兒童百日咳實驗室診斷的研究進展

馬富艷

百日咳是一種具有高度傳染性的呼吸道急性感染病，臨床多見于兒童，具有病程周期長、易出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥等特點[1]。百日咳疫苗在20 世紀已被納入國家免疫規(guī)劃，在實施計劃免疫后，百日咳的發(fā)病率大幅降低，但近年來多個國家又出現(xiàn)了反彈現(xiàn)象，發(fā)病人數(shù)逐年增加，即“百日咳再現(xiàn)”[2]。一方面，百日咳疫苗的次優(yōu)效應及有限的保護期限被認為是“百日咳再現(xiàn)”的主要原因[3]，另一方面，百日咳鮑特桿菌耐藥性的增加及其抗原成分的改變也可能是百日咳死灰復燃的原因之一[4]。需要注意的是，由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)，百日咳發(fā)病初期癥狀與普通感冒極為相似，且典型病例較少，臨床極易漏診和誤診，導致病情加重，威脅患兒身心健康[5]。因此，采取及時有效的診斷對百日咳后期干預治療和預防具有重要指導意義?；诖耍疚木桶偃湛葘嶒炇以\斷的研究進展作一綜述，總結國內(nèi)外實驗室檢查方法診斷百日咳的優(yōu)缺點，為規(guī)范制定百日咳實驗室診斷標準提供參考。

1 百日咳的病因及臨床癥狀

1.1 病因 百日咳主要由百日咳鮑特桿菌感染引發(fā)[6]。除此之外，副百日咳鮑特菌、支氣管炎鮑特菌和霍氏鮑特菌等也是引起百日咳的主要病菌[6-7]。百日咳鮑特桿菌分泌的“毒力因子”包括百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、百日咳黏著素（pertactin，PRN）、絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）、氣管細胞毒素（trachealcytotoxin，TCT）、凝集原（agglutinogen，AGG）、腺苷酸環(huán)化酶毒素（adenylcyclasetoxin，ACT）、脂多糖內(nèi)毒素（lipopolysacchairide，LPS）和百日咳菌毛蛋白（fimbriae，F(xiàn)im）等。目前PT、PRN、FHA 和AGG 已被作為保護性的抗原成分用于無細胞百日咳疫苗的研制[8-9]，其中PT 為百日咳鮑特菌特有抗原，特異性較其他抗原更高，在百日咳發(fā)病中起關鍵作用[9-10]。研究表明，PT 不僅促進百日咳桿菌黏附于呼吸道纖毛上皮細胞使之變性、壞死，還可使患者淋巴組織中的淋巴細胞擴散到周圍血液及氣管；另外，PT 可抑制中性粒細胞遷移和募集以及使病原體避開抗體介導的清除作用，從而加強了病原體在呼吸道的黏附能力[11]。

1.2 臨床癥狀 百日咳分為卡他期、痙咳期和恢復期3 個階段[12]?？ㄋ冢?～2 周）傳染性最強，與無癥狀的普通感冒類似，出現(xiàn)低熱、咳嗽、打噴嚏、流淚等癥狀，咳嗽開始為單聲的干咳，3～4 d 后熱退，夜晚咳嗽重[13]。痙咳期（2 周～2 個月）的典型標志是陣發(fā)性、痙攣性的咳嗽伴有大量的黏液，發(fā)出雞鳴樣吸氣吼聲，常出現(xiàn)涕淚交流、面色漲紅、唇色發(fā)紺、反射性嘔吐等癥狀。陣咳劇烈時，可出現(xiàn)鼻出血、咯血及眼結膜下出血等，甚至發(fā)生顱內(nèi)出血，經(jīng)常有并發(fā)癥出現(xiàn)，如肺炎、百日咳腦病、肺動脈高壓等[14]?；謴推冢?～3 周）咳嗽發(fā)作次數(shù)減少，程度減輕，不再出現(xiàn)陣發(fā)性痙咳，雞鳴樣吸氣聲消失[15]。青少年和成人多表現(xiàn)為無癥狀，但在患病期間易傳染給兒童。此外，接種百日咳疫苗的兒童并不能完全避免患病，隨著年齡增長，體內(nèi)抗體水平下降，在4～5 歲后較易發(fā)病，但由于疫苗仍存在保護作用，癥狀只有較長時間的咳嗽，很難和普通咳嗽區(qū)分[16]。

2 百日咳的實驗室檢查方法

2.1 外周血常規(guī)和涂片檢查 白細胞和淋巴細胞數(shù)量明顯增高可作為百日咳的診斷標準之一。唐小利等[3]回顧性分析發(fā)現(xiàn)，23 例住院百日咳患兒血常規(guī)檢查WBC 中位值為21.4×109/L，其中有14 例超過20.0×109/L（約60.9%），有3 例（13.0%）超過30.0×109/L；WBC＞25.0×109/L 患兒的住院時長和再次感染概率均高于WBC＜20×109/L 的患兒。外周血淋巴細胞對百日咳也具有重要診斷價值[17]。戎紅輝等[18]分析160 例疑似百日咳患兒的實驗室指標后發(fā)現(xiàn)，確診患兒淋巴細胞百分比顯著高于未確診患兒。王軍等[19]回顧性分析857 例百日咳患兒的臨床資料后發(fā)現(xiàn)，81.9%患者以淋巴細胞增高為主。提示淋巴細胞數(shù)和WBC 增高是重癥百日咳的高危因素?！吨袊鴥和偃湛仍\斷及治療建議》提出對于≤3 月齡患兒，臨床診斷時加上外周血WBC≥20.0×109/L 伴淋巴細胞比例≥60%可確診。但在臨床實踐中，朱慧慧等[20]對124 例≤3 月齡百日咳患兒診斷WBC 發(fā)現(xiàn)僅有52 例（41.94%）符合上述標準，由此提出對于此年齡段的患兒在百日咳診斷時可適當下調(diào)WBC 的閾值。可見雖然血常規(guī)是簡單易行的實驗室檢查，但將外周血常規(guī)作為實驗室確診指標仍有一定局限性，現(xiàn)行診斷標準尚待進一步驗證和完善。

最新研究認為，在外周血涂片中發(fā)現(xiàn)裂隙淋巴細胞可能是簡單、快速的診斷百日咳的方法[21]。陳奕穎等[22]對80 例疑似百日咳患兒進行分組比較發(fā)現(xiàn)，裂隙淋巴細胞陽性的22 例患兒中有21 例確診為百日咳，特異度達97.5%。許秀妝等[21]在52 例百日咳患兒中均觀察到數(shù)量不等的裂隙淋巴細胞，而55 例非百日咳患兒中均未見到，提示外周血裂隙淋巴細胞計數(shù)在早期篩查百日咳中存在重要作用。此外，一項對裂隙細胞及外周血T 淋巴細胞亞群在百日咳患兒中的表達探究發(fā)現(xiàn)，裂隙細胞及外周血T淋巴細胞亞群均與百日咳嚴重程度顯著相關（P＜0.05），可一定程度反映百日咳的嚴重程度，并提示疾病分期[23]。雖然外周血涂片觀察裂隙淋巴細胞診斷方法簡單易行，可以在基層醫(yī)院全面開展，但也存在一定的限制，要求技術人員能夠熟練掌握細胞形態(tài)學。

2.2 細菌培養(yǎng) 細菌培養(yǎng)并分離百日咳鮑特桿菌的特異性高，被WHO 列為實驗室診斷百日咳的標準之一，是百日咳診斷的“金標準”。在嚴重的病例中可見百日咳鮑特桿菌存在于下呼吸道，但其首選的定植地點是上呼吸道，因此鼻咽取樣是最佳方法[24]。呂曦等[25]采集159 例慢性咳嗽患兒鼻咽拭子進行百日咳鮑特菌培養(yǎng)，結果檢測出百日咳患兒39 例；分離病菌菌株并檢測對各類抗生素的敏感性后發(fā)現(xiàn)，阿莫西林可能成為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥菌株感染的備選藥物。同樣地，陳鑫等[26]以96 例確診百日咳患兒為研究對象，經(jīng)細菌培養(yǎng)檢出病原菌119 株，且對青霉素類和頭孢菌素類抗菌藥物敏感性較高。李玥等[27]采用細菌培養(yǎng)方式檢測864 例百日咳患兒的鼻咽拭子標本，檢出百日咳鮑特菌陽性樣本208 例，占送檢患兒總數(shù)的24.1%，特異度為79.0%，高于熒光定量PCR 的59.0%。張喆等[28]采集1 029 例臨床疑診為百日咳的患兒鼻咽拭子，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，百日咳鮑特桿菌有211 例（20.5%）陽性，7 月份的分離率最高，為31.2%，與WHO 調(diào)查報告所展示的月份一致。研究發(fā)現(xiàn)，在患兒已使用抗生素、接種疫苗、既往感染、病程較長或樣本保存運送條件不當?shù)纫蛩赜绊懴拢瑱z出率僅為0～30%[29]。由此可見，細菌培養(yǎng)的檢測方法靈敏度較低，且可能因各實驗室樣本采集、轉運、分離培養(yǎng)、鑒定等諸多環(huán)節(jié)的差異有所不同。此外，由于實驗操作周期較長（3～7 d），目前細菌培養(yǎng)法已很少用于臨床百日咳診斷，但該方法在分離百日咳鮑特菌及藥物敏感性檢測方面仍有重要意義[30]。

2.3 血清學方法

2.3.1 ELISA 法 血清學方法診斷百日咳在歐洲及澳大利亞等地區(qū)和國家已被廣泛使用，ELISA 法是其中最主要的血清學方法[30]。Otsuka 等[31]開發(fā)新型ELISA試劑盒用于測定血清百日咳抗體Vag8-IgM 水平，AUC值高達0.920，較商用抗PT-IgG ELISA 試劑盒診斷準確性更高。de Greeff 等[32]使用ELISA 法確定雙血清和單血清中IgG-PT 的特異性和最佳閾值，結果發(fā)現(xiàn)單血清的AUC 值為0.993，特異度為0.957，而雙血清的AUC值為0.999，特異度為0.992，但由于采集不同時間點的雙份血清比較難，因此單份血清診斷在實際工作中的操作性更強。另外有研究表明，百日咳IgG 血清陽性率和幾何平均濃度水平受年齡和免疫史的影響顯著[33]。目前歐盟建議用ELISA 法檢測出PT 特異性IgG抗體濃度以IU/ml 為單位，以WHO 內(nèi)參血清作為陽性對照。ELISA 法檢測診斷百日咳基層普及率高，操作簡單，檢測時間短，結果準確，但實際應用時需要發(fā)病數(shù)周才能進行診斷。此外，1 年內(nèi)疫苗接種史和感染史所呈現(xiàn)的假陽性也容易造成診斷困難，并且各實驗室間的檢測標準缺乏統(tǒng)一。

2.3.2 IgM、IgA 和IgG 抗體診斷 有研究表明IgM、IgA和IgG 偏低是誘發(fā)百日咳病情加重的獨立危險因素[34]，初次感染百日咳的患兒在第2 周會產(chǎn)生IgM、IgA和IgG 抗體，IgM 抗體會持續(xù)2～3 個月，而IgA 抗體則持續(xù)4～6 個月，IgG 抗體則在6～8 周后達到峰值濃度，直到成年以后仍可被檢測到[35]。史海燕[36]對100 例百日咳疑似病例實行IgM 和IgG 檢測，結果發(fā)現(xiàn)IgG 抗體檢測的陽性率高于IgM 抗體。張玥等[37]檢測了406 份百日咳患兒的抗體指標，亦發(fā)現(xiàn)PT-IgG 抗體檢測的陽性率（12%）高于PT-IgM（7%）。此外，百日咳桿菌核酸（bordetella pertussis-DNA，BP-DNA）檢測與PT-IgG 有顯著差異，與PT-IgM 檢測無差異。因此，在診斷百日咳時，最好結合BP-DNA 檢測結果和百日咳抗體檢測指標，可使診療結果更為可靠。但事實上血清學抗體檢測方法存在不同，而各實驗室間的分析差異往往導致結果相差較大。如劉倩等[38]對669 例百日咳疑似病例進行百日咳PT-IgG 抗體和IgM 抗體檢測，結果發(fā)現(xiàn)IgM 抗體的陽性率為37.52%，顯著高于PT-IgG 陽性率（20.47%），推斷IgM 抗體對百日咳的臨床診斷具有輔助價值；Knuutila 等[39]利用多重橫向流動免疫分析法檢測PT、PRN 和FHA 抗體，結果發(fā)現(xiàn)IgA 和IgM 對急性感染患兒的特異度比IgG 更高?？偟膩碚f，抗體血清學診斷的血液標本更易獲取且標本質(zhì)量有保證，操作簡單快捷，更易于基層實驗室展開篩查診斷工作，但抗原進入后需經(jīng)過一定的潛伏期才會產(chǎn)生IgM 和IgG，因此在診斷早期百日咳時，抗體檢測還存在一定時間限制。

2.3.3 PT、FHA、PRN 和Fim 抗原診斷 PT、FHA 和PRN 抗原是指誘導機體發(fā)生百日咳免疫應答的物質(zhì)，可被T/B 淋巴細胞表面的抗原受體特異性識別和結合。衛(wèi)辰等[40]使用ELISA 法檢測血清學指標時發(fā)現(xiàn)，不同來源的PT、FHA 和PRN 抗原檢測的IgG 抗體結果具有顯著性差異，不具備直接可比性。有研究表明Fim 也可以診斷百日咳。楊柏峰等[41]通過熒光-ELISA法檢測Fim2/3 和PT 中的抗體，結果發(fā)現(xiàn)Fim3 的抗體診斷百日咳陽性率高于PT，由此認為Fim2/3 中抗體的檢測是一種敏感的血清學診斷百日咳的方法。另外，Rajam 等[42]開發(fā)了一種基于微球的多重抗體捕獲技術，可以同時定量PT、PRN、FHA、Fim 2 和Fim 3 等5 種抗原的特異性抗體，在百日咳診斷上具有較好的應用前景。但PT、FHA、PRN 和Fim 抗原診斷對實驗室條件及操作規(guī)范的要求較高，不利于基層醫(yī)院開展。

2.4 核酸檢測 目前常用PCR 法檢測百日咳病原體的核酸，WHO 和美國疾病預防控制中心已將PCR 法列為百日咳實驗室確診方法之一。核酸檢測的PCR法包括傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）和多重PCR。

2.4.1 傳統(tǒng)PCR 傳統(tǒng)PCR 只有1 對引物，主要用于單一致病因子的鑒定。由于PCR 不需要采集活菌即可獲得陽性結果，因此比細菌培養(yǎng)更敏感[43]。然而，傳統(tǒng)PCR 需要進行預處理，易造成實驗交叉污染，檢測準確率不高，因此，已逐漸被qRT-PCR 取代。

2.4.2 qRT-PCR qRT-PCR 已成為國際診斷百日咳的首選方法。李玥等[27]采用qRT-PCR 方式檢測864 例百日咳患兒的鼻咽拭子標本，檢出百日咳陽性樣本數(shù)399 例，占送檢患兒總數(shù)的46.2%，檢測靈敏度（51.5%）高于細菌培養(yǎng)（27.1%）。劉倩等[44]采用qRT-PCR 檢測出百日咳陽性病例94 例，并發(fā)現(xiàn)病程＜14 d 的百日咳疑似病例檢測陽性率最高。此外，汪丙松等[45]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)PCR 檢測出的陽性率與咳嗽時間顯著相關，因此傳統(tǒng)PCR 檢測應在病程早期進行。隨著咳嗽病程的延長，傳統(tǒng)PCR 檢測陽性率逐漸降低。王青等[46]將qRTPCR 和常規(guī)細菌培養(yǎng)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)qRT-PCR 法檢測核酸具有更高的靈敏度和特異度。綜上所述，qRT-PCR 方法靈敏度和特異度高，檢測迅速，但該技術要求嚴格，成本高，在基層醫(yī)院難以開展。

2.4.3 多重PCR 多重PCR 中，反應體系加入兩對及以上的引物，可同時擴增出多個核酸片段，因此可用于多種病原微生物的同時檢測。Tao 等[47]利用FilmArray 多重PCR 技術在140 名疑似百日咳患兒中檢測到35.0%的百日咳鮑特桿菌，32.9%的鼻/腸道病毒和31.4%的呼吸道合胞病毒，表明該方法為百日咳感染患者提供合并感染信息，具有潛在的臨床意義。Martini 等[48]認為以IS481、IS1001、IS1002 和recA 為靶點的多重PCR 可篩選及鑒別百日咳鮑特桿菌與其他鮑特菌屬，表明增加多個靶點可以提高PCR 的靈敏度和特異度，從而更好地區(qū)分不同的鮑特菌屬。此外，多重PCR 對患者樣本的培養(yǎng)也有一定的指導意義。Gao等[49]利用插入IS481 序列IS1001、IS1002 和ptxS1 建立多靶點實時PCR，結果發(fā)現(xiàn)其敏感度和特異度分別為77%和88%，所有IS481Ct＜30 的患者檢測為陽性，IS481Ct≥40 的患者均為陰性，因此建議對IS481Ct值為30～40 的標本進行培養(yǎng)。總的來說，多重PCR 的臨床靈敏度優(yōu)于其他PCR 檢測，但多引物的使用可能降低檢測的靈敏度[12]。

2.5 其他檢測方法 直接熒光抗體試驗（direct fluorescent antibody，DFA）、環(huán)介導等溫擴增技術（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、顆粒凝集試驗和中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞簇集試驗也可用于百日咳的實驗室檢驗。鼻咽標本DFA 測定是早期診斷百日咳的一種簡單低廉的方法，顯微鏡可見百日咳桿菌細胞熒光抗體，但因其特異度和靈敏度均較低，還可能與鼻咽中的其他病原體產(chǎn)生交叉反應，目前已不使用該方法[15]。相比qRT-PCR，LAMP 更為簡單快速，僅需12～30 min 即可完成檢測，其檢測靈敏度與特異度分別為92.59%和98.39%[50]。Sun 等[51]評估LAMP-側向流動生物傳感器（lateral flow biosensor，LFB）測定在百日咳桿菌感染臨床診斷中的可行性，結果發(fā)現(xiàn)LAMP-LFB 和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）測定結果的一致性為98%，可靠性高。顆粒凝集試驗是診斷百日咳感染的有效方法，該方法血清用量少，操作簡單，結果可重復性高，特異度高，便于基層醫(yī)院的開展，但由于凝集顆粒小，凝集終點界限不明顯，判定結果頗為困難[52]，因此已很少使用。百日咳患兒血清中的PT 抗體可以中和PT 的細胞毒性，抑制CHO 細胞簇集現(xiàn)象[53]。在細胞簇集結果的讀取上，Bernardo 等[54]通過xCELLigence 實時細胞分析系統(tǒng)量化細胞增殖和黏附作用，減小了操作誤差。CHO 細胞簇集實驗可以直接評估抗體中和PT 毒性的能力，但該方法需要培養(yǎng)細胞，對實驗室條件和操作規(guī)范要求較高。

3 小結與展望

在中國，臨床醫(yī)生診斷百日咳仍以臨床癥狀為主，缺乏統(tǒng)一的實驗室診斷標準；同時由于典型癥狀并不明顯，臨床漏診和誤診也時常發(fā)生。梳理和分析百日咳診斷的實驗室檢查方法可知，從鼻咽部分泌物中培養(yǎng)分離得到百日咳鮑特桿菌可用于百日咳卡他期的檢測，血清學方法檢測PT-lgG 抗體可提高痙咳期或恢復期的百日咳診斷效能，而核酸PCR 檢測可用于百日咳的各個階段，彌補了血清學難以診斷早期百日咳的缺點。因此，合理使用實驗室檢查方法，充分利用各自優(yōu)勢并相互補充，可降低百日咳臨床的漏診、誤診率，及時準確診斷百日咳。