)胞存活率比較；D：相差顯微鏡觀察各組H1299 細(xì)胞生長(zhǎng)情況，×40；E：Fer-1 干預(yù)下，各組PC9 細(xì)胞存活率比較；F：相差顯微鏡觀察各組PC9 細(xì)胞生長(zhǎng)情況，×40）

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+、MDA 相對(duì)水平比較 相比其他組，EVE+RSL3 組H1299 和PC9 細(xì)胞內(nèi)Fe2+和MDA 相對(duì)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+、MDA 相對(duì)水平比較（A：不同處理下，H1299 和PC9 細(xì)胞內(nèi)Fe2+相對(duì)水平比較；B：不同處理下，H1299 和PC9細(xì)胞內(nèi)MDA 相對(duì)水平比較）

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)p-mTOR、GPX4 蛋白表達(dá)的比較 相比對(duì)照組，EVE 組、RSL3 組及EVE+RSL3 組細(xì)胞內(nèi)pmTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.01），其中EVE+RSL3 組p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量均最低，見(jiàn)圖3A-B。相比對(duì)照組，EVE 組、RSL3 組和EVE+RSL3 組細(xì)胞內(nèi)GPX4 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），其中，EVE+RSL3 組GPX4 蛋白表達(dá)水平均最低，見(jiàn)圖3C-D。

3 討論

鐵死亡是一種在發(fā)生機(jī)制上與細(xì)胞凋亡顯著不同的程序性細(xì)胞死亡，大量研究已經(jīng)報(bào)道RSL3 能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[13]，但并非所有細(xì)胞對(duì)RSL3 敏感，可能與細(xì)胞內(nèi)GPX4 表達(dá)量及腫瘤類型有關(guān)[5]。不同肺腺癌細(xì)胞對(duì)RSL3 的敏感性差別較大，中位抑制濃度值從幾百nmol 到幾十μmol 不等，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）/mTORC1 通路激活的癌細(xì)胞不易被RSL3 誘導(dǎo)發(fā)生鐵死亡，而抑制PI3K/Akt/mTORC1 通路后可恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性[10]。EVE 作為一種mTORC1 抑制劑，單藥治療肺癌時(shí)效果甚微，但聯(lián)合用藥能夠提高其在肺癌中的療效及限制藥物不良反應(yīng)[14-16]。在本研究中，不同濃度EVE 對(duì)H1299 及PC9 細(xì)胞增殖無(wú)影響，EVE 聯(lián)合RSL3 處理后細(xì)胞存活率較單用RSL3 顯著降低，使用鐵抑制素后，EVE 聯(lián)合RSL3 處理導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降被顯著逆轉(zhuǎn)，相比RLS3 單獨(dú)處理，EVE聯(lián)合RSL3 處理后的細(xì)胞內(nèi)Fe2+及MDA 相對(duì)水平升高程度十分明顯。表明EVE 聯(lián)合RSL3 可通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

GPX4-谷胱甘肽（glutathione，GSH）抗氧化系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)最主要的鐵死亡防御系統(tǒng)，GPX4 可將過(guò)氧化物還原為相應(yīng)的醇，從而限制鐵依賴的有毒自由基，抑制脂質(zhì)ROS 的生成[17]。因此，抑制GPX4 的活性及促進(jìn)GPX4 的降解均有可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，Gaschler 等[18]報(bào)道1,2-二氧戊環(huán)（FINO2）可通過(guò)GPX4失活和鐵氧化引發(fā)鐵死亡，小白菊內(nèi)酯衍生物DMOCPTL 主要通過(guò)促進(jìn)GPX4 的泛素化降解誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵死亡[19]，蟾蜍他靈通過(guò)促進(jìn)GPX4 的泛素化并降解誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞鐵死亡[20]。而PI3K/Akt/mTORC1 通路活化可增強(qiáng)下游真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的合成，4EBP1 進(jìn)一步與GPX4 的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄翻譯。因此，抑制mTORC1 可導(dǎo)致GPX4 蛋白表達(dá)水平下調(diào)[11]。EVE 是有效的mTORC1 抑制劑，本研究中，EVE 可抑制兩種肺腺癌細(xì)胞內(nèi)p-mTOR 蛋白表達(dá)，亦可抑制H1299 細(xì)胞內(nèi)GPX4 蛋白表達(dá)，RSL3 可抑制兩種細(xì)胞內(nèi)p-mTOR及GPX4 蛋白表達(dá)，兩者聯(lián)合處理后細(xì)胞內(nèi)p-mTOR及GPX4 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，提示EVE 可能通過(guò)mTOR/GPX4 途徑增強(qiáng)RSL3 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞鐵死亡。綜上所述，本研究認(rèn)為EVE 可增強(qiáng)RSL3 作用，誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞鐵死亡，其機(jī)制可能與抑制mTOR/GPX4通路有關(guān)。本研究可能為通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡治療肺腺癌提供新的見(jiàn)解。