ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎甲氨蝶呤治療耐藥關(guān)系的研究進(jìn)展

張倩 呂天琦 黃華 聞欽文 鄔秀娣 鄭建萍

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病，主要特征是手部、足部等小關(guān)節(jié)的對(duì)稱性疼痛和腫脹，長(zhǎng)期慢性炎癥控制不當(dāng)時(shí)，會(huì)造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)的損傷。目前，RA 患病率占世界總?cè)丝跀?shù)的0.5%～1.0%[1]。RA 患病情況存在明顯的性別差異，女性患病概率是男性的2～3 倍[2]。RA 致殘率與病程有關(guān)，中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎2019 年年度報(bào)告顯示，患者病程＞15 年，致殘率達(dá)61.25%[3]。目前治療RA 的方式可分為西醫(yī)治療和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療，西醫(yī)治療常用藥物為非甾體抗炎藥、傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物、生物免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素等[4]。自20 世紀(jì)80年代以來(lái)，甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）一直作為治療RA 的首選錨定藥物。2019 年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（European league against rheumatism，EULAR）推薦早期RA 患者使用MTX 單一療法，中度或重度疾病活動(dòng)度患者推薦MTX 聯(lián)合其他抗風(fēng)濕藥物（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）進(jìn)行治療[5]，但仍有約50%的RA 患者對(duì)MTX 治療效果不佳或復(fù)發(fā)后再次用藥治療應(yīng)答不充分，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[6]。研究認(rèn)為可以從基因多態(tài)性、蛋白質(zhì)功能表達(dá)、細(xì)胞因子水平、信號(hào)通路等多種途徑來(lái)探究MTX 耐藥機(jī)制。ATP 結(jié)合盒式（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)了MTX 耐藥過(guò)程，在體內(nèi)藥物的吸收、分布、代謝和排泄中發(fā)揮重要作用。本文就ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與MTX 治療RA 過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥關(guān)系展開(kāi)綜述，以期找到可預(yù)測(cè)MTX 應(yīng)答不佳的標(biāo)志物，為闡明MTX 耐藥機(jī)制提供參考。

1 MTX 治療RA 的作用機(jī)制

MTX 是一種葉酸抑制劑，其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)與葉酸相似，因此可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR），使葉酸不能還原成二氫葉酸及四氫葉酸，從而阻滯核苷酸的合成代謝，最終抑制DNA 合成。可見(jiàn)MTX 在機(jī)體中起到抗炎和抗增殖的作用。小劑量服用MTX（5～25 mg/周）治療RA的臨床效果良好[7]。MTX 治療RA 的作用機(jī)制復(fù)雜，其確切機(jī)制尚不清楚，多種因素共同作用來(lái)達(dá)到治療效果是目前被廣為認(rèn)可的觀點(diǎn)。研究認(rèn)為MTX 治療效果與腺苷（adenosine，ADO）抗炎作用、葉酸拮抗作用、多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（MTX polyglutamates，MTXPG）水平和DHFR 活性等多個(gè)因素有關(guān)[8]。

1.1 MTX 與ADO 腺苷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前解釋MTX 在RA 中療效機(jī)制的主要假說(shuō)。ADO 是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性嘌呤核苷酸，主要通過(guò)細(xì)胞膜表面的腺苷受體（adenosine receptors，AR）來(lái)調(diào)節(jié)抗炎作用，是重要的炎癥抑制因子。MTX 可阻斷5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶（5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase，ATIC），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷水平增加，腺苷脫氨酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ADO 濃度增加[9]，見(jiàn)圖1。當(dāng)ADO 與胞外AR 結(jié)合時(shí)，細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，MTX 對(duì)機(jī)體的抗炎作用得以發(fā)揮。目前已在不同組織中克隆并鑒定出4 種AR 亞型：腺苷受體A1（adenosine A1 receptor，ADORA1）、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3。Singh 等[10]收集100例符合EULAR 標(biāo)準(zhǔn)的RA 患者樣本，相較于療效良好和中度反應(yīng)的患者，MTX 治療無(wú)應(yīng)答患者組中ADORA3 水平較低。對(duì)參與ADO 產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，ATP 酶基因rs112734 位點(diǎn)CC 基因型和ATIC 基因rs2372536 位點(diǎn)GG 基因型可能與MTX療效有關(guān)[11]。MTX 通過(guò)提高RA 患者細(xì)胞外ADO 水平來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，而AR 的低表達(dá)導(dǎo)致RA 患者對(duì)MTX 的治療反應(yīng)欠佳。

圖1 MTX 對(duì)RA 患者腺苷的影響機(jī)制

1.2 MTX 與活性氧（reactive oxygen species，ROS） RA患者滑膜液中浸潤(rùn)著大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，激活的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可釋放細(xì)胞炎癥介質(zhì)[12]，如ROS、氮類物質(zhì)及其他蛋白酶。此類物質(zhì)的釋放導(dǎo)致機(jī)體炎癥水平增高，嚴(yán)重?fù)p傷患者關(guān)節(jié)軟骨和骨骼。Kaundal 等[13]發(fā)現(xiàn)，基線期RA 患者外周血中性粒細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生顯著高于健康對(duì)照組，MTX治療后RA 患者ROS 產(chǎn)生明顯減少，由此推測(cè)這可能是MTX 治療RA 的作用機(jī)制之一。

2 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

2.1 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白概述 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)多種ATP 驅(qū)動(dòng)的膜上分子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，使底物分子逆濃度泵出細(xì)胞外。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核心結(jié)構(gòu)是兩個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域（nucleotide-binding domains，NBD）和兩個(gè)跨膜結(jié)合區(qū)域（transmembrane domains，TMD）[14]。前者位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)且具有ATP結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)結(jié)合ATP 水解產(chǎn)生的能量改變NBD蛋白的構(gòu)象。后者一般含12～20 個(gè)跨膜α 螺旋，是在細(xì)胞膜內(nèi)形成識(shí)別并介導(dǎo)底物穿過(guò)細(xì)胞膜的機(jī)械性通道[15]。

2.2 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制 有學(xué)者認(rèn)為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是通過(guò)“交替開(kāi)放”“ATP 開(kāi)關(guān)”“順序結(jié)合”和“恒定接觸”等幾種模型的混合方式來(lái)進(jìn)行底物轉(zhuǎn)運(yùn)的[16]。ABC 家族的轉(zhuǎn)運(yùn)功能分為內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)和外向轉(zhuǎn)運(yùn)兩種方式。內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為向內(nèi)構(gòu)象，此時(shí)NBD 在TMD 的帶動(dòng)下處于開(kāi)放狀態(tài)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合底物后再與TMD 結(jié)合，NBD 結(jié)合ATP 形成NBD 二聚體，從而使TMD 轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀蜷_(kāi)放的構(gòu)象。隨著ATP 水解和NBD 二聚體結(jié)構(gòu)打開(kāi)，底物釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。外向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，轉(zhuǎn)運(yùn)初始NBD 處于開(kāi)放狀態(tài)，轉(zhuǎn)運(yùn)從底物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合開(kāi)始。ATP與NBD 結(jié)合使其關(guān)閉，底物被釋放進(jìn)入TMD 腔內(nèi)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)象改變并將底物最終釋放至細(xì)胞外，見(jiàn)圖2。人類基因組中的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有48 個(gè)成員，按照蛋白質(zhì)的線性序列可分為8 個(gè)亞家族，即ABCA～ABCG 和ANSA，其中ABCB、ABCC 和ABCG 等亞家族與耐藥密切相關(guān)[17]。

圖2 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型圖

3 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與MTX 耐藥的關(guān)系

3.1 ABCB 亞家族 ABCB 亞家族中的第1 位成員為ABCB1，是編碼一種長(zhǎng)度為1 280 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），又稱多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance-1，MDR1）。研究發(fā)現(xiàn)RA中MTX 耐藥與P-gp 表達(dá)有關(guān)。姚血明等[18]發(fā)現(xiàn)MTX耐藥患者組外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中MDR1 mRNA 水平顯著增加，P-gp表達(dá)和外排能力均增強(qiáng)。王佳等[19]利用體外攜帶MDR1 的重組腺病毒感染RA 患者成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDR1 基因高表達(dá)并通過(guò)上調(diào)P-gp 表達(dá)水平來(lái)影響FLS 對(duì)MTX的外排能力，引起MTX 的耐藥性。Liu 等[20]發(fā)現(xiàn)難治性RA 患者FLS 中P-gp 表達(dá)水平與MTX 治療持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，異常的P-gp 水平可能與MTX 耐藥性的發(fā)展有關(guān)。上述分析顯示P-gp 表達(dá)水平的變化可能預(yù)示著MTX 的治療反應(yīng)，可作為判斷MTX 藥物敏感性的指標(biāo)之一。研究證實(shí)MTX 耐藥的RA 患者淋巴細(xì)胞和FLS 中過(guò)度表達(dá)P-gp，而Janus 激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路與P-gp 的產(chǎn)生密切相關(guān)。Qin 等[21]體外培養(yǎng)RA-FLS，結(jié)果顯示單用MTX 可顯著誘導(dǎo)RA-FLS P-gp 的表達(dá)。使用酪氨酸磷酸化抑制劑AG490 抑制JAK2/STAT3，其中MTX+4-氫過(guò)氧環(huán)磷酰胺（4-hydroperoxy cyclophosphamide，4-HC）組P-gp 表達(dá)和mRNA 水平降低，提示JAK2/STAT3 通路參與MTX+4-HC 誘導(dǎo)的P-gp 表達(dá)。

RA 疾病中對(duì)于MDR1 基因多態(tài)性的研究主要集中在C3435T 位點(diǎn)上。Muralidharan 等[22]發(fā)現(xiàn)印度南部地區(qū)RA 患者中MDR1 的C3435T 位點(diǎn)與MTX 治療臨床效果有關(guān)，疾病活動(dòng)性高的患者中突變型T 等位基因頻率明顯高于中低度活動(dòng)度疾病患者。Melikoglu 等[23]的最新研究發(fā)現(xiàn)MTX 無(wú)應(yīng)答患者組幾乎都表現(xiàn)為C3435T 雜合性，與MTX 應(yīng)答組有顯著差異。C3435T位點(diǎn)突變導(dǎo)致MDR1 編碼的P-gp 對(duì)某些底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力也發(fā)生改變，因此與疾病活動(dòng)程度或MTX 治療反應(yīng)相關(guān)。

3.2 ABCC 亞家族 ABCC 亞家族有12 個(gè)成員，其中ABCC1 編碼產(chǎn)物為多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance protein，MRP）1。MRP1 是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中第2 個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員[24]，位于人類第16 號(hào)染色體長(zhǎng)臂13.1 帶，由1 531 個(gè)氨基酸組成，分子量為190 kDa，在人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞上均有表達(dá)。MRP1 在MTX 作用于RA 的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，MTX 由還原性葉酸載體經(jīng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入細(xì)胞并被MRP1 等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泵出細(xì)胞外。梁潔等[25]發(fā)現(xiàn)在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型中MRP1 表達(dá)呈陽(yáng)性且與滑膜病變嚴(yán)重程度相關(guān)。Hider 等[26]的縱向檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MTX 治療早期RA 可誘導(dǎo)MRP1 水平下降，相對(duì)于反應(yīng)不佳患者，MTX 治療良好患者M(jìn)RP1 的表達(dá)水平更低。綜上研究表明疾病活動(dòng)程度可能會(huì)影響免疫效應(yīng)細(xì)胞中MRP1 的表達(dá)水平。MRP1 過(guò)度表達(dá)使其外排能力增強(qiáng)，從而降低細(xì)胞內(nèi)MTX 濃度，還可能改變細(xì)胞內(nèi)藥物分布，致使藥物分布于胞質(zhì)囊或核周高爾基樣區(qū)域。

Th17 細(xì)胞亞群在RA 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起介導(dǎo)作用，其分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22 等，有較強(qiáng)的促炎癥作用，會(huì)加重患者關(guān)節(jié)炎癥[27]。MTX 主要作用機(jī)制之一是能夠抑制細(xì)胞增殖和組胺等炎癥介質(zhì)的反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)揮強(qiáng)抗炎作用。Abderrazak 等[27]發(fā)現(xiàn)極化Th17 細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)ABCC1，RA 患者滑膜中豐富的膠原蛋白及其受體整合素α2β1 增強(qiáng)了Th 細(xì)胞中ABCC1的表達(dá)和功能，通過(guò)上調(diào)ABCC1 的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)極化Th細(xì)胞抵抗MTX 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Th17 細(xì)胞對(duì)MTX 的耐藥性，推測(cè)ABCC1 可能與RA 中觀察到的MTX 耐藥性相關(guān)。

3.3 ABCG 亞家族 ABCG2 又稱乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），是繼P-gp 和MRP1 之后發(fā)現(xiàn)的第3 個(gè)外排耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[28]。BCRP分子量為72 kDa，只有1 個(gè)NBD 和1 個(gè)6 次TMD，因此BCRP 也被稱為半分子轉(zhuǎn)運(yùn)體。BCRP 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與Pgp 不同，主要通過(guò)二硫鍵組成同源二聚體或同源多聚體的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能，在胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞、腸上皮、腎近端小管細(xì)胞和大腦組織中高度表達(dá)[29]。MTX是BCRP 的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，介導(dǎo)MTX 外排泵出細(xì)胞。van der Heijden 等[30]在RA 患者滑膜下層內(nèi)膜層、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上均檢測(cè)到BCRP 的表達(dá)，且顯著高于健康對(duì)照組。MTX 治療無(wú)應(yīng)答患者組BCRP 陽(yáng)性細(xì)胞中位數(shù)顯著高于應(yīng)答良好患者。Yu 等[31]發(fā)現(xiàn)黃芩可以激活BCRP 介導(dǎo)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，在人BCRP 基因轉(zhuǎn)染的馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞系模型中，黃芩激活了BCRP 介導(dǎo)MTX 向腸腔的外排，還可能會(huì)增加MTX 的全身暴露和平均滯留時(shí)間。嘌呤能受體拮抗劑AZD9056 和柳氮磺胺吡啶已被證實(shí)是BCRP 的抑制劑，也是MTX和RA 的候選藥物，Elsby 等[32]發(fā)現(xiàn)采用MTX 聯(lián)合AZD9056 或柳氮磺胺吡啶治療RA 時(shí)，MTX 臨床療效提高。推測(cè)AZD9056 以濃度依賴性的方式抑制了BCRP 轉(zhuǎn)運(yùn)MTX 的能力，柳氮磺胺吡啶則通過(guò)抑制BCRP 對(duì)MTX 的吸收，導(dǎo)致治療靶點(diǎn)內(nèi)MTX 濃度升高?？梢?jiàn)BCRP 通過(guò)輸出MTX 及其二谷氨酸和三聚氰酸代謝物，導(dǎo)致MTX 療效降低。

ABCG2 基因多態(tài)性與RA 患者對(duì)MTX 臨床反應(yīng)之間相關(guān)性的研究愈發(fā)廣泛。Muto 等[33]發(fā)現(xiàn)ABCG2 基因表達(dá)水平在MTX 反應(yīng)良好患者中顯著降低。ABCG2基因中研究最多的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是rs2231142 和rs13120400。Lima等[34]研究了233 例RA 患者23 個(gè)SNPs 的基因分型后發(fā)現(xiàn)，rs2231142 中第421 位的C 核苷酸被A 取代，導(dǎo)致ABCG2 轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失，是影響MTX 治療效果的原因。而rs2231142（AC）等位基因突變，則導(dǎo)致了MTX 細(xì)胞內(nèi)活性代謝產(chǎn)物MTX-PG 含量增加[35]。MTX-PG 與MTX 抗炎機(jī)制密切相關(guān)，MTX 主要通過(guò)MTX-PG 發(fā)揮作用。Dervieux 等[36]發(fā)現(xiàn)MTX-PG 濃度增加與較好的MTX 臨床療效有關(guān)。D'Cruz 等[37]檢測(cè)活動(dòng)期RA 患者血漿中MTX 和其主要代謝產(chǎn)物7-羥基甲氨蝶呤（7-hydroxy methotrexate，7-OH-MTX）的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs2231142 GT 基因型受試者WBC 顯著偏低，血漿中7-OH-MTX 水平明顯降低，而7-OH-MTX 水平降低可能意味著MTX 臨床療效增加。ABCG2 基因相關(guān)SNPs 位點(diǎn)的研究進(jìn)一步表明其與MTX應(yīng)答反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)，為更好地實(shí)現(xiàn)MTX個(gè)性化治療提供了新的研究方向。

4 小結(jié)

MTX 是治療RA 的錨定藥物，該藥物能夠緩解大多數(shù)RA 患者的臨床表現(xiàn)，降低RA 患者炎癥水平和疾病活動(dòng)性，并延緩或阻止患者關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕發(fā)生。MTX 作為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，介導(dǎo)了MTX 的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程。主要多藥耐藥蛋白P-gp、MRP 和BCRP 分別通過(guò)不同的作用機(jī)制介導(dǎo)MTX 耐藥的產(chǎn)生，驗(yàn)證并闡明ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在RA 患者中MTX 耐藥的具體作用，有利于清晰展示MTX 耐藥機(jī)制。今后可在更大的患者隊(duì)列中加以驗(yàn)證，以期在臨床實(shí)踐中對(duì)RA 患者準(zhǔn)確分群，對(duì)患者采用更精準(zhǔn)的治療手段并提高治療效率。